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副猪嗜血杆菌aroA基因鉴定及遗传进化分析

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微生物学报 2008年第8期48卷 1100-1103页

作者：薛晓晶徐福洲史爱华张培君陈小玲杨兵王金洛首都师范大学生命科学学院北京100037 北京市农林科学院畜牧兽医研究所北京100097

【目的】细菌aroA基因参与芳香族氨基酸的生物合成,被成功应用于细菌分类和基因失活致弱突变菌株的构建。副猪嗜血杆菌(Hps)是感染猪出现多发性浆膜炎和关节炎的一种病原细菌,鉴定该菌aroA全基因序列将有助于鉴定遗传进化关系和突变分... 详细信息

【目的】细菌aroA基因参与芳香族氨基酸的生物合成,被成功应用于细菌分类和基因失活致弱突变菌株的构建。副猪嗜血杆菌(Hps)是感染猪出现多发性浆膜炎和关节炎的一种病原细菌,鉴定该菌aroA全基因序列将有助于鉴定遗传进化关系和突变分析。【方法】利用PCR和细菌基因组步移技术鉴定Hps的aroA基因序列,进而对不同血清型菌株该基因序列进行鉴定,并与其它革兰氏阴性细菌进行比对和遗传进化分析。【结果】自Hps血清5型基因组DNA中获得包含完整aroA基因的3.7kb基因片段,其中aroA基因全长1314bp,编码产物长度437aa,分子量大小47.9kDa,该基因上游为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。自本试验选择的Hps不同血清型菌株中均可扩增出包含完整aroA基因的1476bp片段,且这些不同血清型菌株间核酸序列同源性在97.7%以上。Hps血清5型aroA基因序列与巴氏杆菌科其它成员核酸序列同源性为70.6%～78.9%,与***和***-murium的同源性分别为66.4%和67.2%。【结论】本试验首次对Hps的15个血清型国际参考菌株及地方分离株aroA全基因序列进行了鉴定,序列比较结果显示aroA基因在革兰氏阴性细菌中具有较高的同源性。aroA基因鉴定对构建基因失活突变菌株以研究Hps生物学特性奠定了基础。

关键词：副猪嗜血杆菌 aroA基因序列分析遗传进化树

副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

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中国农业科学 2023年第8期56卷 1606-1614页

作者：张鹏云陈敏刘明星周红蔺辉星范红结南京农业大学动物医学院

【背景】副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的上呼吸道病原菌，引起格拉瑟氏病，主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病，通常见于5—8周龄的青年猪，发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型，目前主要养猪国家流行的血清型... 详细信息

【背景】副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的上呼吸道病原菌，引起格拉瑟氏病，主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病，通常见于5—8周龄的青年猪，发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型，目前主要养猪国家流行的血清型为4型、5型、12型和13型，是严重危害养猪业发展的主要细菌性病原之一。目前国内还没有检测该菌抗体的商品化试剂盒。【目的】研制一种针对副猪嗜血杆菌的快速、敏感和特异性强的抗体检测试剂盒，为格拉瑟氏病的有效防控提供技术支持。【方法】表达并纯化OppA、DppA、HbpA 3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白，使用副猪嗜血杆菌阴、阳性参考血清筛选以上3种蛋白中免疫反应性和反应特异性好的蛋白。以筛选的蛋白为包被抗原，建立检测HPS抗体的间接ELISA方法，优化间接ELISA反应条件，并组装试剂盒。在此基础上，确定该试剂盒的敏感性、特异性；通过对不同时间、不同猪场采集的2 000份临床猪血清样本进行检测，评价该试剂盒的实用性；在以上临床血清样本中随机选取200份，分别以研制的试剂盒、间接血凝试验以及进口商品化试剂盒进行检测，比较检测结果，验证该试剂盒的符合率；最后，使用研制的试剂盒检测免疫和攻毒猪采集的血清，评价该菌免疫后的抗体消长规律。【结果】成功表达并纯化了OppA、DppA、HbpA 3种蛋白，发现OppA免疫反应性和反应特异性最好。经过反应条件优化，确定OppA包被浓度为1μg·mL-1，封闭液为0.5%的BSA-PBS溶液，样品稀释液为1%的BSA-PBST溶液，样品孵育时间为30min，样品稀释度为1:50，酶标二抗孵育时间为3 0min，底物作用时间为15 min，临界值为0.18；试剂盒的敏感性和特异性为96.67%，能与国内常见血清型HPS阳性血清反应而不与猪其他常见病原阳性血清发生交叉反应；2 000份临床血清样本阳性检出率为34.65%；随机抽取200份血清样本，与间接血凝试验的符合率为92.50%，与进口商品化试剂盒符合率为87.00%，符合率较高；使用试剂盒检测免疫和攻毒后不同时间采集的猪血清，HPS抗体消长规律符合预期。【结论】研制的副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒特异性高、敏感性强，与商品化试剂盒和间接血凝试验的符合率高，可用于临床HPS抗体检测和疫苗免疫效果评价。

关键词：副猪嗜血杆菌 ABC转运体周质底物结合蛋白间接ELISA 免疫评价

副猪嗜血杆菌lpxM基因缺失株构建及生物学特性分析

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中国农业科学 2020年第16期53卷 3394-3403页

作者：杨君楚品品宋帅蔡汝健杨冬霞卞志标勾红潮李艳蒋智勇李春玲闫鹤华南理工大学食品科学与工程学院广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站

【目的】研究副猪嗜血杆菌脂寡糖合成相关基因lpxM对其生长、生物被膜形成能力、抗50%猪血清杀菌能力、对巨噬细胞毒力和抗生素敏感性部分生物特性的影响,为揭示HPS致病机制,lpxM基因缺失疫苗的构建奠定理论基础,为猪场防治HPS进行药物... 详细信息

【目的】研究副猪嗜血杆菌脂寡糖合成相关基因lpxM对其生长、生物被膜形成能力、抗50%猪血清杀菌能力、对巨噬细胞毒力和抗生素敏感性部分生物特性的影响,为揭示HPS致病机制,lpxM基因缺失疫苗的构建奠定理论基础,为猪场防治HPS进行药物选择时提供依据。【方法】以高致病性血清5型HPS地方分离株H45为研究对象,自杀性质粒PK18mobsacB为载体,通过自然转化法将构建好的重组质粒转进H45,使其在抗生素的压力下发生同源重组,最终经过抗生素筛选并通过PCR和测序验证得到lpxM基因缺失株H45-△lpxM,比较两者之间部分生物学特性的差异。测定两者的OD-t关系曲线比较生长情况;用结晶紫染色法比较两者在培养24h后生物被膜形成的能力;测定两者在50%猪血清中存活率,比较两者的抗血清补体杀菌能力;将两者同时刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞,作用时间为6、12和24h,检测细胞培养上清液中LDH的释放量,比较两者对巨噬细胞毒力影响;利用K-B纸片扩散法研究两者对氨苄西林等临床上常用13种抗生素和多粘菌素B抗生素敏感性,通过测定抑菌圈直径来并参照耐药标准判断对抗生素的敏感性。【结果】成功构建lpxM基因缺失株H45-△lpxM,生长情况比较发现菌株生长前期缺失株慢于野生株,8h后保持一致,结果表明lpxM基因缺失能在一定程度上抑制H45的生长;两者均能形成生物被膜,但是缺失株弱于野生株;野生菌株在50%猪血清中存活率为16.1%,而缺失株只有0.71%,缺失株明显低于野生菌株;两者均能引起巨噬细胞的死亡,作用6、12和24h后,野生株对细胞的致死率分别为6.63%、10.86%和22.17%,而缺失株对细胞的致死率为2.62%、6.35%和18.01%,结果表明随着作用时间的延长,两者对细胞的毒力作用越来越大,具有一定的时间依赖性,在各个时间点,缺失株的毒力作用均低于野生株;抗生素敏感性结果发现,两者对头孢噻吩等10种抗生素均表现敏感,对恩诺沙星均表现抗性,但对阿莫西林克拉维酸、磺胺二甲异噁唑和氨苄西林三种抗生素的耐药性发生了较大的差异,阿莫西林克拉维酸和磺胺二甲异噁唑两种抗生素由耐药变成了敏感,氨苄西林也从中介变成敏感,结果表明lpxM基因缺失对H45抗生素敏感性具有一定影响。【结论】lpxM基因缺失能一定程度地抑制HPS生长,降低其生物被膜形成能力、抗血清杀菌能力和对巨噬细胞的毒力作用,增大对临床上多数常用抗生素的敏感性,揭示lpxM基因可能是HPS毒力基因,与HPS的致病能力密切有关,但具体机制还需要进一步研究。

关键词：副猪嗜血杆菌 lpxM基因生物被膜抗血清杀菌细胞毒性抗生素耐药性

副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素的细胞毒性研究

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畜牧兽医学报 2011年第12期42卷 1750-1755页

作者：陈西王湘如徐晓娟郭凤娟陈焕春蔡旭旺华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070

本研究旨在原核表达副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT),并作用于猪髋动脉内皮细胞(Pig iliac endothelial cells,PIEC),以研究其细胞毒性。根据本实验室完成的副猪嗜血杆菌SH 0165株(血清5型)全基因组序列... 详细信息

本研究旨在原核表达副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT),并作用于猪髋动脉内皮细胞(Pig iliac endothelial cells,PIEC),以研究其细胞毒性。根据本实验室完成的副猪嗜血杆菌SH 0165株(血清5型)全基因组序列,针对cdtA、cdtB和cdtC基因序列设计引物,扩增的基因片段大小分别约为681、834和531bp。将靶基因克隆到原核表达载体pET28a中,再转化到*** BL21(DE3),IPTG诱导表达3h,SDS-PAGE和Western blot检测证实表达产物以包涵体形式存在,大小分别约36、34和28ku。通过体外重构毒素与PIEC细胞作用3h,继续培养72h观察细胞形态学变化。结果表明,CdtABC全毒素致PIEC细胞膨胀、空泡形成、细胞凋亡等,而其他试验组变化不显著。结果提示,CDT毒素可能在细菌感染与致病中发挥着重要作用。

关键词：副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素毒素细胞毒性

副猪嗜血杆菌ompP2基因的结构特征及其与毒力的联系

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中国科学：生命科学 2010年第6期40卷 522-532页

作者：赵倩汤承杨发龙邵国青岳华西南民族大学生命科学与技术学院动物医学四川省高校重点实验室成都610041 江苏省农业科学研究院南京210014

副猪嗜血杆菌ompP2基因存在两种结构类型,但其生物学意义人们还不清楚.本实验旨在进一步分析副猪嗜血杆菌ompP2基因的结构特征并研究其与毒力的联系.测序结果表明,与参考菌株血清1,3,6,7,8,9,11型相比,19株临床分离株及血清型2,4,5,10,1... 详细信息

副猪嗜血杆菌ompP2基因存在两种结构类型,但其生物学意义人们还不清楚.本实验旨在进一步分析副猪嗜血杆菌ompP2基因的结构特征并研究其与毒力的联系.测序结果表明,与参考菌株血清1,3,6,7,8,9,11型相比,19株临床分离株及血清型2,4,5,10,12,13,14,15的参考菌株的ompP2基因存在两处连续碱基缺失,分别位于450-524和770-844bp范围内,共计100bp左右,对81株临床分离株的PCR检测进一步证实此结果.序列分析发现,由于碱基的连续缺失导致ompP2基因表面暴露环减少一个,但却使暴露于膜外的抗原决定簇个数增加,并且临床分离株和所有毒力参考菌株中均有一个相同的、无毒菌株所没有的膜表面抗原决定簇VTDQ（K）ALGVGL,提示暴露于膜外的抗原决定簇可能与毒力相关.构建两种基因结构类型的真核表达载体转染Marc145细胞,结果显示碱基缺失的血清5型ompP2基因编码蛋白的细胞毒性显著强于血清11型,首次证明ompP2基因结构特征与毒力的关系.

关键词：副猪嗜血杆菌 ompP2 基因结构特征碱基缺失细胞毒性

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副猪嗜血杆菌Hfq基因缺失株的构建与鉴定

中国兽医科学 2016年第2期46卷 203-209页

作者：任梅渗王印杨泽晓姚学萍曾相杰冷依伊张鹏飞四川农业大学动物医学院四川成都611130 动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川成都611130

为构建副猪嗜血杆菌Hfq基因缺失株,以副猪嗜血杆菌S2261基因组为模板扩增Hfq基因的上、下游同源臂,用融合PCR的方法融合拼接两条同源臂。以Eco RⅠ+HindⅢ分别对融合片段与p K18mobSac B质粒进行双酶切并用T4 DNA连接酶连接以构建同源... 详细信息

为构建副猪嗜血杆菌Hfq基因缺失株,以副猪嗜血杆菌S2261基因组为模板扩增Hfq基因的上、下游同源臂,用融合PCR的方法融合拼接两条同源臂。以Eco RⅠ+HindⅢ分别对融合片段与p K18mobSac B质粒进行双酶切并用T4 DNA连接酶连接以构建同源重组质粒p K18mob Sac B-Hfq-ud。以大肠杆菌S17-1-pir作为供体菌,副猪嗜血杆菌S2261作为受体菌,通过接合转移法成功构建了副猪嗜血杆菌Hfq基因缺失株。绘制了S2261野生株与Hfq缺失株的生长曲线以及测定了LD50,结果显示,相比于S2261野生株,Hfq缺失株在对数期的生长速度下降;S2261野生株与Hfq缺失株的LD50分别为2.9×108与3.16×1010CFU,这说明相比野生株,Hfq缺失株导致小鼠半数死亡所需的剂量显著升高,相对的其毒力则明显下降。药敏试验结果显示,Hfq缺失株对氧氟沙星和诺氟沙星的敏感性明显增加。以上结果说明在副猪嗜血杆菌中,Hfq基因对该菌的生长速度、毒力以及药物敏感性具有调控作用。这为副猪嗜血杆菌Hfq基因功能以及该菌相关的疫苗研究奠定了基础。

关键词：副猪嗜血杆菌 Hfq基因基因缺失接合转移

副猪嗜血杆菌小鼠毒力和仔猪毒力的相关性分析

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畜牧兽医学报 2020年第6期51卷 1408-1418页

作者：李飞跃陈坤鹏丁文文薛云王臣司丽芳赵战勤河南科技大学动物科技学院兽医生物制品工程实验室洛阳471003 河南科技大学动物科技学院河南省高等学校环境与畜产品安全重点学科开放实验室洛阳471003

旨在对我国最为流行的血清4、5、12和13型副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)(共36株)进行BALB/c小鼠和仔猪毒力试验的比较研究。小鼠毒力试验结果表明,4种血清型菌株的LD50分别介于9.80×10^7~4.60×10^9、2.10×10^8~8.85×10^9... 详细信息

旨在对我国最为流行的血清4、5、12和13型副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)(共36株)进行BALB/c小鼠和仔猪毒力试验的比较研究。小鼠毒力试验结果表明,4种血清型菌株的LD50分别介于9.80×10^7~4.60×10^9、2.10×10^8~8.85×10^9、4.81×10^7~7.01×10^9和1.75×10^8~8.45×10^8 CFU;整体毒力表现强弱依次是13、4、12、5型,但仅在5型与13型菌株之间毒力具有显著差异(P<0.05)。仔猪毒力试验结果表明,同一血清型中不同菌株的毒力具有明显差异,均存在强毒和弱毒菌株;整体毒力表现强弱依次是5、13、4、12型;但5型与4型(P=0.039)和12型(P=0.033)之间具有显著差异(P<0.05),与13型差异不显著(P=0.241)。综合对比分析HPS的小鼠和仔猪毒力试验结果,可以得出3个结论:1)4种国内流行性血清型菌株的整体毒力由强到弱依次是5、13、4和12型;2)但同一血清型中均存在强毒和弱毒菌株,HPS的血清型与其毒力之间不具有相关性;3)HPS虽能致死BALB/c小鼠,但其毒力结果与仔猪毒力试验结果并不一致,表明其作为替代模型具有一定的缺陷。

关键词：副猪嗜血杆菌血清型毒力小鼠仔猪相关性

副猪嗜血杆菌感染:宿主免疫应答模型与巨噬细胞活化

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畜牧兽医学报 2015年第1期46卷 1-11页

作者：陈洪波武汉轻工大学动物科学与营养工程学院动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心武汉430023

副猪嗜血杆菌是当前世界养猪业中最主要的细菌性病原体之一,感染后临床表现以格拉泽病为典型特征,严重威胁着猪群健康,应用层面的防治工作仍存在很多问题。近年来,该细菌毒力因子与宿主免疫应答等相关研究取得了很大进步,但基础层面宿主... 详细信息

副猪嗜血杆菌是当前世界养猪业中最主要的细菌性病原体之一,感染后临床表现以格拉泽病为典型特征,严重威胁着猪群健康,应用层面的防治工作仍存在很多问题。近年来,该细菌毒力因子与宿主免疫应答等相关研究取得了很大进步,但基础层面宿主-病原互作的分子机制仍不清楚。基于不同猪对该细菌存在遗传抗性差异,随着猪基因组科学技术的飞速发展,越来越多的国内外学者正寄希望于分子抗病育种途径以从根本上解决细菌感染。为此,本文结合作者所在课题组的以往工作通过综述现有高通量数据初步提出了宿主免疫应答的分子模型,重点探讨巨噬细胞活化对细菌感染或宿主保护性免疫应答可能造成的影响,围绕其中关键的分子调控进行了较为深入的分析,旨在为将来发掘具有应用价值的候选基因素材/分子标记提供借鉴。最后,本综述就下一步相关工作的开展提出了几点思考。

关键词：猪育种副猪嗜血杆菌免疫应答巨噬细胞

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副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法的建立与应用

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2015年第1期43卷 21-25,30页

作者：高艳张定全杨增岐梁留存刘海金吴朋朋高小龙常旭东杜恩岐西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

【目的】建立快速检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法,以便能够对副猪嗜血杆菌病进行快速、准确的诊断。【方法】利用9株(Ea、Ec、Ew、A1、A2、B1、B2、C1、C2)副猪嗜血杆菌陕西分离株制备平板凝集抗原,用其免疫健康家兔制备血清抗... 详细信息

【目的】建立快速检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法,以便能够对副猪嗜血杆菌病进行快速、准确的诊断。【方法】利用9株(Ea、Ec、Ew、A1、A2、B1、B2、C1、C2)副猪嗜血杆菌陕西分离株制备平板凝集抗原,用其免疫健康家兔制备血清抗体,建立副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法,对制备抗原的优势菌株进行筛选,并对该方法的特异性、敏感性、抗原最佳工作浓度进行检测。【结果】选出Ew株作为制备抗原的种子菌株,成功建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法;该方法具有良好的特异性和敏感性,抗原最适工作浓度为8×109 CFU/mL。采用本试验建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法对临床血清样品的检测结果与临床诊断结果基本一致。【结论】建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法能够对副猪嗜血杆菌病做出较为快速、准确的诊断;陕西省存在副猪嗜血杆菌不同程度的感染,规模猪场集中饲养的猪感染副猪嗜血杆菌的比率明显高于散户。

关键词：副猪嗜血杆菌抗原制备平板凝集抗体检测