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急性T淋巴细胞白血病原癌基因Lmo2的一种全新剪接模式

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中国科学（C辑） 2001年第4期31卷 312-319页

作者：朱天慧秦刚 B.Royer-Pokora 南开大学医学院天津30007 Institute of Human Genetics and Anthropology University of Duesseldorf

Ｌｍｏ２是隶属于ＬＩＭ蛋白家族的一个Ｔ细胞白血病原癌基因，研究显示，它与胚胎卵黄囊期红系发育、成体血细胞分化相关，并且在血管新生过程中发挥着重要的作用．先前的工作显示该基因编码一个１５８氨基酸的蛋白质，含有二个串联的... 详细信息

Ｌｍｏ２是隶属于ＬＩＭ蛋白家族的一个Ｔ细胞白血病原癌基因，研究显示，它与胚胎卵黄囊期红系发育、成体血细胞分化相关，并且在血管新生过程中发挥着重要的作用．先前的工作显示该基因编码一个１５８氨基酸的蛋白质，含有二个串联的特征性ＬＩＭ结构域，但对于其转录调控方式尚缺乏系统的研究．为进一步了解Ｌｍｏ２转录水平的表达调控机制，以正常成人肾组织ｍＲＮＡ为材料，结合ＳＭＡＲＴＰＣＲ及５’ＲＡＣＥ技术找到了Ｌｍｏ２基因的一种新的剪接模式．这个新的转录本只含有２个外显子，编码一个１５１氨基酸的蛋白质．有趣的是，这个蛋白质与ＬＭＯ２蛋白具有相同的可读框，只是Ｎ端７个氨基酸序列不同．将含有转录起始点上游２９４核普酸至下游１８０核甙酸的基因组片段插入报道基因载体并转染ＣＯＳ７细胞系，显示出稳定的启动子活性．对各种不同来源的组织、细胞系进行ＲＴ－ＰＣＲ检测，发现此种剪接模式以不同丰度广泛存在．

关键词： Lmo2 剪接模式启动子活性白血病原癌基因转录调控制机急性T淋巴细胞

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基因表达调控与选择性剪接机制研究

电子学报 2001年第Z1期29卷 1735-1739页

作者：闻芳李衍达清华大学生物信息研究所智能技术与系统国家重点实验室北京100084

随着人类基因组计划 (HGP)的完成 ,生物信息学的研究进入了后基因组时代 ,用计算方法对基因表达调控和基因功能进行研究成为生物信息学研究的核心内容 .由于在真核基因表达调控中的特殊地位 ,选择性剪接成为研究真核基因表达调控的重要... 详细信息

随着人类基因组计划 (HGP)的完成 ,生物信息学的研究进入了后基因组时代 ,用计算方法对基因表达调控和基因功能进行研究成为生物信息学研究的核心内容 .由于在真核基因表达调控中的特殊地位 ,选择性剪接成为研究真核基因表达调控的重要内容之一 .本文从收集选择性剪接基因的数据出发 ,尽可能的收集已知的选择性剪接的基因和它们的各种转录产物 ,并进行了适当的筛选以保证数据的质量和统计分析的可靠性 .对挑选出的 371个人类基因 ,提取各种转录产物的编码区 (codingregions,或简称cds) ,应用一种新的针对选择性剪接的多序列比对程序ASALIGN进行多序列比对来揭示不同cds间的剪接关系 ,提出其中的可变区域与不可变区域 ,并对可变区域与不可变区域的长度分布 ,可变区域在cds中出现的位置 ,由于选择性剪接引起的同一段序列读码框相位的变化以及可变区域与不可变区域及二者边界上的密码子使用频率进行了统计分析 ,得到了一些很有意思的结果 .

关键词：选择性剪接多序列比对基因结构剪接模式

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橘小实蝇CRISPR/Cas9技术及其在doublesex基因功能研究中的应用

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橘小实蝇CRISPR/Cas9技术及其在doublesex基因功能研究中的应用

作者：李青梅华中农业大学

学位级别：硕士

橘小实蝇是一种危害严重的实蝇类害虫,CRISPR/Cas9技术作为近年来发展迅速的遗传改造新技术,在实蝇类害虫的防治中具有很大的应用前景。CRISPR/Cas9技术在果蝇、家蚕以及蚊类等昆虫中研究应用比较广泛,包括该技术的建立与优化、功能基... 详细信息

橘小实蝇是一种危害严重的实蝇类害虫,CRISPR/Cas9技术作为近年来发展迅速的遗传改造新技术,在实蝇类害虫的防治中具有很大的应用前景。CRISPR/Cas9技术在果蝇、家蚕以及蚊类等昆虫中研究应用比较广泛,包括该技术的建立与优化、功能基因的探索、转基因品系的研究等;而在实蝇类昆虫中的研究则仅限于技术体系的建立,其相关应用鲜有报道。Doublesex(dsx)基因作为昆虫性别决定关键基因,在昆虫性别分化以及生殖中具有重要作用。本研究通过对CRISPR/Cas9系统靶标位点的筛选、比较分析Cas9 mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA RNP复合体两种方法的敲除效率,我们建立了橘小实蝇CRISPR/Cas9技术体系,并以此为基础敲除橘小实蝇dsx基因,明确了dsx基因在橘小实蝇生殖发育中的作用。本研究有利于建立橘小实蝇在内的实蝇类害虫的CRISPR/Cas9技术与平台,并证明了dsx基因作为遗传改造的靶标基因在生物防治应用中的潜力,为橘小实蝇的遗传改造及绿色防控提供了理论和技术基础。1.Bddsx基因克隆与分析我们通过对Bddsx基因的克隆,补充了Bddsx基因组序列,增补的序列范围在NW11876346.1:1203133-1203607(475bp)内。通过分析Bddsx与其近缘物种的进化关系,发现橘小实蝇dsx基因与橄榄果实蝇同源性最高,同源性高达98%。对Bddsx基因剪接模式分析,发现Bddsx基因有2个雄特异性区域和1个雌特异性区域,Bddsx以第3外显子进行跳跃式剪接;Bddsx在5’端以第2外显子进行跳跃式剪接,在3’端则以第3外显子5’端剪接方式进行剪接;同时还找到了与剪接识别相关的A5SS识别位点、PRE序列以及4个tra/tra-2结合位点。此外,Bddsx基因表达模式研究分析表明,Bddsx 在雌成虫阶段高表达,在胸部、头部、肠道以及脂肪体等组织中表达较高;Bddsx 则是在雄成虫阶段高表达,且在精巢中表达最高。2.靶标位点设计与筛选利用在线工具,我们在Bddsx基因的雌特异性区域设计了7个候选靶标位点,分别对其方向、靶标位置、sgRNA转录效率及切割效率进行了分析。在靶标位置方向上,位于正义链与反义链的靶标位点分别有4个(sg-f2、sg-f4、sg-f5和sg-f6)和3个(sg-f1、sg-f3和sgf7);其sgRNA切割位点的位置顺序(距离)依次为sg-f1(+1)、sg-f3(+127)、sg-f4(+152)、sg-f2(+182)、sg-f5(+330)、sg-f6(+365)和sg-f7(+405)。对sgRNA转录效率分析结果表明:sg-f7转录效果最好,电泳条带灰度值为94.0;sg-f3次之,灰度值为81.9;其次为sg-f4,灰度值为42.3;sg-f1,sg-f2和sg-f5转录效果较差,灰度值分别为6.4,16.7和5.4;sg-f6没有成功转录。对sgRNA体外酶切活性检测结果表明:sg-f1和sg-f4切割效率最高,分别为74.3%和72.9%;sg-f3和sg-f5效率分别是28.9%和28.3%;sg-f7效率为15.1%;sg-f2没有检测到切割活性。综合考虑上述4个方面的因素,我们选择了sg-f4和sg-f7作为后续研究的靶标位点。3.基于Cas9 mRNA和蛋白的CRISPR/Cas9系统效率评估通过对橘小实蝇胚胎注射Cas9 mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA复合体,统计分析其存活率、突变个体比例,评估Bddsx基因删除效率以及sgRNA脱靶效应,研究比较Cas9 mRNA/sgRNA和蛋白/sgRNA两种方法基因编辑的效率。结果表明:注射Cas9 mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA的胚胎最终存活率分别是7.7%和2.0%;Cas9蛋白/sgRNA介导的基因片段删除效率高于Cas9 mRNA/sgRNA(Student’s t检验,P<0.05),平均删除效率分别为47.8%和28.1%;注射Cas9 mRNA/sgRNA F中突变个体占56.2%,注射Cas9蛋白/sgRNA F中突变个体占67.7%。此外,通过对脱靶位点的检测分析,并没有发现明显地脱靶现象,说明在橘小实蝇中CRISPR/Cas9系统基因编辑特异性很高。综合考虑胚胎存活率、基因删除效率以及橘小实蝇突变个体比例,确定了Cas9 mRNA/sgRNA是研究Bddsx基因的最适方法。4.Bddsx基因功能研究利用上述建立的橘小实蝇CRISPR/Cas9技术体系敲除Bddsx 基因,研究Bddsx基因在生殖系统发育以及性特征维持中的作用,结果表明:Bddsx基因敲除(dsx )后,橘小实蝇生殖力显著降低,dsx 雌虫后代平均孵化率为5.9%,dsx 雄虫后代平均孵化率则是28.2%;部分dsx 个体(如M2)后代出现雄性化的倾向(雌雄比小于1:1),但没有显

关键词：橘小实蝇 CRIPR/Cas9技术 Bddsx 剪接模式基因功能

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研究快报

科学新闻 2001年第38期 23-24页

溶胶凝胶法制备中孔分布集中的氧化物及混合氧化物催化材料姚楠熊国兴张玉红杨维慎报道了一种新的溶胶制备方法。通过该方法可以以无机盐为原料经过沉淀、解胶的过程制得各种氧化物和混合氧化物溶胶。发现解胶时加酸的量对溶胶体系的稳... 详细信息

溶胶凝胶法制备中孔分布集中的氧化物及混合氧化物催化材料姚楠熊国兴张玉红杨维慎报道了一种新的溶胶制备方法。通过该方法可以以无机盐为原料经过沉淀、解胶的过程制得各种氧化物和混合氧化物溶胶。发现解胶时加酸的量对溶胶体系的稳定性、粒度分布有着明显的影响,通过使用超声分散的方法可以在低温条件下制备得到原来需要在高温条件下才能得到的铝溶胶。AL NMR 表征结果表明,由该方法得到的铝溶胶体系中存在 AL聚合阳离子。在不使用模板剂的前提下,通过对粒度分布集中的溶胶粒子的控制,使这些溶胶粒子在凝胶过程中规则地团聚与堆积在一起,从而成功地制备得到了中孔分布集中的氧化硅-氧化铝、氧化铝、氧化钛等催化材料。并发现溶胶粒子的粒度分布、结构对最终材料的结构(texture)具有重要的影响。

关键词：铝溶胶中蜂囊状幼虫病病毒孔分布催化材料粒度分布不对称体细胞杂交白云岩碳酸盐岩钙调素颗粒物剪接模式甲乙醚全氟聚醚润滑油不对称融合卵母细胞快报模板剂