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功能化自组装多肽RAD/Dentonin支架对人牙髓干细胞生物学影响

功能化自组装多肽RAD/Dentonin支架对人牙髓干细胞生物学影响

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作者：刘熠娟福建医科大学

学位级别：硕士

在组织再生的研究中,应根据不同组织的生物学特性来寻找符合组织再生的各种要素,尽可能的恢复原有组织的形态结构和功能。牙髓是由髓腔包围的软组织,牙髓组织工程中承载细胞的支架材料,必须具有良好的生物相容性、生物活性和可流动性,... 详细信息

在组织再生的研究中,应根据不同组织的生物学特性来寻找符合组织再生的各种要素,尽可能的恢复原有组织的形态结构和功能。牙髓是由髓腔包围的软组织,牙髓组织工程中承载细胞的支架材料,必须具有良好的生物相容性、生物活性和可流动性,并且支架可简便地进入根管系统,为牙髓的再生创造良好的局部微环境。目的:RADA16-I是一种具有规则的二级构象的离子互补自组装多肽,可以自行组装成稳定而有序的纳米结构。Dentonin是细胞外基质磷酸糖蛋白的功能肽片段,含有RGD和SGDG基序,可促进人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)的黏附和增殖。本实验拟将RADA16-Ⅰ和Dentonin结合,设计一种新型的功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架,期望功能肽片段Dentonin的加入,能提高自组装多肽RADA16-Ⅰ的生物学功能,促进hDPSCs的黏附增殖、迁移,向成牙本质细胞方向分化以及矿化沉积。方法:***的分离和鉴定:实验采用酶消化法结合组织块培养法分离培养hDPSCs;通过免疫荧光染色确定细胞表面波形蛋白和角蛋白的表达,以确定hDPSCs来源;采用CCK-8检测hDPSCs的增殖能力;hDPSCs经成骨、成软骨和成脂诱导后,通过茜素红染色确定hDPSCs的成骨分化能力;阿尔新蓝染色验证hDPSCs的成软骨分化能力;油红O染色验证hDPSCs的成脂分化能力。2.多肽的合成与纯化:多肽通过固相合成法合成,应用质谱分析仪确定多肽的相对分子量,并通过高效液相色谱仪分离、纯化多肽。3.功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架的微观结构检测和表面形貌观察:运用圆二色光谱仪检测多肽溶液的二级结构光谱,并通过Dichro Web对多肽的二级结构进行定量;应用扫描电子显微镜检测水凝胶支架的表面形貌;并通过旋转流变仪检测水凝胶支架的机械力学性能。4.功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架对hDPSCs生物学行为的影响:采用CCK-8法确定hDPSCs在支架上的增殖能力;通过免疫荧光染色观察细胞骨架,以确定hDPSCs的黏附伸展情况;运用激光共聚焦显微镜的Z轴扫描,观察Calcein-AM荧光染色的hDPSCs在水凝胶支架中的迁移能力;并通过活/死细胞检测试剂确定细胞在支架上的活细胞和死细胞的比例,以确定支架的生物相容性。5.功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架对hDPSCs向成骨或成牙本质分化的影响:应用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色确定细胞早期成骨分化的能力,并通过ALP活性检测定量验证;运用实时荧光定量聚合酶链反应(realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)实验,确定支架上hDPSCs的成骨、成牙本质分化相关基因,如runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)和ALP的表达水平;成骨诱导后,通过茜素红染色检测支架对hDPSCs矿化沉积能力的影响。结果:1.人牙髓干细胞的分离和鉴定:实验成功的分离出hDPSCs,hDPSCs呈现出典型的成纤维细胞样形态。免疫荧光染色显示hDPSCs表达波形蛋白,而不表达角蛋白,表明hDPSCs来源于间充质。多向分化诱导染色实验表明hDPSCs可以向成骨、成软骨以及成脂向分化,表明本实验所得hDPSCs具有多向分化潜能。2.功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架的微观结构和表面形貌:圆二色光谱检测发现多肽溶液呈现出典型的β-折叠结构光谱,Dichro Web定量分析二级结构,表明多肽溶液的二级结构以β-折叠为主。扫描电子显微镜可观察到干燥后的水凝胶形貌呈现出网状结构的纳米纤维。旋转流变仪检测显示1%(w/v)多肽水凝胶,在～0.01%的应变下维持在线性黏弹区,扫描频率为0.1-10 rad/s的过程中,多肽都维持在凝胶状,具有一定的机械强度。3.功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架对hDPSCs生物学行为的影响:免疫荧光染色表明hDPSCs在支架上可以充分地黏附和伸展;CCK-8法发现hDPSCs在支架上具有较好的增殖活力;细胞迁移实验表明hDPSCs能从支架的表面迁移至水凝胶内部生长;活/死细胞荧光检测表明支架具有良好的生物相容性。以上结果表明功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架在生物学功能上具有显著的优越性。4.功能化自组装多肽

关键词：功能化自组装多肽牙髓再生水凝胶支架成牙本质分化

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Sa12b修饰的功能化自组装多肽水凝胶材料缓解兔椎间盘退变的实验研究

Sa12b修饰的功能化自组装多肽水凝胶材料缓解兔椎间盘退变的实验...

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作者：陈浩宇安徽医科大学

学位级别：硕士

背景:腰痛是临床上最常见的一种疾患。腰痛给社会经济和医疗带来严重负担。虽然引起腰痛的病因有很多,但椎间盘退变(intervertebral discdegeneration,IDD)是其中最重要的因素之一。目前IDD的治疗主要可分为两大类,即为保守治疗和手术... 详细信息

背景:腰痛是临床上最常见的一种疾患。腰痛给社会经济和医疗带来严重负担。虽然引起腰痛的病因有很多,但椎间盘退变(intervertebral discdegeneration,IDD)是其中最重要的因素之一。目前IDD的治疗主要可分为两大类,即为保守治疗和手术治疗。保守治疗主要包括卧床休息、药物治疗和物理治疗等,主要针对轻症患者急性期症状的缓解,因未处理受压部位,病情常反复迁延;手术治疗可分为开放手术治疗和微创手术治疗,主要针对病程长,症状重的患者,利用手术对其受压部位进行减压以缓解症状。其中减压融合手术是目前比较常用的手术方法。手术虽可解除症状,但有学者发现,长期随访会伴有相邻节段的退变,称为邻椎病。无论是保守治疗还是手术治疗,都无法对椎间盘退变的根本原因进行处理。因此,如何从根本上缓解甚至逆转椎间盘退变是IDD治疗的一个新的方向。近年来,组织工程得到大力推进。组织工程髓核可有效的将细胞因子、种子细胞和生物材料有机结合,不仅可以为种子细胞提供细胞外基质样的三维培养环境,还可以通过细胞因子提高种子细胞生物学活性,从而展现出巨大的应用潜能。RADA16-I(AcN-RADARADARADARADA-CNH)作为一种重要的自组装多肽纳米纤维支架材料,可以通过在其C末端连接具有不同生物学特性的短功能片段,从而构建出具有组织特异性的新型“功能化自组装多肽纳米纤维支架材料”。这种新型生物支架材料与细胞因子的短功能片段有机结合后,不仅具有细胞因子的生物学效应,而且克服了细胞因子半衰期短的缺点,起到缓释作用。退变椎间盘内微环境发生恶劣变化,以低氧、低PH和高渗为主要变化,其中以低PH对细胞的抑制最为显著。从独居黄蜂毒液中萃取的短肽 Sa12b(EDVDHVFLRF)作为酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)的一种新型阻滞剂,本课题组前期将Sa12b构建至RADA16-Ⅰ的C末端,体外将其与RADA16-Ⅰ等比例混合形成水凝胶支架材料RAD/SA1。前期研究表明,RAD/SA1在体外具有良好的生物相容性,并且在体外酸环境中可以显著促进人髓核间充质干细胞(human nucleus pulposus mesenchymal stem cells,hNPMSCs)中蛋白多糖、Ⅱ型胶原和SOX9的合成;有研究表明,两种不同组织特异性的功能化自组装多肽纳米纤维支架材料混合后可起到协同作用。为进一步探究RAD/SA1在延缓椎间盘退变中的能力,本研究将RAD/SA1及其与另一种功能化自组装多肽RAD/KPS的混合物RAD/KPS/SA1联合髓核间充质干细胞注入椎间盘退变模型中,检测其修复效果,为其进一步应用提供依据。目的:1.构建兔椎间盘退变模型2.通过实验观察RAD/SA1在延缓椎间盘退变中的作用3.观察RAD/SA1和RAD/KPS是否具有协同作用方法:1.兔椎间盘穿刺退变模型构建选取新西兰白兔5只,进行磁共振(MRI)及X线检查,确保脊柱无明显畸形,椎间盘无明显退变。通过穿刺制备椎间盘退变模型,每只兔选择5个椎间盘(L2/3、L3/4、L4/5、L5/6、L6/7)。在穿刺后2周、穿刺后4周进行MRI和X线摄片,观察椎间盘退变情况。2.组织工程髓核缓解兔椎间盘退变选取新西兰白兔30只,进行磁共振(MRI)及X线检查,确保脊柱无明显畸形,椎间盘无明显退变。通过穿刺制备椎间盘退变模型,每只兔选择5个椎间盘(L2/3、L3/4、L4/5、L5/6、L6/7)。在穿刺后4周时行MRI和X线摄片,确保造模后各椎间盘退变均一,如果有造模不成功的情况,则将该兔排除出实验。将同一只兔的不同退变椎间盘分别编入L2/3(PBS组)、L3/4(Sa12b组)、L4/5(RADA16-I组)、L5/6(RAD/SA1 组)、L6/7(RAD/SA1/KPS 组)5 个组。每组均注入 50μL 含1x105NPMSCs的不同组织工程髓核材料。在穿刺后8周、12周和16周进行MRI和X线摄片,观察影像学改变;根据不同时间节点的组织学切片观察各组椎间盘的组织学形态;免疫印迹法观察不同椎间盘蛋白的合成;qRT-PCR检测不同椎间盘目的基因mRNA的表达情况。结果:1.兔椎间盘穿刺退变模型:兔腰椎MRI显示,对照组椎间盘信号稳定,T2加权像呈均匀高信号表现。穿刺组椎间盘随时间进展信号进行性降低。同时段各穿刺组之间RGI值无统计学意义(p>0.05),说明退变水平一致。X线及%DHI表明随时间推移,椎间盘高度进行性下降,同时间各穿刺椎间盘均一性良好。2.组织工程髓核延缓椎间盘退变:X线发现RAD/SA1组和RAD/SA1/KPS组的%DHI随时间逐渐下降,但在8、12和16周时高于PBS组、Sa12b组和RADA16-Ⅰ组。MRI影像学发现在治

关键词：椎间盘退变组织工程 Sa12b 功能化自组装多肽

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功能化自组装多肽水凝胶在延缓犬椎间盘退变中的作用

功能化自组装多肽水凝胶在延缓犬椎间盘退变中的作用

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作者：苏凌浩南方医科大学

学位级别：硕士

背景当今社会,许多患者都饱受下腰痛的困扰。下腰痛不但降低患者生活质量,使患者丧失劳动能力,也过多消耗着有限的医疗经济资源。研究表明,椎间盘退变(intervertebraldiscdegeneration,IDD)是造成下腰痛的主要原因之一。目前治疗腰椎间... 详细信息

背景当今社会,许多患者都饱受下腰痛的困扰。下腰痛不但降低患者生活质量,使患者丧失劳动能力,也过多消耗着有限的医疗经济资源。研究表明,椎间盘退变(intervertebraldiscdegeneration,IDD)是造成下腰痛的主要原因之一。目前治疗腰椎间盘退变的主要方法分为保守治疗和手术治疗两种。然而,以药物理疗为主的保守治疗只能减轻患者疼痛,无法阻止椎间盘的退变进程;作为保守治疗无效后的首选治疗手段,手术治疗的疗效虽较为持久,但术后复发及相邻阶段退变问题使患者备受困扰。通过增强椎间盘内细胞自身修复,延缓椎间盘退变成为医学界关注的热点之一。骨形态发生蛋白质7(bone morphogenetic protein7,BMP-7)即成骨蛋白-1(osteogenicprotein-1,OP-1),可促进髓核细胞分泌蛋白多糖和II型胶原,还可促进髓核细胞的增殖以及向软骨细胞分化。然而,BMP-7作为生长因子单独使用时,其半衰期较短,需要多次注射才能维持作用,且椎间盘内直接注射BMP-7还存在成骨风险。新型自组装多肽纳米纤维支架材料RADA16-I(AcN-RAD ARAD ARAD ARADA-CNH)可将具有不同功能的生物活性多肽短片段复合在其C端末端,从而提高其生物学活性。本研究前期将具有BMP-7功能的短多肽片段(KPSSAPTQLN)通过化学键方式结合在RADA16-I的C端,从而构建出功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADA-KPSS,再通过将RADA-KPSS与RADA16-I以1:1比例混合,形成新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS。研究表明,RADKPS在体外可明显促进退变髓核细胞中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,且持续时间显著长于单体BMP-7。本课题组前期体外实验证明,RADKPS具有良好的细胞相容性、血液相容性及组织相容性。为进一步探索RADKPS在椎间盘退变中所起到的延缓和修复能力,本研究在低温下将RADKPS注射入椎间盘缺损退变的动物模型中,并检测其修复效果,为未来其临床应用提供实验依据。目的:1.建立犬椎间盘退变的模型。2.通过动物实验观察RADKPS延缓椎间盘退变的作用。方法:1.选取1岁龄健康的杂种犬(10-15 kg),进行X线及核磁共振(MRI)检查对椎间盘整体情况进行评价,筛选出无明显脊柱畸形、椎间盘整体情况良好的16只犬作为实验对象。2.16只成年杂种犬,每只选取4个椎间盘(L3-4、L4-5、L5-6,L6-7)。穿刺制作椎间盘退变模型。L7-S1椎间盘作为正常对照组不作任何处理。3.犬退变椎间盘治疗干预:待椎间盘造模4周后,通过MRI检查测定椎间盘髓核区域以及相对部位脑脊液的灰度值,计算相对灰度值指数(relative gray index,RGI),确认造模后椎间盘相对灰度值RGI比造模前明显下降,且均一良好,保证造模后四组间椎间盘(L3-4、L4-5、L5-6,L6-7)相对灰度值RGI无显著差异(p>0.05)。分组:L6-7 注射 BMP-7,L5-6 注射 RADKPS,L4-5 注射 PBS,L3-4注射不含活性方片段的RADA-16。4.在造模前4周,造模后4周,干预治疗后4周、8周、12周均进行MRI检查测定椎间盘相对灰度值RGI。以干预手术的时间点定位0点,时间依次记录为-4w、0w、4w、8w、12w。在-4w、0w、12w进行X线检测测定椎间盘相对高度指数DHI%。5.组织学检查:在12w,影像学检查结束后采用注射氯胺酮将犬安乐死;将犬的L3至S1脊柱联合周围软组织共同分离;将每一个椎间盘髓核组织给予石蜡包埋切片;分别进行HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色和蛋白多糖免疫组化染色。6.生化成分检测:在12 w,采用注射氯胺酮将犬安乐死。将犬L3至S1脊柱联合周围软组织共同分离;从椎间盘横行切开;分离出髓核组织;通过ELISA蛋白定量检测蛋白多糖及Ⅱ型胶原的含量。结果:1.在-4w时,纳入实验的椎间盘均一性良好,无先天退变。在Ow时,各椎间盘(L3-4、L4-5、L5-6,L6-7)造模成功,均一性退变而正常对照组无退变。在12w时RGI值:正常对照组>RADKPS组>BMP-7组>RADA-16组>PBS 组(P0.05)。2.X线:在-4w、0w和12w时进行X线检测,L3到L7的4个椎间盘高度均有所下降;在12 w时,椎间盘相对高度指数DHI%:正常对照组>RADKPS组>BMP-7 组>RADA-16组>PBS组(P<0.05)。***染色:正常

关键词：椎间盘修复 BMP-7 功能化自组装多肽动物实验

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功能化自组装多肽RAD/Dentonin支架对人牙髓干细胞生物学影响

功能化自组装多肽RAD/Dentonin支架对人牙髓干细胞生物学影响

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2022年中华口腔医学会口腔病理学专业委员会第十六次全...

作者：刘熠娟林雪梅邹璐宁李遥遥葛欣婷伏炜皓吕红兵福建医科大学附属口腔医院

目的:RADA16-I是可以自组装成纳米纤维的离子互补多肽。Dentonin为细胞外基质磷酸糖蛋白的功能肽片段,可促进人牙髓干细胞的黏附和增殖。本实验拟将Dentonin和RADA16-Ⅰ结合,设计新型功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架,期望Dento... 详细信息

目的:RADA16-I是可以自组装成纳米纤维的离子互补多肽。Dentonin为细胞外基质磷酸糖蛋白的功能肽片段,可促进人牙髓干细胞的黏附和增殖。本实验拟将Dentonin和RADA16-Ⅰ结合,设计新型功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架,期望Dentonin的加入能改善RADA16-Ⅰ的生物活性,提高人牙髓干细胞生物学功能。方法:研究通过圆二色光谱、形貌扫描及流变学对RAD/Dentonin的理化性能进行评估。用活/死荧光双染法、免疫荧光染色、CCK-8法和三维重建,检测RAD/Dentonin的生物相容性及细胞的黏附增殖和迁移。此外,应用ALP染色及活性测定、RT-qPCR和茜素红染色检测RAD/Dentonin对人牙髓干细胞成牙本质分化和矿化能力的影响。结果:新型功能化多肽RAD/Dentonin可自组装成基于β-折叠的纳米纤维网络水凝胶。RAD/Dentonin具有良好的生物相容性,且具提高人牙髓干细胞黏附增殖、迁移和成牙本质分化及矿化的能力。结论:新型功能化多肽RAD/Dentonin水凝胶支架是适合干细胞生长的新型支架材料,为设计适用于牙髓再生支架提供了新思路。

关键词：功能化自组装多肽水凝胶支架成牙本质分化

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