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转录因子JunD调控HIV-1前病毒dna转录作用的初步研究

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转录因子JunD调控HIV-1前病毒DNA转录作用的初步研究

作者：孙君帅中国农业科学院

学位级别：硕士

联合抗逆转录病毒疗法(Combination antiretroviral therapy,cART)对静息CD4+T细胞、巨噬细胞等细胞中呈潜伏感染状态的HIV-1病毒很难发挥清除作用,其原因是呈潜伏感染的HIV-1病毒处于转录沉默状态,很难被靶向药物识别。HIV-1潜伏感染... 详细信息

联合抗逆转录病毒疗法(Combination antiretroviral therapy,cART)对静息CD4+T细胞、巨噬细胞等细胞中呈潜伏感染状态的HIV-1病毒很难发挥清除作用,其原因是呈潜伏感染的HIV-1病毒处于转录沉默状态,很难被靶向药物识别。HIV-1潜伏感染的形成与转录因子例如NF-κB、AP-1等的生物学活性密切相关。这些转录因子调控HIV-1前病毒dna的转录作用受抑制或丧失,是静息CD4+T细胞中病毒转录起始受到抑制的主要原因之一。JunD是激活蛋白-1(Activating protein-1,AP-1)家族的成员之一,与c-Jun、JunB等家族其他成员相类似,其通过结合靶基因的启动子区调控基因转录。已有研究证明,AP-1家族的c-Jun等转录因子可以结合不同HIV-1亚型LTR上的AP-1结合位点,参与对HIV-1前病毒转录的调控。然而,JunD是否可通过结合LTR参与调控HIV-1前病毒转录,并借由此在HIV-1潜伏感染与病毒储存库的形成中发挥作用?尚未见相关研究。为回答上述科学问题,本研究基于可支持HIV-1复制的T细胞系Jurkat,采用CRISPR/Cas9技术,构建了敲除JunD细胞系;同时基于慢病毒载体系统,建立了稳定(过)表达JunD细胞系。借助上述细胞系,对JunD参与调控HIV-1前病毒dna的转录激活作用进行了研究。首先,拯救HIV-1假病毒并分别感染敲除JunD、稳定(过)表达JunD和对照组细胞系,通过荧光素酶检测技术和real-time qPCR对HIV-1前病毒dna转录水平的变化进行评价。荧光素酶活性检测结果显示,与对照组相比,敲除JunD可下调HIV-1前病毒dna的转录水平约57.05±7.80%;稳定(过)表达JunD则可上调HIV-1前病毒dna转录3.50±0.88倍。同时,qPCR结果显示,与对照细胞相比,敲除JunD的细胞系中HIV-1 mRNA水平显著下调约85.15±4.90%;而稳定(过)表达JunD的细胞系中HIV-1 mRNA水平则显著上调约1.64±0.12倍。此外,使用AP-1特异性抑制剂T5224处理JunD敲除的Jurkat细胞系并进行HIV-1假病毒感染。结果显示,JunD对HIV-1前病毒dna转录激活的贡献率约占全部AP-1家族成员总体贡献的40.40±8.45%。其次,基于预测的LTR上JunD结合基序和报告质粒pGL3-Luc构建的荧光素酶报告系统,证实JunD可通过TGACATC基序与HIV-1 LTR结合并激活转录;而对LTR上该基序进行突变后拯救获得的HIV-1假病毒,对Jurkat细胞系的感染水平则明显下降。再次,使用SAHA处理细胞,可基于激活细胞内JNK-JunD信号通路上调JunD磷酸化水平,并可剂量依赖性的显著提高HIV-1前病毒dna的转录。而该激活作用在JunD敲除细胞系中则受到部分抑制。基于以上全部研究数据,本研究首次评价并初步证明了转录因子JunD参与调控HIV-1前病毒dna的转录激活。该激活作用是通过特异性结合HIV-1的LTR来实现的,且激活强度与内源性JunD的磷酸化水平呈剂量依赖性。本研究发现的JunD参与HIV-1前病毒dna的转录调控,很可能成为激活潜伏感染的HIV-1转录的新靶点,一方面促进对HIV-1潜伏感染形成机制的深入理解,另一方面,有助于探索激活潜伏感染HIV-1和清除其病毒储存库的新策略。

关键词： HIV-1 前病毒dna 转录调控 JunD Jurkat细胞系

小鼠SRS白血病病毒前病毒dna片段的分子克隆

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上海医科大学学报 1993年第4期20卷 251-254,T014页

作者：李赤波郑葆芬上海医科大学基础医学院生物物理学教研室

从重组质粒pSF_(11)中提取SRS白血病病毒(SRSV)5kb dna片段,用双脱氧法对其两末端进行测序,每端测得约150bp,从中筛选出PCR引物。SRSV新鲜感染NIH/3T3细胞,从感染细胞的胞质内提取前病毒dna。用PCR法对SRSV前病毒dna中的约3.4kb片段进... 详细信息

从重组质粒pSF_(11)中提取SRS白血病病毒(SRSV)5kb dna片段,用双脱氧法对其两末端进行测序,每端测得约150bp,从中筛选出PCR引物。SRSV新鲜感染NIH/3T3细胞,从感染细胞的胞质内提取前病毒dna。用PCR法对SRSV前病毒dna中的约3.4kb片段进行扩增,扩增产物用BamHⅠ酶切后与碱性磷酸单酯酶处理的pUC_(19)载体连接,并转化大肠杆菌JM_(103),得到含约3.4kb前病毒dna片段插入子的重组质粒,并经Southern Blot证实,定名为pSF_(12),该克隆的SRSV dna片段含有部分的env和pol基因。pSF_(12)和pSF_(11)构成SRSV的完整基因克隆。

关键词：白血病病毒前病毒dna 分子克隆

HAART过程HIV/AIDS患者PBMC中HIV-1前病毒dna的动态变化及其意义

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分子诊断与治疗杂志 2018年第6期10卷 390-394,416页

作者：陈伟烈何瑞英雷华丽袁小珍胡凤玉李凌华广州市第八人民医院传染病研究所广东广州510060 广州市第八人民医院感染病中心广东广州510060

目的分析高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)过程中HIV-1感染者/艾滋病(HIV/AIDS)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中HIV-1前病毒dna的动态变化及其在临床治疗中的意义。方法 38例接受HAART最长至168周的HIV/AIDS患者纳入本研究,在不同随访时间点检测患者PBMC中HIV-1 dna水平,并与同时间点外周血CD4^+T细胞数量及血浆HIV-1 RNA病毒载量进行比较,数据进行统计学处理及相关性分析。结果随着HAART时间的增加,患者PBMC中HIV-1前病毒总dna及血浆HIV-1 RNA水平逐渐下降(r=-0.27,P=0.000 3;r=-0.39,P 前病毒总dna水平与CD4^+T细胞数量之间呈负相关(r=-0.16,P=0.039 7),与HIV-1 RNA病毒载量之间呈正相关(r=0.35,P 前病毒总dna水平随HAART进行而下降的患者比例没有差异(x^2=1.030,P=0.598)。结论 HAART过程HIV/AIDS患者PBMC中HIV-1前病毒dna水平逐渐下降,与外周血CD4^+T细胞数量、血浆HIV-1 RNA病毒载量之间有一定相关性,可作为HAART效果监测及病情预测的一个指标。

关键词：人类免疫缺陷病毒1型高效抗逆转录病毒治疗外周血单个核细胞前病毒dna

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒dna拷贝数方法的建立

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中国比较医学杂志 2006年第11期16卷 680-683,690页

作者：丛喆涂新明李兆忠许琰蒋虹佟巍卢圣栋魏强中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所北京100021 中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所北京100730

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒dna。方法巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEM T载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经... 详细信息

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒dna。方法巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEM T载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经大量扩增纯化后定量,10倍系列稀释后,做出标准曲线,作为SIV前病毒dna荧光定量检测的外标准品。结果应用Roche公司FastStart dna Master SYBR GreenⅠKit,该标准品可精确定量到10 copies/μL。结论制备的pGEM-SIVgag477质粒外标准品纯度高,SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒dna载量。

关键词：猴免疫缺陷病毒前病毒dna 实时荧光定量PCR SYBR Green Ⅰ

利用Taq Man技术定量分析HIV-1前病毒dna

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国外医学（预防．诊断．治疗用生物制品分册） 2003年第1期26卷 44-44页

作者：张涛

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四川省HIV-1的基因分型调查

中华传染病杂志 1999年第2期17卷 94-96页

作者：赵春红苏玲张永钢邵一鸣滕智平季阳中国协和医科大学中国医学科学院输血研究所中国预防医学科学院病毒学研究所

目的了解四川省ＨＩＶ１各亚型的流行情况。方法采集四川省内检出的１２例ＨＩＶ１感染者的全血标本，提取核酸后用套式聚合酶链反应（ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ）技术扩增ＨＩＶ１ｅｎｖ基因区，用异源双链电泳泳动法进行ＨＩＶ... 详细信息

目的了解四川省ＨＩＶ１各亚型的流行情况。方法采集四川省内检出的１２例ＨＩＶ１感染者的全血标本，提取核酸后用套式聚合酶链反应（ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ）技术扩增ＨＩＶ１ｅｎｖ基因区，用异源双链电泳泳动法进行ＨＩＶ１亚型的分析。结果１２份标本中有１１份ＰＣＲ扩增阳性，亚型分析证明１１份标本均为Ｂ亚型。结论ＨＩＶ１Ｂ亚型可能是四川省流行的主要亚型。

关键词：艾滋病毒1型基因分型前病毒dna 艾滋病

中国某地区人类免疫缺陷病毒母婴传播与阻断的调查研究

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中华传染病杂志 2005年第3期23卷 183-186页

作者：邓莉平桂希恩庄柯苏擘宁宜云姜友枝武汉大学中南医院感染科湖北430071 武汉大学生命科学院

目的了解人类免疫缺陷病毒在血源性艾滋病流行地区的母婴传播情况,分析影响传播的因素并提出对策。方法现场询问调查和常规体检并采静脉血,检测血清抗-HIV及HIV的前病毒dna或RNA,分析母亲及其子女配对的资料,回顾性分析HIV的母婴传播。... 详细信息

目的了解人类免疫缺陷病毒在血源性艾滋病流行地区的母婴传播情况,分析影响传播的因素并提出对策。方法现场询问调查和常规体检并采静脉血,检测血清抗-HIV及HIV的前病毒dna或RNA,分析母亲及其子女配对的资料,回顾性分析HIV的母婴传播。结果107例HIV阳性母亲生育的136名子女中,50例HIV阳性,HIV的母婴传播率为36.8%(50/136)。38例经血感染HIV阳性育龄妇女的外周血基因组核酸扩增HIV前病毒dnagag区,鉴定均为HIVB′亚型。两对HIV阳性的母婴的外周血核酸扩增HIVgag区P17的片段,Mega软件分析其基因同源性,分别为95.0%、94.9%。基因树显示子女的病毒与其母亲同属一支。艾滋病状态母亲组HIV母婴传播率为67.4%(31/46)显著高于HIV携带状态母亲组的21.1%(19/90),P<0.05。奈韦拉平(NVP)阻断的7例儿童,6例未被HIV感染,1例感染HIV。结论被调查地区HIV母婴传播是儿童感染HIV的主要途径。未采取干预措施是造成传播的主要原因。NVP阻断母婴传播较易被接受并可能减少母婴传播。

关键词： HIV感染艾滋病儿童疾病传播,垂直肝炎,病毒性,人中国人类免疫缺陷病毒阻断母婴传播血清抗-HIV 前病毒dna

绵羊肺腺瘤病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

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畜牧与兽医 2011年第7期43卷 6-11页

作者：斯日古楞么宏强马学恩王升启内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018 中国军事医学科学院北京100850

为建立检测绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)方法,根据外源性JSRV-NM株env基因序列,选其保守序列作为目的片段,设计引物和TaqMan探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组dna为模板,经PCR扩... 详细信息

为建立检测绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)方法,根据外源性JSRV-NM株env基因序列,选其保守序列作为目的片段,设计引物和TaqMan探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组dna为模板,经PCR扩增目的基因、克隆,重组质粒鉴定,并严格定量后,梯度稀释作为阳性标准品,优化反应条件进行Real-time qPCR扩增,获得的标准曲线为:Y=-3.308X+47.848,线性相关系数为0.991;Ct值变异系数小,并且灵敏度高,初步建立了检测JSRV前病毒dna的Real-time qPCR方法。应用该方法对不同来源(A、B、C、D、E组)的绵羊外周血及其他组织样品进行测定其前病毒载量。结果显示B组和C组外周血白细胞、肺脏、肺门淋巴结以及鼻液中检测均为阳性,并发现前病毒dna的载量在肺脏中明显高于外周血白细胞;D组虽未发现有绵羊肺腺瘤(SPA)临床症状,但在肺门淋巴结里可以检测到;E组中1只绵羊的肺脏也检出低拷贝数的前病毒dna,而在A组中检测结果均为阴性。本研究对检测未知羊群JSRV感染程度及研究SPA流行病学等均有重要意义。

关键词：绵羊肺腺瘤病毒实时荧光定量PCR TaqMan探针前病毒dna

北京两株HIV-1独特重组型CRF5501B/CRF07BC近全长基因组遗传特征分析

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国际病毒学杂志 2024年第4期31卷 280-284页

作者：肖明凤李佳李茜瑶刘安孙丽君卢红艳辛若雷中国医科大学公共卫生学院沈阳110122 北京市疾病预防控制中心性病艾滋病防治所 100013 首都医科大学附属北京佑安医院感染中心门诊 100069

目的对北京治疗前耐药监测发现的具有遗传相似性的两株新发重组毒株进行前病毒HIV-1 dna近全长基因组扩增和序列分析,以了解其遗传特征和重组模式。方法对北京佑安医院募集的2例新发重组毒株感染者,用广州海力特公司核酸提取和纯化试剂... 详细信息

目的对北京治疗前耐药监测发现的具有遗传相似性的两株新发重组毒株进行前病毒HIV-1 dna近全长基因组扩增和序列分析,以了解其遗传特征和重组模式。方法对北京佑安医院募集的2例新发重组毒株感染者,用广州海力特公司核酸提取和纯化试剂从白细胞富集层提取前病毒HIV-1 dna。运用SimPlot 3.5软件分析重组模式和断点,并用Mega 11构建分片段最大似然法进化树验证重组事件。结果从2个男男性行为(men who have sex with men,MSM)感染者扩增获得HIV-1近全长基因组序列。SimPlot重组断点分析显示BL6218-00和BL6017-01基因组均以CRF5501B为骨架,分别在gag和env基因区,或gag、pol、vpu/env、nef/3’LTR基因区,由CRF07BC重组而成。2条序列的CRF07BC片段均与来自MSM人群的CRF07BCN参考毒株序列聚集成单系进化簇。结论用前病毒dna扩增方法从北京MSM人群发现了两株以CRF5501B为骨架且重组模式不同的独特重组型毒株,重组亲本CRF07BC均来自我国北方MSM人群。

关键词：独特重组型近全长基因组前病毒dna 系统进化