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SARS-CoV-2刺突蛋白抑制剂活性筛选方法研究进展

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药学学报 2024年第2期59卷 298-312页

作者：胡立德刘传峰李萍董冠宇刘新泳展鹏山东大学药学院药物化学研究所化学生物学教育部重点实验室山东济南250012

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒感染(corona virus disease 2019,COVID-19)对全球公共卫生和经济造成了前所未有的影响。SARSCoV-2通过其表面的刺突蛋白与宿主细胞膜上的血管紧张素转换酶2相结合是入侵宿主细胞的关键步骤,以刺突蛋白为靶标的小分子药物成为抗SARS-CoV-2研究的热点。活性筛选是小分子药物研发的关键步骤。鉴于此,本文综述了SARS-CoV-2刺突蛋白小分子抑制剂的活性筛选方法,以期为靶向刺突蛋白的抗病毒药物研发提供参考。

关键词：冠状病毒新型冠状病毒刺突蛋白药物筛选药物研发

刺突蛋白、血管紧张素转换酶2和蛋白酶在新型冠状病毒感染中的协同作用

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上海预防医学 2021年第3期33卷 237-242页

作者：赵岳刘文斌李子帅曹广文海军军医大学海军流行病学教研室上海200433

严重急性综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起了2019年新冠病毒病(COVID-19)全球大流行。了解SARS-CoV-2的致病机制,对新冠肺炎疫情的防控具有重要意义。SARS-CoV-2的S蛋白是保护性免疫的主要靶点。S蛋白的突变影响了SARS-CoV-2的传播和致... 详细信息

严重急性综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起了2019年新冠病毒病(COVID-19)全球大流行。了解SARS-CoV-2的致病机制,对新冠肺炎疫情的防控具有重要意义。SARS-CoV-2的S蛋白是保护性免疫的主要靶点。S蛋白的突变影响了SARS-CoV-2的传播和致病能力。血管紧张素转换酶2(ACE2)是SARS-CoV-2 S蛋白的受体,介导病毒进入靶细胞,ACE2基因的遗传多态性可能导致不同人群发病率的差异。蛋白酶可通过激活S蛋白促进病毒感染。本文综述了目前对S蛋白、ACE2及其相关蛋白酶的功能和遗传变异的认识。并讨论了这三种分子对SARS-CoV-2易感性的协同作用。

关键词：新型冠状病毒刺突蛋白血管紧张素转换酶2 蛋白酶

过表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2型刺突蛋白抑制人视网膜色素上皮细胞生长

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中华眼底病杂志 2023年第3期39卷 232-237页

作者：张宇航薛梦姣谢潇杭胡延忠张凤妍郑州大学第一附属医院眼科、河南省眼科学与视觉科学实验室郑州450052 郑州大学医学院郑州450052

目的观察过表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)刺突蛋白(S-蛋白)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞生长的抑制作用。方法构建SARS-CoV-2S-蛋白基因片段表达质粒(p3xflag-S),并转染至ARPE-19、HEK293细胞内,应用DNA测序进行鉴定,... 详细信息

目的观察过表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)刺突蛋白(S-蛋白)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞生长的抑制作用。方法构建SARS-CoV-2S-蛋白基因片段表达质粒(p3xflag-S),并转染至ARPE-19、HEK293细胞内,应用DNA测序进行鉴定,并对表达的标签蛋白进行蛋白免疫印迹法(Western blot)检测。HEK293细胞分为细胞1、2、3、4,分别转染GFP11质粒和空载质粒、GFP1-10质粒和空载质粒、GFP11质粒和pCMV-HA-ACE2质粒、GFP1-10和p3xflag-S质粒。将细胞1与细胞2(对照组1)、细胞2与细胞3(对照组2)、细胞3与细胞4(观察组)、细胞1与细胞2、3、4(对照组3)混合共培养。明场显微镜和荧光显微镜观察细胞融合情况。将RPE细胞分为对照组、过表达S-蛋白组。流式细胞仪检测RPE细胞周期;计数试剂盒8(CCK-8)检测RPE细胞增生水平;Western blot检测RPE细胞中S-蛋白表达水平。组间比较行最小显著差法t检验。结果DNA序列测定结果显示,S-蛋白cDNA与标签蛋白融合;Western blot检测结果显示,与未转染p3xflag-S质粒的细胞比较,转染HEK293细胞中S-蛋白相关表达量升高。明场显微镜下可见大而多核的融合细胞团;荧光显微镜下可见融合细胞内有多个细胞核且呈明显绿色荧光。Western blot检测结果显示,与未转染p3xflag-S质粒的RPE细胞比较,转染p3xflag-S质粒的RPE细胞中S-蛋白相关表达量升高。CCK-8增生分析结果显示,与对照组比较,过表达S-蛋白组RPE细胞增生能力显著降低,差异有统计学意义(t-22.70、16.75、23.38,P蛋白组G1期细胞分别为41.1%、67.0%;与对照组比较,过表达S-蛋白组G1期细胞明显升高,差异有统计学意义(t=4.76,P=0.018)。过表达S-蛋白组细胞凋亡率较对照组明显增加,差异有统计学意义(t=4.91,P=0.008)。结论过表达SARS-CoV-2S-蛋白可抑制RPE细胞生长活性。

关键词：严重急性呼吸综合征冠状病毒2型刺突蛋白视网膜色素上皮细胞

奥密克戎BA.1变异株在全球的流行和刺突蛋白的进化分析

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病毒学报 2023年第3期39卷 609-619页

作者：赵建楠宋洋王英时雨晴胡宏俏黄星湖郭宏江洁张燕许文波中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206 安徽理工大学医学院淮南232001

新型冠状病毒Omicron变异株出现之后,在全球暴发流行过程中不断进化出传播速度更快、免疫逃逸能力更强的进化分支,为了探究BA.1变异株在全球暴发流行的特征及刺突蛋白(Spike,S)基因的进化特征,本研究对其全基因序列的全球报告情况和S基... 详细信息

新型冠状病毒Omicron变异株出现之后,在全球暴发流行过程中不断进化出传播速度更快、免疫逃逸能力更强的进化分支,为了探究BA.1变异株在全球暴发流行的特征及刺突蛋白(Spike,S)基因的进化特征,本研究对其全基因序列的全球报告情况和S基因的进化特征进行了分析。本文通过全球共享流感数据倡议组织(Global Initiative of Sharing All Influenza Data,GISAID)获取Omicron BA.1系列变异株的全基因序列信息,分析BA.1系列变异株S基因氨基酸突变并构建系统进化树和进行贝叶斯系统进化分析。本研究提示全球约有1.2亿人被BA.1系列变异株感染,全球提交的BA.1系列变异株序列数在其出现2个月后达到高峰,5个月后占新型冠状病毒的比例下降到4.38%,累计提交BA.1全基因序列最多的区域是欧洲、美洲;截止2022年10月,BA.1系列变异株中序列提交数占绝对优势的是BA.1.1(42.07%),其次是BA.1(18.81%)。对S基因的氨基酸变异分析显示BA.1有56个进化分支,其中48个分支稳定遗传了Omicron原始株S蛋白中的18个氨基酸突变位点。对BA.1 S基因的进化分析显示其共同祖先形成时间(TMRCA)可追溯到2020年11月,S基因平均碱基替代速率为9.36×10^(-4)替换/位点/年,2021年3月BA.1流行过程中形成两个独立簇,推测G346K、G446S突变位点可能是提高病毒传播力的主要突变。本研究分析了BA.1系列变异株的流行及进化特征,其在短时间内迅速替代Delta毒株,成为全球绝对优势流行株,并有迅速被BA.2亚型代替的潜力。此外,BA.1在全球3~4个月的流行中,逐渐演变出56个进化分支,在全球流行时间短、出现部分稳定遗传的氨基酸突变、进化速率较快。因此,需密切关注Omicron系列变异株基因序列变异变迁、监测新增突变位点,及时研判新变异株的传播力、免疫逃逸能力和致病力。

关键词：奥密克戎BA.1 进化分支刺突蛋白全球流行进化分析

宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究

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中国预防兽医学报 2023年第7期45卷 672-681页

作者：刘晓萌苏文强郑永辉李苏楠中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)S蛋白与宿主表面受体ACE2结合后,S蛋白中的Furin裂解位点RRAR被宿主细胞内的弗林蛋白酶(Furin)识别,并将S蛋白切割为S1/S2亚基。为研究Furin对SARS-CoV-2S蛋白的切割活性、对病毒的感染性及其... 详细信息

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)S蛋白与宿主表面受体ACE2结合后,S蛋白中的Furin裂解位点RRAR被宿主细胞内的弗林蛋白酶(Furin)识别,并将S蛋白切割为S1/S2亚基。为研究Furin对SARS-CoV-2S蛋白的切割活性、对病毒的感染性及其形成细胞-细胞膜融合(合胞体)的影响,本研究采用套式PCR分别扩增S蛋白Furin裂解位点突变(将裂解位点由RRAR分别突变为RRRR、SRAS和AAAA)的编码基因片段,并分别克隆至pCAGGS载体中,构建重组质粒pRRRR-Flag、pSRAS-Flag、pAAAA-Flag,均经酶切和测序鉴定正确后构建pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA质粒并经测序鉴定。采用慢病毒包装系统包装慢病毒后感染Huh7细胞,48 h后采用杀稻瘟菌素筛选共表达ACE2和TMPRSS2的Huh7细胞系Huh7-A+T;利用CRISPR-Cas9方法构建Furin敲除(Furin-KO)细胞系,并均经western blot鉴定。结果显示,上述两种细胞均正确构建。将与Flag融合表达的RRAR、RRRR、SRAS和AAAA质粒分别转染HEK293T细胞,24 h后利用western blot检测S蛋白的表达。将pRRAR-Flag和pFurin-His共转染HEK293T细胞;同时将pRRAR-Flag分别转染HEK293T和Furin-KO细胞,24 h后利用western blot检测上述两种细胞中S蛋白的表达。结果显示,转染pRRAR-Flag的细胞中检测到S蛋白和S2亚基的表达,即Furin能够切割S蛋白,但转染pAAAA-Flag和pSRAS-Flag的细胞中均检测不到S2亚基的表达,转染p RRRR-Flag的细胞中S2亚基的表达量增加。与仅转染pRRAR-Flag的对照细胞相比,在HEK293T细胞中共转染pFurin-His和pRRAR-Flag能够显著增加S蛋白切割为S2亚基的量;而在Furin-KO细胞中未检测到S2亚基的表达。采用假病毒系统包装Furin裂解位点RRAR及其突变体(SRAS、AAAA)的假病毒SARS-CoV-2;利用HEK293T和Furin-KO细胞包装SARS-CoV-2假病毒,通过计算荧光素酶活性Luc与各病毒p24蛋白含量的比值比较不同假病毒对Huh7-A+T细胞及内源性Furin对两种细胞包装的假病毒的相对感染性。结果显示,与pRRAR-Flag及HEK293T细胞包装的假病毒相比,pSRAS-Flag和pAAAA-Flag及Furin-KO细胞包装的假病毒对Huh7-A+T细胞的感染性均极显著降低(P蛋白和S蛋白在细胞中的定位;将前4种质粒与表达Furin-His的质粒共转染HeLa细胞,24 h后经间接免疫荧光试验(IFA)检测Furin蛋白和S蛋白及其突变体在细胞中共定位。观察结果可见,Furin蛋白主要位于细胞浆中,S蛋白与Furin裂解位点突变的S蛋白均位于细胞膜;IFA结果显示,Furin与S蛋白及Furin裂解位点突变为RRRR的S蛋白在细胞浆中均存在共定位,但与Furin裂解位点突变为AAAA的S蛋白不存在共定位。将pRRAR-Flag、pSRAS-Flag分别与pCAGGS-m Cherry共转染HEK293T细胞,同时利用细胞示踪剂(CMFDA)预处理Huh7-A+T细胞1 h后将两种细胞混合培养,24 h后观察结果显示,共转染pRRAR-Flag和pCAGGS-m Cherry的HEK293T中出现明显的合胞体,而当Furin裂解位点突变为SRAS时,合胞体的形成明显减少。本研究首次证实Furin在细胞浆中对S蛋白预切割,且将S蛋白的Furin裂解位点突变为SRAS后能够降低SARS-CoV-2的感染性和细胞合胞体的形成能力。本研究为新冠疫情的防治提供新思路。

关键词：严重急性呼吸综合征冠状病毒2 弗林蛋白酶刺突蛋白 S2亚基切割共定位

SARS-CoV-2刺突蛋白抑制剂活性筛选方法研究进展

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药学学报 2023年

作者：胡立德刘传峰李萍董冠宇刘新泳展鹏山东大学药学院药物化学研究所化学生物学教育部重点实验室

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒感染（corona virus disease 2019， COVID-19）对全球公共卫生和经济造成了前所未有的影响。SARS-CoV-2通过其表面... 详细信息

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒感染（corona virus disease 2019， COVID-19）对全球公共卫生和经济造成了前所未有的影响。SARS-CoV-2通过其表面的刺突蛋白与宿主细胞膜上的血管紧张素转换酶2相结合是入侵宿主细胞的关键步骤，以刺突蛋白为靶标的小分子药物成为抗SARS-CoV-2研究的热点。活性筛选是小分子药物研发的关键步骤。鉴于此，本文综述了SARS-CoV-2刺突蛋白小分子抑制剂的活性筛选方法，以期为靶向刺突蛋白的抗病毒药物研发提供参考。

关键词：冠状病毒新型冠状病毒刺突蛋白药物筛选药物研发

SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域的可溶性表达及功能鉴定

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中国生物制品学杂志 2022年第8期35卷 937-942页

作者：杨洵金佳佩马家秀卢卉双蔡雪飞重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆400016

目的可溶性表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARSCoV-2)刺突蛋白受体结合域(recepter binding domain,RBD),并对其进行功能鉴定。方法利用生物信息软件对SARS-CoV-2刺突蛋白RBD区DNA序列中的稀有密码子进行替换优化。人工合成优化的RBD DNA全序列,插入pGEX 6P-1原核表达载体,构建重组表达质粒pGEX 6P-1/RBD,转化大肠埃希菌Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达重组RBD蛋白,并进行亲和层析纯化。采用SDS-PAGE、Western blot、Pull-down试验鉴定重组RBD蛋白,并应用其检测康复期患者的血清中和抗体。结果优化后RBD基因序列在大肠埃希菌中的表达难易值(CAI)由0.215提高至1.0;重组表达质粒pGEX 6P-1/RBD经菌落PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;获得的重组RBD蛋白为相对分子质量约60000的可溶性蛋白,纯度约为82%,能与血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)发生特异性结合,并能测定康复期患者血清中的特异性抗体,且灵敏度较好。结论成功获得了可溶性的重组RBD蛋白,该重组蛋白具备与人ACE2受体结合的功能,可用于中和抗体测定和疫苗接种后的效果评估。

关键词：严重急性呼吸综合征冠状病毒2 刺突蛋白受体结合域血管紧张素转换酶2 原核表达

SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域编码基因的体外转录及其在293T细胞中的表达

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中国动物传染病学报 2023年

作者：周雪高磊张瑾宬袁思凌操蓉刘丽娜贵州医科大学生物与医学工程重点实验室贵州医科大学基础医学院/生物与工程学院贵州省感染免疫与抗体工程特色重点实验室贵州省细胞免疫治疗工程研究中心贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室

为获得能表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白受体结合结构域（RBD）的体外转录mRNA，将设计、优化并合成的RBD基因片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-RBD；重组质粒转染哺乳动物细胞2... 详细信息

为获得能表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白受体结合结构域（RBD）的体外转录mRNA，将设计、优化并合成的RBD基因片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-RBD；重组质粒转染哺乳动物细胞293T后，Western blot检测重组蛋白RBD的表达；以表达RBD的重组质粒为模板，PCR扩增包含T7启动子的RBD基因片段作为体外转录模板，之后利用T7转录试剂盒体外转录获得修饰的RBD mRNA，添加多聚腺苷酸尾后使用RNA纯化试剂盒进行纯化，纯化后的RBD mRNA转染至293T细胞中，利用Western blot进行目的蛋白表达鉴定。结果显示，编码RBD的重组质粒构建成功并能在293T细胞中表达外源蛋白，体外转录获得修饰的RBD mRNA能在哺乳动物细胞中翻译，表达的RBD蛋白能与抗RBD的单克隆抗体反应，具有免疫反应原性，为SARS-CoV-2 RBD mRNA疫苗的研制奠定了基础。

关键词：严重急性呼吸综合征冠状病毒2 刺突蛋白受体结合结构域体外转录真核表达

基于刺突蛋白序列和机器学习方法预测冠状病毒宿主分类研究

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基于刺突蛋白序列和机器学习方法预测冠状病毒宿主分类研究

作者：王治博辽宁大学

学位级别：硕士

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)是一种由新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-COV-2)引起的呼吸道传染病。冠状病毒可跨物种传播到包括人类在内的多种哺乳动物,严重威胁人类健... 详细信息

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)是一种由新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-COV-2)引起的呼吸道传染病。冠状病毒可跨物种传播到包括人类在内的多种哺乳动物,严重威胁人类健康及公共卫生安全。因此,快速准确地预测冠状病毒宿主分类对于未来防控流行病具有重要意义。本研究从美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)病毒数据库中收集数据,从2000年1月1日至2020年9月25日共获得19385条冠状病毒的刺突蛋白序列,将其按照分离物种来源分为人源性和非人源性。使用CD-HIT软件去除重复和冗余序列。分别按照随机划分和采样时间先后划分的方式,将数据集以8:2的比例划分为训练集和测试集。本研究使用蛋白质描述符和自然语言模型Seq2Vec来提取刺突蛋白序列特征,应用多种机器学习方法如支持向量机(Support Vector Machine,SVM)、逻辑回归(Logistic Regression,LR)、随机森林(Random Forests,RF)以及深度学习方法门控卷积神经网络(Gated Convolutional Neural Network,GCNN)建立分类模型。使用训练集进行100次重复的5折交叉验证训练分类模型,并用测试集进行模型评估。最终选择Seq2Vec-GCNN作为最佳模型,其AUC值为0.9818,敏感性为90.06%,特异性为1,准确率为94.45%。选取去重复数据集共3216条序列,将数据按照不同类别宿主分为人类、猪类、禽类、蝙蝠、骆驼和其他哺乳动物共6类,按照收集时间排序后以8:2比例划分为训练集和测试集。使用分布描述符(CTDD)以及自然语言模型Seq2Vec提取刺突蛋白序列特征,并应用多种机器学习方法和深度学习方法使用100次重复的5折交叉验证训练分类模型,最后用测试集进行模型评估。在预测人类宿主方面Seq2Vec-GCNN作为最佳模型准确率高达99.37%,而在预测其他宿主分类方面CTDD-RF模型表现最佳,准确率分别为猪类95.82%,禽类95.96%,蝙蝠98.33%,骆驼92.06%,其他哺乳动物94.01%。以上结果分析得出,基于机器学习方法使用刺突蛋白序列构建预测冠状病毒宿主分类模型是切实有效的,可以及时、快速、准确的预测冠状病毒宿主分类,从而应用到未来的病毒防控中。随着SARS-Co V-2变异体不断出现,宿主类别可能会进一步发生改变,这使得预测冠状病毒宿主分类模型变得极为重要。本研究结果可能对未来预测和防控冠状病毒大流行具有极大参考价值。

关键词：机器学习冠状病毒刺突蛋白蛋白分类预测