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一种新的毛细管电泳动态涂层介质在质粒DNA分离中的应用

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一种新的毛细管电泳动态涂层介质在质粒DNA分离中的应用

蛋白质酶解混合物的动态修饰毛细管电泳-质谱联用分析

中国化学会第十三届有机分析与生物分析学术会议

作者：余胜兵冯艾荣周平胡继明武汉大学化学与分子科学学院武汉大学化学与分子科学学院武汉大学化学与分子科学学院武汉大学化学与分子科学学院

＜正＞质粒是一种染色体外的稳定遗传因子,其大小为1-200 kb之间的双链闭合环状的DNA分子, 主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。它可将有用的外源基因通过基因工程的手段送入细胞中进行繁殖和表达,是分子生物学实验中常用的物质。在... 详细信息

＜正＞质粒是一种染色体外的稳定遗传因子,其大小为1-200 kb之间的双链闭合环状的DNA分子, 主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。它可将有用的外源基因通过基因工程的手段送入细胞中进行繁殖和表达,是分子生物学实验中常用的物质。在分子生物学研究过程中,经常要对质粒DNA进行提取和检测工作,以便了解样品是否含有质粒 DNA（包括重组质粒DNA）,判断其分子量大小,区别不同质粒构型等。由于质粒DNA在生物领域中

关键词：质粒毛细管电泳动态涂层聚N-异丙基丙烯酰胺

来源： cnki会议评论

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高等学校化学学报 2004年第7期25卷 1226-1230,MJ02页

作者：王晓燕牟晓盾许云敏杨原王洪海复旦大学化学系复旦大学遗传研究所上海200433

利用羟丙基纤维素溶液动态涂层技术修饰毛细管管壁 ,改善了分离效率 .在不影响质谱检测的条件下 ,将动态涂层毛细管电泳与质谱检测联用 ,有效地提高了对蛋白质的鉴定能力 .将该技术应用于对复杂蛋白质样品的酶解产物的分析鉴定。

关键词：蛋白质酶解混合物鉴定毛细管电泳-质谱联用技术羟丙基纤维素溶液动态涂层

反向电渗流非水毛细管电泳法快速测定微量赤霉素

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色谱 2017年第1期35卷 65-69页

作者：郭振朋王晓瑜陈义中国科学院化学研究所活体分析化学院重点实验室北京100190 中国烟草总公司郑州烟草研究院河南郑州450001 北京分子科学国家实验室北京100190

赤霉素是一类重要的植物激素,是结构相似的弱酸性二萜类化合物。针对毛细管电泳法分离、测定赤霉素速度慢、效率不佳等问题,该文发展了一种可快速测定微量活性赤霉素的非水毛细管电泳-紫外检测法。以聚环氧乙烷动态涂布毛细管,利用正离... 详细信息

赤霉素是一类重要的植物激素,是结构相似的弱酸性二萜类化合物。针对毛细管电泳法分离、测定赤霉素速度慢、效率不佳等问题,该文发展了一种可快速测定微量活性赤霉素的非水毛细管电泳-紫外检测法。以聚环氧乙烷动态涂布毛细管,利用正离子使电渗流反向,将含10 mmol/L醋酸铵的甲醇-水(95∶5,v/v)作为缓冲体系,在0.08%(v/v)醋酸含量下,分离8种内源性赤霉素。结果表明,赤霉素出峰时间的相对标准偏差(RSD)≤2.1%(日内)或≤4.3%(日间),峰面积的RSD≤4.5%(日内)或≤6.9%(日间),检出限(S/N=3)为1.04~2.20 mg/L,相关系数为0.998 2~0.999 3,回收率为87.2%~93.5%。该方法简单、快速、稳定,以含醋酸铵的甲醇水溶液为缓冲体系,预先考虑了质谱测定的需要,可用于实际样品如麦芽中赤霉素的分析,具有一定的应用价值。

关键词：非水毛细管电泳电渗流动态涂层赤霉素

高效毛细管电泳法快速测定乳铁蛋白原料的纯度

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中国乳品工业 2016年第2期44卷 43-46页

作者：刘宇陈伟史玉东李志伟高增丽侯慧敏陈云内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司呼和浩特011500

建立了动态涂层毛细管电泳快速检测乳铁蛋白含量的方法。并运用该方法对不同乳铁蛋白原料的纯度进行了检测。经检测4种乳铁蛋白原料的纯度分别为乳铁蛋白A91.05%,乳铁蛋白B93.62%,乳铁蛋白C94.38%,乳铁蛋白D75.81%;相对标准偏差(RSD)分... 详细信息

建立了动态涂层毛细管电泳快速检测乳铁蛋白含量的方法。并运用该方法对不同乳铁蛋白原料的纯度进行了检测。经检测4种乳铁蛋白原料的纯度分别为乳铁蛋白A91.05%,乳铁蛋白B93.62%,乳铁蛋白C94.38%,乳铁蛋白D75.81%;相对标准偏差(RSD)分别为1.0%,0.8%,1.2%,0.9%。并与供应商所提供的原料纯度进行比较,讨论了造成二者之间略微差异的原因。结果表明,该动态涂层方法能够有效抑制毛细管内壁对乳铁蛋白的吸附,对于乳铁蛋白的检测及纯度的验证十分有效,为此类蛋白的检测提供了一种手段。

关键词：高效毛细管电泳动态涂层乳铁蛋白纯度

基于六氟异丙醇的新型低共熔溶剂在蛋白质纯化与分析中的应用研究

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基于六氟异丙醇的新型低共熔溶剂在蛋白质纯化与分析中的应用研究

作者：王璇璇武汉大学

学位级别：硕士

蛋白质的分离纯化与分离分析一直备受关注,发展高效绿色的蛋白质分离纯化与分离分析方法具有十分重要的意义。低共熔溶剂(deep eutectic solvent,DES)作为新一代的绿色溶剂,具有许多独特的物理化学性质,在蛋白质领域有诸多应用。基于低... 详细信息

蛋白质的分离纯化与分离分析一直备受关注,发展高效绿色的蛋白质分离纯化与分离分析方法具有十分重要的意义。低共熔溶剂(deep eutectic solvent,DES)作为新一代的绿色溶剂,具有许多独特的物理化学性质,在蛋白质领域有诸多应用。基于低共熔溶剂的双水相体系(aqueous two-phase system,ATPS)是一种绿色环保的蛋白质萃取分离方法,然而尚未发现有效的反萃取方法以去除DES、实现蛋白质的高效纯化。毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)是蛋白质分离分析的强大工具,如何高效抑制蛋白质的管壁吸附是需要解决的关键问题。六氟异丙醇(hexafluoroisopropanol,HFIP)是一种性质优越的全氟代醇,可作为氢键给体与季铵盐类形成性能优越的DES(HFIP-DES)。本论文将HFIP-DES与双水相萃取技术和CE动态涂层技术相结合,分别应用于蛋白质的分离纯化与CE分离分析研究。主要内容如下:(1)以HFIP为氢键给体,短链季铵盐为氢键受体,制备HFIP-DES,构建由HFIP-DES与无机盐组成的ATPS。选择分相能力强、萃取效率高的氯化胆碱-HFIP DES作为萃取剂,KHPO作为分相盐,建立蛋白质的双水相萃取方法;并首次提出以水为溶剂的反萃取方法,从DES富集相中进一步分离纯化蛋白质、去除DES。以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)为代表性蛋白质,结合单因素法和响应曲面法,筛选最佳萃取条件和反萃取条件。最佳条件下,BSA的萃取率大于99%,反萃取率大于90%,辅以超滤和冷冻干燥处理,可获得纯度高于91%的BSA产品,且方法已成功应用于实际样品小牛血清中BSA的分离纯化。通过紫外光谱、红外光谱、圆二色谱、活性测定表征经萃取-反萃取制得的蛋白质的结构与活性,7种不同性质的蛋白质(BSA、溶菌酶、牛血红蛋白、卵清蛋白、α-胰凝乳蛋白酶A、胃蛋白酶、谷蛋白)呈现不同的结果:亲水性蛋白质的结构和活性得到保持,疏水性蛋白质的结构和活性发生了改变。结合动态光散射和透射电镜探究了分离纯化机理,结果表明蛋白质可以通过氢键、疏水等相互作用与DES发生团聚,形成DES-蛋白质聚集体,而被萃取于DES富集相。反萃取溶剂水对DES-蛋白质聚集体的破坏作用导致蛋白质被释放,释放出的蛋白质由于在HFIP-DES水溶液中溶解度较低而沉淀析出。(2)以HFIP为氢键给体,阳离子表面活性剂(cation surfactant,CS,包括十烷基、十二烷基、十四烷基、十六烷基三甲基溴化铵)为氢键受体,制备HFIP-CS DES。首次将HFIP-CS DES作为缓冲液添加剂制备毛细管动态涂层,用于6种酸碱蛋白质(α-胰凝乳蛋白酶A、胰蛋白酶、细胞色素C、溶菌酶、BSA、牛血红蛋白)的CE分离分析。研究了DES的组成和浓度、缓冲盐溶液浓度和p H值对DES动态涂层的电渗流调控能力和蛋白质分离能力的影响。在最佳分离条件下,十二烷基、十四烷基、十六烷基三甲基溴化铵与HFIP形成的DES作为添加剂所制备的动态涂层对蛋白质均显示出较高的分离效率(19 000-207 000plates/m)和回收率(91.89%-101.36%),迁移时间重复性良好(RSD≤1.96%),表明HFIP-CS DES动态涂层可以高效地抑制蛋白质的管壁吸附,显著提高CE对蛋白质的分离效能。机理研究结果表明,HFIP-CS DES作为缓冲液添加剂可以形成致密、均匀、稳定的表面活性剂双层涂层,而阳离子表面活性剂与HFIP之间的氢键、静电和疏水相互作用对这一性能优越的双层涂层的形成起着至关重要的作用。

关键词：六氟异丙醇低共熔溶剂双水相体系动态涂层蛋白质

无胶筛分毛细管电泳检测基因突变的方法学研究及其在胃癌中的应用

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无胶筛分毛细管电泳检测基因突变的方法学研究及其在胃癌中的应用

作者：刘圆圆兰州大学

学位级别：硕士

基因突变与肿瘤发生有着较高的相关性,所以探索研究新的、灵敏度高的检测基因突变的方法是相关领域专家共同关注的热点问题,也是交叉学科。目前几乎所有的基因突变检测都是建立于PCR基础之上,操作简便准确率高的基因分析技术限制性片段... 详细信息

基因突变与肿瘤发生有着较高的相关性,所以探索研究新的、灵敏度高的检测基因突变的方法是相关领域专家共同关注的热点问题,也是交叉学科。目前几乎所有的基因突变检测都是建立于PCR基础之上,操作简便准确率高的基因分析技术限制性片段长度多态性(RFLP)常与其结合用于基因突变的检测,但结果往往需要借助电泳技术显示,而传统的平板凝胶电泳分辨率低、分析时间长,不能很好的用于各种长度DNA片段尤其是小片段的多态性分析。随着与高效毛细管电泳技术(CE)联合在分子生物学中的广泛应用,使得RFLP-CE具备了检测灵敏度高、分离度高和检测效率高的特点。建立高效的检测基因突变方法,可为临床肿瘤的准确诊断和预警提供更为科学的技术和方法。本论文以此为目的探索建立了一套适用于RFLP技术的毛细管电泳分析分离体系用于临床胃癌组织基因突变检测,系统考察了毛细管电泳体系中不同筛分介质分离不同大小和范围的DNA片段的能力。本论文共分为三部分,第一部分毛细管电泳在基因突变及多态性分析中的研究背景,第二部分是毛细管无胶筛分电泳中不同筛分介质对DNA分离的方法学研究,第三部分是选择合适的毛细管电泳分离体系联合RFLP检测胃癌组织中p53基因和ras基因点突变,并探讨p53基因和ras基因点突变在胃癌发生的作用和地位。第一部分研究背景介绍,主要综述了胃癌发生相关基因p53和ras基因及异常基因检测方法研究进展,毛细管电泳研究背景主要集中在筛分机理、筛分介质、毛细管涂层技术和其他一些影响电泳的因素以及毛细管电泳在基因突变及多态性分析方面的应用进展等。第二部分毛细管无胶筛分电泳(NGS-CE)中不同筛分介质对DNA分离的方法学研究,目的是通过系统考察不同筛分介质分离不同大小和范围DNA片段的能力,建立一套适用不同大小的基因双链分离体系。首先应用甲基纤维素(MC)为筛分介质并结合本实验室成熟的毛细管共价涂层技术,考察了对pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNAMarker、PBR322/BsuRI DNA Marker和FastRulerDNA Ladder的分离情况,系统研究了MC浓度、温度、分离电压、筛分介质pH等因素对双链DNA分离的影响,结果表明MC是一种良好的筛分介质,能成功分离上述三种不同的DNA片段;其次,应用具有动态涂层能力的分子量相对较小的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷(PEO)为筛分介质在空毛细管柱中考察了对pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker、PBR322/BsuRI DNA Marker和FastRulerDNA Ladder的分离情况,结果表明PVP分离pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker、PBR322/BsuRI DNA Marker的效果不佳,而分离FastRulerDNA Ladder能够获得很高的分离度;PEO能很好的分离pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker和FastRulerDNA Ladder。建立的这一套双链DNA片段分离体系最终可以达到同时分离10bp～600bp的双链DNA,符合RFLP分析基因突变的要求。第三部分应用已经建立的无胶筛分毛细管电泳分离体系与PCR-RFLP技术相结合用于胃癌组织p53基因175位、245位密码子和H-ras、K-ras基因12位密码子突变情况的同时检测。提取了59例胃癌患者及癌旁正常组织的基因组DNA,经测定DNA浓度适中,纯度较好。利用PCR扩增出相应的目的片段,使用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物,排除了PCR产物中离子和引物二聚体对后续研究的干扰,扩增的目的片段中,有的片段较小不能进行纯化。相应的限制性内切酶切割纯化的PCR产物,然后应用毛细管电泳分离体系(筛分介质为2.0%MC,pH8.0,分离电压7.5kV,电泳温度25℃)分析临床59例胃癌患者p53和ras基因扩增产物的限制性片段长度多态性。20min内检测了各个基因不同位点的突变情况。初步建立了快速、高分辨率诊断胃癌的方法。结果显示胃癌的p53基因点突变率为20.51%(8/39),ras基因点突变率为11.11%(5/45)。其中p53基因175位密码子有5例发生突变(5/39,12.82%),245位密码子有3例发生突变(3/39,7.69%),H-ras基因有1例发生突变(1/45,2.22%),K-ms基因有4例发生突变(4/45,8.89%),只有在2例中同时发现p53和ras基因发生突变。经统计学处理,p53基因突变和发生部位无明显相关性,ras基因的突变主要集中在胃体和胃底贲门。p53和ras基因在胃癌和胃癌组织不同病理分型中的突变率结果显示,p53基因突变在部分胃癌的发生中起着较重要的作用,ras基因突变可能在胃癌的发

关键词：无胶筛分毛细管电泳基因突变限制性片段长度多态性动态涂层