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G-CSF诱导小鼠骨髓中性粒细胞表达Bv8促进U14宫颈癌细胞成瘤及血管生成

武汉大学学报（医学版） 2018年第2期39卷 238-243页

作者：颜彬高晗彭秋子汪莹徐檬戴璇郭玉琳邹苗王超男吴绪峰湖北省妇幼保健院妇科Ⅱ

目的：探讨粒细胞集落刺激因子（G-CSF）诱导小鼠骨髓中性粒细胞（PMN）生成Bv8的作用,以及其对肿瘤生长和肿瘤血管生成的作用。方法：体外实验：实时荧光定量聚合酶链式反应检测细胞内Bv8的mRNA表达,Western Blot检测PMN中细胞外调节... 详细信息

目的：探讨粒细胞集落刺激因子（G-CSF）诱导小鼠骨髓中性粒细胞（PMN）生成Bv8的作用,以及其对肿瘤生长和肿瘤血管生成的作用。方法：体外实验：实时荧光定量聚合酶链式反应检测细胞内Bv8的mRNA表达,Western Blot检测PMN中细胞外调节蛋白激酶（ERK）蛋白磷酸化改变。体内实验：PMN与U14小鼠宫颈癌细胞混合成瘤,G-CSFR真核表达载体干扰G-CSF作用,抗Bv8抗体阻断Bv8作用,比较各组瘤重,免疫组织化学法检测各组肿瘤组织中的血管密度。结果：体外实验中：G-CSF刺激后,PMN中Bv8的mRNA水平明显升高（P=0.005）,PMN中ERK磷酸化水平明显升高（P=0.006 7）。在G-CSF作用时加入特异性ERK抑制剂PD98059后,Bv8的mRNA水平、PMN中磷酸化ERK蛋白的水平与G-CSF刺激组相比均明显下降（P=0.008 9和0.009 8）。体内实验中：NBM-PMN抑制肿瘤生长及血管生成,TBM-PMN促进肿瘤生长及血管生成,加入G-CSFR及抗Bv8抗体后,TBM-PMN的促肿瘤生长及促血管生成作用减弱。结论：G-CSF刺激骨髓PMN生成Bv8,参与了宫颈癌肿瘤微环境改变小鼠骨髓PMN功能的过程,使其具有促进肿瘤生长及血管生成的潜能。

关键词：宫颈癌粒细胞集落刺激因子细胞外调节蛋白激酶中性粒细胞前动力蛋白2

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PK2通过LUCAT1-MMP9/TRPM2途经影响子宫内膜蜕膜化的机制研究

PK2通过LUCAT1-MMP9/TRPM2途经影响子宫内膜蜕膜化的机制研究

引用

作者：曹玉蓉郑州大学

学位级别：硕士

子宫内膜基质细胞Endometrial stromal cells,ESC)蜕膜化成功是胚胎着床和妊娠建立的前提条件。目前已证实蜕膜化受损是反复着床失败（Recurrent implantation failure,RIF）的关键病因,但其潜在机制尚不清楚。蜕膜化是一个复杂的生物... 详细信息

子宫内膜基质细胞Endometrial stromal cells,ESC)蜕膜化成功是胚胎着床和妊娠建立的前提条件。目前已证实蜕膜化受损是反复着床失败（Recurrent implantation failure,RIF）的关键病因,但其潜在机制尚不清楚。蜕膜化是一个复杂的生物学过程,涉及众多生物学过程例如细胞骨架、细胞外基质分解、细胞周期、血管生成、细胞自噬、炎症反应等,以及相关转录组、蛋白组、代谢组的改变。因此,介导蜕膜化受损的原因和机制充满多样性和不确定性。尽管,针对目前可能造成蜕膜化受损的因素进行了针对性治疗以改善胚胎着床率,但近几年来RIF不孕患者临床妊娠率并未得到显著改善,因此,寻找介导异常蜕膜化的关键调控因子及揭示其在蜕膜化过程中的相关分子机制具有非常重要的临床意义。前动力蛋白2（Prokineticin 2,PK2）是一种多功能分泌蛋白,研究表明PK2参与细胞分化、细胞自噬、血管形成、昼夜节律、细胞周期、炎性反应等生理功能。然而,PK2在子宫内膜中的作用尚不清楚。本课题组前期研究发现RIF患者黄体中期子宫内膜组织PK2、PKR1表达水平较对照组患者显著升高,细胞实验显示,过表达PK2慢病毒感染子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化相比于空载体蜕膜化组,细胞蜕膜化形态改变不明显,且蜕膜化标志物IGFBP1表达水平未升高,表明PK2表达增加可导致子宫内膜蜕膜化过程受损。RNA测序（RNA-Sequencing,RNA-seq）即通过高通量测序技术把转录组中mRNA,small RNA,NONcoding RNA等进行测序分析,反映出它们在细胞中的表达水平。本课题组前期通过RNA-seq得出PK2过表达蜕膜化和空载体蜕膜化基质细胞显著改变的lncRNA及mRNA表达谱,拟通过转录调控研究PK2调控蜕膜化的分子机制。本研究基于课题组前期RNA-seq技术检测lncRNA与mRNA的表达谱变化,结合生物信息学分析技术,筛选出参与PK2调控蜕膜化过程的靶基因lncRNA与mRNA,于原代子宫内膜细胞中验证RNA和相关蛋白表达水平,并构建对照组空载体+未蜕膜化组、对照组空载体+蜕膜化组、过表达PK2+蜕膜化组、PK2-siRNA+蜕膜化组慢病毒转染的细胞模型,进一步确定目的靶基因,探索PK2调控蜕膜化过程的分子机制。目的:1.根据RNA-seq结果,结合生物信息学分析技术,初步筛选出参与PK2调控蜕膜化过程的靶基因;2.验证靶基因在原代细胞中表达,并构建慢病毒转染的蜕膜化模型进一步确定目的靶基因,探索PK2调控蜕膜化过程的分子机制。方法:（1）筛选2019年1月至2020年1月于郑州大学第一附属医院生殖医学中心行IVF/ICSI助孕并且符合纳排标准的RIF患者及对照组患者（Conrtol组）,采集黄体中期子宫内膜。（2）根据PK2过表达蜕膜化和空载体蜕膜化基质细胞RNA-seq得出的差异LncRNA与mRNA,结合生物学分析技术及现有研究,初步筛选出PK2可能转录调控的基因。（3）通过RT-qPCR分析RIF和正常患者黄体中期子宫内膜组织的LUCAT1、RAMP2-AS1、AL034397.3、mir199a-5p、MMP9、TRPM2、CDKN1C、ULK1、NLRP3表达水平;（4）通过Western-blotting分析两组患者黄体中期子宫内膜组织的MMP9、TRPM2、LC3B表达水平（5）通过RT-qPCR和Western-blotting分析正常蜕膜化过程中LUCAT1、MMP9、TRPM2及LC3B表达水平;（6）通过构建对照组空载体+未蜕膜化组、对照组空载体+蜕膜化组、过表达PK2+蜕膜化组、PK2-siRNA+蜕膜化组慢病毒转染的细胞模型,采用RT-qPCR、Western-blotting的方法验证PK2的过表达或敲低对LUCAT1、MMP9、TRPM2及自噬标记物LC3B表达水平的影响。结果:1.结合信息学分析技术,初步筛选出PK2可能通过LUCAT1/RAMP2-AS1-MMP9;AL034397.3-mir199a-5p-CDKN1C;TRPM2-自噬（ULK1）/NLRP3 途径调控蜕膜化;***-qPCR结果显示RIF组LncRNA-LUCAT1表达水平显著高于Control组,而mRNAMMP9、TRPM2表达水平显著低于Control组（P＜0.05）;***-blotting显示RIF组MMP9、TRPM2、LC3B蛋白表达水平低于对照组;4.正常蜕膜化过程中LUCAT1的RNA表达呈略微下降,MMP9、TRPM2的mRNA和蛋白表达水平呈上升趋势,LC3B蛋白表达水平呈上升趋势。***-qPCR和Western-blotting显示过表达PK2组+蜕膜化组与未蜕膜化组LUCAT

关键词：前动力蛋白2 蜕膜化反复种植失败细胞自噬金属基质蛋白酶9

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