检索结果-南通市图书馆

作者：史明超南京医科大学

学位级别：硕士

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种快速进展、可累及上、下运动神经元的严重致死性神经系统变性病。研究发现,10%ALS为家族性的ALS(familial ALS,fALS),其中约20%fALS发病与超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase1,SOD1)基因突变有关。在SOD1基因上存在两种同一氨基酸位点上的不同突变SOD1 G41S和G41D,而携带这两种突变的患者临床表现明显不同,SOD1G41S突变型fALS患者病程进展迅速,平均生存期约为11.6个月;而SOD1 G41D突变型患者病程进展较为缓慢,平均生存期约为17年。自1993年Rosen等人发现SOD1基因突变和ALS发病有关后,研究者对此种ALS致病机制进行了一系列研究,但至今尚不清楚。目前认为,氧化应激、错误折叠蛋白聚集、线粒体功能障碍、谷氨酸盐兴奋毒性、轴索运输损害、非神经元细胞作用等都参与ALS的致病过程。另外,临床研究发现,ALS患者可出现轴突的高兴奋性,表现为持续性的钠电流增加,患者呈现出肌痉挛和肌束震颤;而先前也有研究发现在ALSG93A模型鼠原代脊髓运动神经元、ALS患者诱导多能干细胞来源的运动神经元及G93A模型鼠离体脑片中的运动神经元都出现过度兴奋的现象。电压门控性钠通道(voltage-gatedsodium channel,VGSC)是神经元的兴奋和动作电位产生、传导的重要元件,因此该通道电生理特性如果改变也将会影响神经元的兴奋性,从而导致疾病的发生。先前研究报道ALS SOD1 G93A模型鼠在疾病早期神经元VGSC电流出现异常。但是目前未有研究对SOD1 G41S和G41D突变的VGSC电生理特性进行探究。因此,为进一步探究SOD1 G41S和G41D突变在ALS中的致病机制,将本研究分为两个部分,首先构建过表达野生型(widetype,WT)SOD1、SOD1 G41S及 G41D 重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体;用上述rAAV感染小鼠神经瘤母细胞(N2a)以构建ALS细胞模型,并观察N2a细胞过量表达此两种突变蛋白后,对神经元VGSC电生理特性和凋亡分子表达的影响。第一部分SOD1WT、SOD1 G41S和SOD1 G41D rAAV载体的构建及鉴定目的构建过表达SOD1 WT、SOD1 G41S及SOD1 G41D重组腺相关病毒载体。方法首先,利用PCR扩增各目的基因片段,应用EcoRI和HindⅢ内切酶对pMT121(pAAV-hSyn-bGlobinintron-EGFP-pA)表达载体进行酶切后,回收纯化线性化表达载体。进而在无缝反应液作用下,将各目的片段与回收后的线性化表达载体进行同源重组后转化DH5α感受态细胞。利用菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆送测序,测序无误后进行质粒提抽。最后目的质粒与辅助质粒共转染HEK293细胞进行病毒包装,经纯化、浓缩、RT-PCR滴度测定后保存备用。结果PCR结果显示,在约765 bp、792 bp、521 bp、175 bp、367 bp可见特异性 RFP、GFP、SOD1WT、5’SOD1G41S/G41D、3’SOD1G41S/G41D 条带;应用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ内切酶对表达载体pMT121进行双酶切,回收4470 bp的线性化载体片段;菌落PCR转化子鉴定结果显示,SOD1WT重组质粒阳性克隆得到711bp片段、SOD1G415和SOD1G41D阳性克隆得到721bp片段;测序结果正确;72 h后获得3种SOD1 WT、SOD1 G41S和G41D rAAV颗粒,经浓缩、纯化、测定滴度分别为 2.43×1012 v.g./mL、2.28×1012 v.g./mL、2.52×1012 v.g./mL后,分装保存于-80℃备用。结论成功构建过表达SOD1 WT、SOD1 G41S及SOD1 G41D rAAV载体,病毒纯化、浓缩、滴度皆满足后续实验要求。第二部分SOD1WT、SOD1G41S和SOD1G41DrAAV载体在ALS细胞模型中的作用探究目的探究ALS SOD1上G41S和G41D两种突变型所致神经元VGSC电生理特性的差异及其可能的分子机制。方法构建过表达SOD1 WT、SOD1 G41S及G41D rAAV载体后,体外感染N2a细胞,将实验组分为3组:SOD1WT组、SOD1G41S和SOD1G41D组,并以无目的基因rAAV感染的N2a细胞为阴性对照(Control)组。利用全细胞膜片钳技术分别记录四组细胞VGSC电流,绘制通道快速激活和稳态失活曲线后分析相关参数。比较各组细胞凋亡分子Cleaved caspase-3在病

关键词：家族性肌萎缩侧索硬化超氧化物歧化酶1 重组腺相关病毒全细胞膜片钳技术电压门控性钠通道剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白水解酶

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过表达SOD_1 G41S和G41D的重组腺相关病毒载体构建及其在体外N2a细胞中的作用研究

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中国临床神经科学 2017年第2期25卷 125-134页

作者：史明超赵慧慧牛琦金庆文南京医科大学第一附属医院神经内科 210029 南京医科大学附属逸夫医院神经内科 211166

目的研究家族性肌萎缩侧索硬化(fALS)超氧化物歧化酶1(SOD_1)上G41S和G41D两种突变型所致神经元电压门控性钠通道(Na_v)电生理特性的差异及其可能的分子机制。方法构建过表达SOD_1野生型(WT)、SOD_1G41S及SOD_1G41D重组腺相关病毒(rAAV... 详细信息

目的研究家族性肌萎缩侧索硬化(fALS)超氧化物歧化酶1(SOD_1)上G41S和G41D两种突变型所致神经元电压门控性钠通道(Na_v)电生理特性的差异及其可能的分子机制。方法构建过表达SOD_1野生型(WT)、SOD_1G41S及SOD_1G41D重组腺相关病毒(rAAV)载体后,体外感染小鼠神经瘤母细胞(N2a),并分为3个实验组:SOD_1WT组、SOD_1G41S和SOD_1G41D组,并以无目的基因rAAV感染的N2a细胞为阴性对照组。利用全细胞膜片钳技术分别记录4组细胞Na_v电流,绘制通道快速激活和稳态失活曲线后分析相关参数。比较各组细胞凋亡分子cleaved caspase-3在感染后24、48和72 h不同时间点的表达情况。结果与对照组和SOD_1WT组比较,感染过表达SOD_1G41S组、SOD_1G41D组rAAV的细胞峰值电流显著增加(P0.05);各组激活、失活曲线斜率差异无显著性(P>0.05)。虽然24和48h,SOD_1WT、SOD_1G41 S、SOD_1G41D组cleaved caspase-3表达量差异无显著性;但转染72 h后,SOD_1G41S组和SOD_1G41D组cleaved caspase-3表达量高于SOD1WT组,且SOD_1G41S组高于SOD_1G41D组。结论SOD_1G41S和SOD_1G41D突变通过加快Na_v快速激活和抑制失活过程提高神经元活性,SOD_1G41S突变Na_v活性显著高于SOD_1G41D。SOD_1G41S突变导致cleaved caspase-3表达水平高于SOD_1G41D突变。

关键词：家族性肌萎缩侧索硬化超氧化物歧化酶1 重组腺相关病毒全细胞膜片钳技术电压门控性钠通道剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白水解酶

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