检索结果-南通市图书馆

副猪嗜血杆菌Flp-FRT双基因敲除方法的建立与优化

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

畜牧兽医学报 2022年第1期53卷 219-230页

作者：肖静肖坤雪王翘楚陈焕春蔡旭旺徐晓娟华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北省预防兽医学重点实验室武汉430070

本研究旨在利用Flp-FRT位点特异性重组系统建立副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis)的无抗性标记基因敲除方法,为G.parasuis的毒力因子、致病机制和基因工程疫苗研究提供有力的遗传操作工具。首先利用λ噬菌体cI857/P_(RM)/P_(R)基因... 详细信息

本研究旨在利用Flp-FRT位点特异性重组系统建立副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis)的无抗性标记基因敲除方法,为G.parasuis的毒力因子、致病机制和基因工程疫苗研究提供有力的遗传操作工具。首先利用λ噬菌体cI857/P_(RM)/P_(R)基因表达调控系统调控Flp重组酶的表达,实现抗性突变体中抗性基因的消除;然后将Flp表达质粒电转化引入G.parasuis CF7066,再自然转化介导同源重组的自杀性质粒获得有抗性标记的基因缺失突变株,调节Flp酶表达并筛选无抗突变株,提高培养温度消除表达Flp酶的温敏质粒;进一步通过筛选突变FRT位点以保证基因敲除的效率。结果表明成功构建了温敏穿梭质粒pSHG5C-Flp,证实了λcI857/P_(RM)/P_(R)表达系统可调控Flp重组酶在G.parasuis中表达并切除抗性突变株ΔnanH::Kan_(R)中的抗性基因;然后用Flp重组酶表达质粒pSHG5C-Flp电转化G.parasuis CF7066,再用自杀性质粒pKF-ΔnanH和pKF-Δapd2对其进行两次连续自然转化,依次在自然转化的初代转化子中筛选并获得了无抗的单基因缺失株ΔnanH和双基因缺失株ΔnanHΔapd,提高培养温度至42℃培养消除了Flp重组酶表达质粒。尽管该系统实现了G.parasuis两个基因的连续敲除,但敲除第2个基因时的效率明显下降,这很可能源于细菌细胞中Flp重组酶表达的积累,对转化质粒介导的同源重组产生了干扰。因此,作者筛选了突变的FRT位点、构建自杀性质粒pKFM-Δapd进行自然转化,显著提高了自然转化后获得突变株的效率,从而保证了该敲除系统的有效性和稳定性。本研究首次报道了可用于G.parasuis的无抗性标记双基因缺失突变系统,为其分子致病基因与基因工程疫苗的研究奠定了基础。

关键词：副猪嗜血杆菌表达调控 Flp-FRT 基因敲除无抗缺失

副猪嗜血杆菌CDT三顺反子的表达、组装及生物学活性

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国兽医学报 2024年第2期44卷 283-289页

作者：李军星余斌徐丽华苏菲叶十一袁秀芳浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021

副猪嗜血杆菌是猪的常见病原菌,以异源三聚体形式分泌到胞外环境的细胞致死性膨胀毒素(CDT)是该菌重要的毒力因子,制备完整的重组CDT对于其功能研究至关重要。本研究构建了可用于同时表达CDT 3个亚基的三顺反子重组质粒,优化了完整毒素... 详细信息

副猪嗜血杆菌是猪的常见病原菌,以异源三聚体形式分泌到胞外环境的细胞致死性膨胀毒素(CDT)是该菌重要的毒力因子,制备完整的重组CDT对于其功能研究至关重要。本研究构建了可用于同时表达CDT 3个亚基的三顺反子重组质粒,优化了完整毒素三聚体的体外组装及纯化方法,并验证了重组三聚体毒素的生物学活性。结果显示,CDT 3个亚基以CdtA/CdtB/CdtC-his方式组合时,按0.1 g/L等体积混合,在PBS中以尿素浓度梯度透析时组装效果最好。构建的重组三顺反子质粒在大肠杆菌中可以同时表达出比例相当的3个CDT亚基,并且均以包涵体形式存在,经包涵体离心粗纯化后,即可用于重组三聚体CDT的组装。组装的三聚体CDT经亲和层析及分子筛层析纯化,得到高纯度的完整毒素。完整毒素可以引起Marc145细胞体积明显膨胀,且分裂周期停滞于G2/M期的细胞比例显著增加。结果表明,本研究建立了一种简单有效的副猪嗜血杆菌重组CDT完整毒素制备方法,所制备的CDT具有良好的生物学活性。

关键词：副猪嗜血杆菌细胞致死性膨胀毒素三顺反子质粒完整毒素

副猪嗜血杆菌5个重组蛋白的小鼠免疫保护效力比较

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国预防兽医学报 2023年第10期45卷 1074-1079页

作者：丁略烜戚百川史琳琪杨金钱詹鹏飞关丽君薛云赵战勤河南科技大学动物科技学院/洛阳市动物细菌性传染病防控技术重点实验室河南洛阳471023 河南科技大学动物科技学院/河南省高等学校环境与畜产品安全重点学科开放实验室河南洛阳471023

为筛选副猪嗜血杆菌(GPS)亚单位疫苗的优势保护性抗原,本研究利用大肠杆菌BL21系统表达了GPS重要抗原r Hps06257、r D15和r Hps0675,及Hps0675 N端和C端的重组蛋白r Hps0675-N和r Hps0675-C,并通过SDS-PAGE检测各重组蛋白的表达情况。利... 详细信息

为筛选副猪嗜血杆菌(GPS)亚单位疫苗的优势保护性抗原,本研究利用大肠杆菌BL21系统表达了GPS重要抗原r Hps06257、r D15和r Hps0675,及Hps0675 N端和C端的重组蛋白r Hps0675-N和r Hps0675-C,并通过SDS-PAGE检测各重组蛋白的表达情况。利用His标签蛋白纯化试剂盒纯化5个重组蛋白后,分别与Montanide^(TM)ISA 201 VG佐剂混合制成亚单位疫苗,对小鼠进行2次免疫,并分别在小鼠首免前、一免后21 d和二免后14 d(即首免后35 d)经尾根静脉采血分离血清,利用间接ELISA方法检测各组小鼠的抗体水平。二免后14 d分别利用5倍半数致死剂量(LD_(50))的5型GPS H5L3株和12型GPS H12L3株菌液对小鼠进行腹腔攻毒,攻毒后14 d内观察并记录各组小鼠的临床症状、发病及死亡情况,统计各组小鼠的免疫攻毒保护率。SDS-PAGE检测结果显示,5个重组蛋白均以包涵体形式表达,其表达量占菌体总蛋白的27.46%~42.37%。ELISA检测结果显示,各蛋白疫苗免疫组小鼠的Ig G抗体水平随免疫次数的增加而升高,与PBS对照组相比差异均极显著(P<0.01)。攻毒试验结果显示,分别利用5 LD_(50)GPS 5型H5L3株菌液和12型H12L3株菌液攻毒后,PBS和BL21菌体蛋白对照组小鼠攻毒后24 h内开始发病,3 d内全部死亡;发病小鼠主要症状为精神沉郁,食欲减退或废绝,被毛紊乱,对外界刺激无明显反应等;对死亡小鼠剖检可见其各组织器官的多发性浆膜炎和败血症性病理学变化。各蛋白疫苗免疫组小鼠中也出现了不同程度的发病和死亡情况,其中利用5 LD_(50)H5L3株攻毒后,r Hps06257、r D15、r Hps0675、r Hps0675-N和r Hps0675-C对免疫组小鼠的保护率分别为80%、0、0、40%和80%;利用5 LD_(50)H12L3株攻毒后,上述各组蛋白疫苗对小鼠的保护率分别为80%、20%、20%、10%和60%。本研究首次证实重组蛋白r Hps06257和r Hps0675-C能够诱导小鼠产生较强的免疫保护效力,具有作为亚单位疫苗靶抗原的潜力,为GPS亚单位疫苗候选保护性抗原的筛选奠定基础。

关键词：副猪嗜血杆菌抗原小鼠保护效力亚单位疫苗

副猪嗜血杆菌外膜囊泡激活caspase-11和NLRP3炎性体诱导炎性细胞因子IL-1β和IL-18分泌

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

微生物学通报 2022年第12期49卷 5171-5183页

作者：李艳杨君翟少伦楚品品卞志标张昆丽李春玲广东省农业科学院动物卫生研究所广东广州510640 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室广东广州510640 农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640 岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心广东茂名525000

【背景】副猪嗜血杆菌可引起多种炎性反应和较高死亡率,其致炎机制目前尚不清楚。【目的】探究副猪嗜血杆菌外膜囊泡(outermembranevesicles,OMVs)诱导RAW264.7细胞caspase-11及NLRP3炎性体活化的功能,以及caspase-11在OMVs活化炎性体... 详细信息

【背景】副猪嗜血杆菌可引起多种炎性反应和较高死亡率,其致炎机制目前尚不清楚。【目的】探究副猪嗜血杆菌外膜囊泡(outermembranevesicles,OMVs)诱导RAW264.7细胞caspase-11及NLRP3炎性体活化的功能,以及caspase-11在OMVs活化炎性体诱导炎性因子表达过程中的关键作用。【方法】副猪嗜血杆菌OMVs感染RAW264.7细胞,收集6、12和24 h细胞,RT-PCR检测caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表达;收集感染后48 h细胞,Western blotting检测caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达。收集感染后6、12、24、48和72 h细胞上清,ELISA检测interleukin(IL)-1β和IL-18表达水平;不同浓度OMVs(0、2.5、10、25、50和100μg/mL)感染RAW264.7细胞24 h,ELISA检测上清中IL-1β和IL-18水平。构建caspase-11沉默RAW264.7细胞株,收集OMVs感染后12、24和48 h细胞培养上清检测IL-1β和IL-18水平。【结果】Caspase-11mRNA转录水平在OMVs感染6、12和24h均极显著高于对照组(P副猪嗜血杆菌OMVs在副猪嗜血杆菌诱导的炎症反应中发挥重要作用,OMVs可诱导RAW264.7细胞caspase-11介导的非经典NLRP3炎性体信号通路活化。

关键词：副猪嗜血杆菌外膜囊泡 caspase-11 NLRP3炎性体 IL-1β IL-18

副猪嗜血杆菌OMP5抗原免疫刺激复合物的制备及其对小鼠免疫功能的影响

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

黑龙江畜牧兽医 2023年第9期 67-72,79页

作者：刘栋薛少华龙凡利梁蓉娟吴剑梅郑新添李晓华龙岩学院生命科学学院福建龙岩364012 福建农林大学动物科学学院福州350000 福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室福建龙岩364012 动物源性人兽共患病防控福建省高校工程研究中心福建龙岩364012

为探究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)外膜蛋白(outer membrane prtein,OMP)免疫刺激复合物(immune stimulating complexs,ISCOM)的抗原性,试验采用PCR方法扩增HPS的OMP5基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,获得重组表达质粒pET-28a-OMP5;进一步以QuilA、胆固醇和磷脂酰胆碱为原料,用透析法制备HPS OMP5抗原免疫刺激复合物(ISCOM-OMP5),用其免疫ICR小鼠后检测HPS抗体水平、细胞因子基因相对表达量及淋巴细胞增殖情况,以评价ISCOM-OMP5的免疫增强效果。结果表明:构建的重组表达质粒能够成功表达目的蛋白,大小约为40 ku;制备的ISCOM-OMP5具有ISCOM的典型蜂窝状结构,直径为30~40 nm,ISCOM-OMP5蛋白的包封率达85.8%;用ISCOM-OMP5对小鼠进行免疫,二免后14天即可在小鼠血清中检测到较高水平HPS抗体;ISCOM-OMP5能极显著提高白细胞介素-10(IL-10)和γ干扰素(IFN-γ)基因的相对表达量(P<0.01),显著提高T淋巴细胞的增殖能力(P<0.05),极显著提高B淋巴细胞的增殖能力(P<0.01)。说明ISCOM-OMP5可有效诱导小鼠产生针对HPS的免疫应答,能显著增强免疫效果。

关键词：副猪嗜血杆菌免疫刺激复合物 OMP5 小鼠细胞因子

副猪嗜血杆菌tfoX基因介导自然转化功能的机制初探

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

副猪嗜血杆菌tfoX基因介导自然转化功能的机制初探

作者：汤笑语四川农业大学

学位级别：硕士

自然转化(Natural transformation)作为细菌基因水平转移的主要方式之一,是指细菌主动摄取外源DNA,将其整合到自己的基因组上并稳定遗传的过程。副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)作为一种具有自然转化能力的细菌,这一特性已被... 详细信息

自然转化(Natural transformation)作为细菌基因水平转移的主要方式之一,是指细菌主动摄取外源DNA,将其整合到自己的基因组上并稳定遗传的过程。副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)作为一种具有自然转化能力的细菌,这一特性已被广泛用于构建基因缺失株和回补株,但对其自然转化的机制研究较少。本研究旨在了解GPS自然转化能力分布情况,并对tfoX的分子差异及其介导自然转化机制进行初步探究。首先在实验室条件下对84株GPS野毒株和15株标准血清型菌株进行自然转化能力进行的鉴定,并将这些菌株的自然转化能力表型与血清型比对分析。结果显示44株菌株具有转化能力,55株菌株没有自然转化能力,并且所有划分为低毒力血清型菌株都具有自然转化能力,45%中等毒力血清型菌株具有自然转化能力,而只有29%的高毒力血清型菌株中具有自然转化能力。对NCBI上公布的副猪嗜血杆菌及其他四种细菌的自然转化的核心调控因子tfoX序列进行同源性分析,发现副猪嗜血杆菌tfoX可分为两种分子类型,而这种分子差异在其他细菌中不存在。进一步通过高分辨率熔解曲线技术和测序分析对本实验室99株副猪嗜血杆菌tfoX序列进行分析,发现tfoX在所有副猪嗜血杆菌中都存在两种分子类型:44株与具有高自然转化效率的GPS菌株SC1401一致;55株与不具有自然转化能力的GPS参考菌株SH0165一致。并且这两种分子类型可导致两种截然不同的自然转化表型:所有SC1401 tfoX类型菌株都具有自然转化能力;所有SH0165 tfoX类型菌株都不具有自然转化能力。构建重组打靶质粒pK18-tfoX并通过自然转化转入SC1401构建tfoX基因缺失株,制备TfoX蛋白的多克隆抗体,通过Western Blotting鉴定缺失株是否构建成功。采用同样的方法将SC1401的tfoX基因替换为SH0165的tfoX基因。测定SC1401亲本株、tfoX基因缺失株及SH0165 tfoX基因替换株的自然转化频率,结果显示亲本株具有较高的自然转化频率,而缺失株和替换株自然转化能力丧失。采用荧光定量分别检测4株SH0165 tfoX类型GPS野毒株和4株SC1401 tfoX类型GPS野毒株的tfoX转录水平,结果显示tfoX的这种分子差异没有导致其转录呈现高、低两种水平。对SC1401亲本株和tfoX基因缺失菌株进行比较转录组学和蛋白质组学分析,结果显示差异表达基因和蛋白较多富集在与碳源代谢相关的通路上。通过在SC1401生长环境中添加碳源再检测自然转化频率,发现菌株在丰富碳源环境下自然转化频率降低7倍左右,同时再在转化过程中添加不同浓度的cAMP,发现菌株自然转化频率逐步恢复。综上,本研究结果表明GPS不同菌株的自然转化能力存在较大差异,并且自然转化与血清型(毒力)之间存在关联性。tfoX是GPS自然转化的核心调控因子,在GPS中tfoX存在两种分子类型,其分子差异可以作为判断GPS是否具有自然转化能力的分子标记。tfoX可能通过碳源的代谢来调节cAMP含量来调控自然转化功能。该研究结果可为全面明晰GPS自然转化的调控通路奠定基础。

关键词：副猪嗜血杆菌自然转化 tfoX 分子差异转化频率

副猪嗜血杆菌持续慢性感染对仔猪生产性能的影响及肺组织损伤

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

中国动物传染病学报 2022年第3期30卷 22-28页

作者：史开志杜春林王婧张静赵春萍张雄贵州省农业科学院畜牧兽医研究所贵阳550005

为评估副猪嗜血杆菌(HPS)慢性感染对仔猪生产性能的影响和肺组织损伤,通过低剂量多次鼻腔接种方式复制持续慢性感染病例进行观察测定。结果显示,感染仔猪45 d试验期内存活率100%,但与健康对照组相比出现发烧、被毛粗乱、淋巴结肿大等临... 详细信息

为评估副猪嗜血杆菌(HPS)慢性感染对仔猪生产性能的影响和肺组织损伤,通过低剂量多次鼻腔接种方式复制持续慢性感染病例进行观察测定。结果显示,感染仔猪45 d试验期内存活率100%,但与健康对照组相比出现发烧、被毛粗乱、淋巴结肿大等临床症状,采食量、日均增重和饲料转化率分别下降13.27%(P>0.05)、29.54%(P<0.01)和25.66%(P<0.01)。剖检可见感染猪肺部与胸腔粘连、心包增厚和积液,肺组织病理学观察发现肺泡隔增厚、肺泡上皮细胞坏死和脱落、部分肺泡消失、炎性细胞大量渗出。以上结果表明,HPS慢性感染可造成显著的经济损失和感染猪组织器官病理损伤。

关键词：副猪嗜血杆菌慢性感染生产性能病理损伤

副猪嗜血杆菌脂酰辅酶A合成酶活性质谱定性分析

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

动物医学进展 2022年第8期43卷 13-18页

作者：邹惠祯冯赛祥华南农业大学兽医学院广东广州510642

利用已纯化的FadD1和FadD2进行体外重构生化反应,通过质谱分析技术对2个脂酰辅酶A合成酶进行活性定性分析。体外酶活反应产物经UPLC-MS/MS质谱分析显示,全扫描模式,中性丢失扫描模式或多反应监测模式均显示酶活反应产物有脂酰辅酶A的生... 详细信息

利用已纯化的FadD1和FadD2进行体外重构生化反应,通过质谱分析技术对2个脂酰辅酶A合成酶进行活性定性分析。体外酶活反应产物经UPLC-MS/MS质谱分析显示,全扫描模式,中性丢失扫描模式或多反应监测模式均显示酶活反应产物有脂酰辅酶A的生成,而且FadD1对脂酰辅酶A的转化效率要明显高于FadD2。质谱分析数据进一步确认脂酰辅酶A合成酶的生化功能,表明其在HPS存活过程中发挥着重要的生理功能,是其致病的关键蛋白之一。成功建立了脂酰辅酶A合成酶体外质谱分析方法,可为病原细菌相关基因功能研究提供技术基础。

关键词：副猪嗜血杆菌脂酰辅酶A合成酶质谱分析

副猪嗜血杆菌的分离鉴定与灭活疫苗的初步研制

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

动物医学进展 2022年第8期43卷 35-40页

作者：肖敏刘建卢昌任华温树桦曹华斌王承宝王闯江西正邦养殖有限公司江西南昌330096 江西正邦农业科学院江西南昌330096 江西农业大学江西南昌330045 西北农林科技大学陕西杨凌712100

旨在了解副猪嗜血杆菌感染发病情况,研制安全有效的副猪嗜血杆菌单价灭活疫苗。从黑龙江、江西、广东3个省12个猪场采集疑似感染副猪嗜血杆菌病猪病料,分离到19株副猪嗜血杆菌,包括2型2株、4型7株、5型1株、7型2株、10型1株、12型3株、1... 详细信息

旨在了解副猪嗜血杆菌感染发病情况,研制安全有效的副猪嗜血杆菌单价灭活疫苗。从黑龙江、江西、广东3个省12个猪场采集疑似感染副猪嗜血杆菌病猪病料,分离到19株副猪嗜血杆菌,包括2型2株、4型7株、5型1株、7型2株、10型1株、12型3株、13型2株、15型1株,根据血清型数量可以确定2型、4型、7型、12型和13型是这些地区的优势血清型。由于广东、黑龙江、江西副猪嗜血杆菌均有多种血清型流行,且我国的商品化副猪嗜血杆菌灭活疫苗以1、4、5、12、13型为,故初步研究副猪嗜血杆菌2、7、13型单价灭活疫苗。研究的副猪嗜血杆菌单价灭活疫苗免疫仔猪14 d后,血清中副猪嗜血杆菌抗体浓度达到700 ng/mL,对同血清型的副猪嗜血杆菌的免疫保护率达到100%。研究结果显示,研制的副猪嗜血杆菌单价灭活疫苗免疫效果良好,对发病猪场的副猪嗜血杆菌病具有很好的防控效果。

关键词：猪副猪嗜血杆菌疫苗免疫效果