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北京林业大学学报 2018年第1期40卷 17-26页

作者：遇文婧宋小双邓勋平晓帆周琦刘志华黑龙江省林业科学院黑龙江哈尔滨150040 东北林业大学林学院黑龙江哈尔滨150040

【目的】研究刺激植物响应蛋白Epl1对木本植物山新杨的刺激响应功能,为开发新一代提高植物免疫的新型诱导剂奠定基础。【方法】从棘孢木霉ACCC30153菌株中克隆获得一个刺激植物响应蛋白基因Epl1,并进行序列分析和原核表达,将获得的原核... 详细信息

【目的】研究刺激植物响应蛋白Epl1对木本植物山新杨的刺激响应功能,为开发新一代提高植物免疫的新型诱导剂奠定基础。【方法】从棘孢木霉ACCC30153菌株中克隆获得一个刺激植物响应蛋白基因Epl1,并进行序列分析和原核表达,将获得的原核重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗进行互作,初步探讨rEpl1蛋白对山新杨生长、生理指标、以及生长和防御相关基因转录水平的影响。【结果】刺激植物响应蛋白基因Epl1的cDNA序列全长为417bp,预测蛋白分子量12.6 kDa,属于Cerato-platanin家族;通过构建原核表达载体,成功获得重组蛋白rEpl1;在1μg/mL rEpl1诱导下,山新杨组培苗生长较快、根系旺盛,生物量明显增加,CAT活性在诱导第1 d时为对照的3.51倍,可溶性糖含量和脯氨酸含量在诱导初期急剧积累;山新杨生长素基因LAX2/AUX和水杨酸防御基因JAR2的转录水平分别在蛋白诱导2 d和12 h时达到峰值,分别为对照的873.10和388.02倍。【结论】Epl1基因的克隆、序列分析和原核表达为进一步研究Epl1蛋白诱导植物系统抗病性提供了理论基础;重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗互作实验,初步Epl1蛋白能够刺激木本植物在生理及分子水平上的响应,从而促进生长,提高抗性。

关键词：刺激植物响应蛋白原核表达山新杨抗病诱导剂

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刺激植物响应蛋白基因TatEpl1的克隆及原核表达载体构建

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北方园艺 2015年第16期 93-97页

作者：遇文婧刘志华刁桂萍黄颖王金杰王志英东北林业大学林学院黑龙江哈尔滨150040 黑龙江省森林保护研究所黑龙江哈尔滨150040

以深绿木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153为试材,采用PCR技术克隆到刺激植物响应蛋白基因TatEpl1,并构建TatEpl1的原核表达载体。结果表明:经测序得到的cDNA和DNA序列长度分别为417bp和487bp,接受号分别为JN695780和JN695781。以cDNA为模板进行PCR获得TatEpl1基因片段,并将目的片段插入原核表达载体pGEX-4T-2的相应位置,获得重组表达载体pGEX-TatEpl1,并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中获得重组菌株BL21-TatEpl1,经检测均呈阳性。

关键词：深绿木霉ACCC30153 刺激植物响应蛋白原核表达

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刺激植物响应蛋白基因Epl1的载体构建及酵母转化

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安徽农业科学 2014年第19期42卷 6163-6165页

作者：遇文婧刘志华王志英古丽吉米拉米吉提黄颖刁桂萍东北林业大学林学院黑龙江哈尔滨150040 黑龙江省森林保护研究所黑龙江哈尔滨150040

[目的]构建刺激植物响应蛋白Epl1基因的真核表达载体,筛选多拷贝酵母转化子。[方法]以深绿木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153的cDNA为模板进行PCR获得Epl1基因片段,并将目的片段插入表达载体pPIC9K的相应位置,获得重组表达载体,并... 详细信息

[目的]构建刺激植物响应蛋白Epl1基因的真核表达载体,筛选多拷贝酵母转化子。[方法]以深绿木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153的cDNA为模板进行PCR获得Epl1基因片段,并将目的片段插入表达载体pPIC9K的相应位置,获得重组表达载体,并将pPIC9K-Epl1转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,并用不同中终浓度的遗传霉素G418筛选多拷贝重组酵母菌株。[结果]对重组载体进行PCR及双酶切检测为阳性;在含有终浓度为2 mg/ml遗传霉素G418的YPD平板上筛选得到7株多拷贝的转化子GS115-Epl1,经PCR鉴定1株转化子呈阳性。[结论]Epl1基因的载体构建及多拷贝酵母转化子筛选为以后大量分离纯化Epl1蛋白并研究其功能奠定基础。

关键词：深绿木霉ACCC30153 刺激植物响应蛋白毕赤酵母

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棘孢木霉刺激植物响应蛋白基因Epll功能研究

棘孢木霉刺激植物响应蛋白基因Epll功能研究

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作者：古丽吉米拉·米吉提东北林业大学

学位级别：硕士

植物真菌病害在植物病害中发生程度最高,最常见,约占病害的80%,生物防治是不污染环境,对人和其它生物安全,是农药等非生物防治方法所不能比的。为了深入研究生物防治菌棘孢木霉(Trichoderma asperellum) ACCC30536菌株刺激植物响应蛋白E... 详细信息

植物真菌病害在植物病害中发生程度最高,最常见,约占病害的80%,生物防治是不污染环境,对人和其它生物安全,是农药等非生物防治方法所不能比的。为了深入研究生物防治菌棘孢木霉(Trichoderma asperellum) ACCC30536菌株刺激植物响应蛋白Epl1的功能,基于转录组测序得到的刺激植物响应蛋白基因Epl1部分cDNA序列设计引物,分别以棘孢木霉ACCC30536菌株菌丝体总rnRNA和基因组DNA为模板,进行PCR扩增,克隆获得Epl1的全长cDNA和DNA序列,其GenBank接受号分别为HM572232和JF970203, cDNA序列全长为690bp,编码139个氨基酸。BlastP(?)目似性分析表明该基因氨基酸序列与深色木霉(T. atroviride) Epl1(CAL80754)同源性最高为92%,SignalP信号肽分析表明N端第18和19个氨基酸中间有一个信号肽剪切位点(VSA//DT)。Pfam蛋白家族分析表明它属于cerato-platanin superfamily家族。将棘孢木霉ACCC30536菌株刺激植物响应蛋白Epl1对深绿木霉ATCC74058(T. atroviride ATCC74058)基因组,绿色木霉Gv29-8(T. virens Gv29-8)基因组,哈茨木霉CBS226.95(T. harzianum CBS226.95)基因组,棘孢木霉CBS433.97(*** CBS433.97)基因组进行同源性搜索,在4个近源种的基因组上前3个近源种基因组分别获得3个同源序列,棘孢木霉CBS433.97获得5个同源序列。其中,棘孢木霉CBS433.97EPL1-Tas氨基酸序列与棘孢木霉刺激植物响应蛋白Epl1相似性最高达到91%,该序列位于棘孢木霉CBS433.97染色体骨架7上运用实时荧光定量PCR方法,检测8种不同的培养条件诱导的棘孢木霉刺激响应蛋白Epll基因在转录水平上的变化,发现MM、N饥饿1%山新杨组培苗根粉诱导条件抑制Epll基因的表达,分别在4、72、4h达到最大抑制,分别抑制到未诱导前的12.97、10.82、31.91倍。在C饥饿、1%山新杨组培苗茎粉、1%山新杨组培苗叶粉、1%杨树叶枯病菌(Alternaria alternata, poplar leaf wither)细胞壁和5%杨树叶枯病菌(***, poplar leaf wither)发酵液诱导条件下,刺激植物响应蛋白基因大部分时间表现为上调表达,分别在第72、12、8、72、72h时表达量达到高峰,最大达到未诱导时的7.15、373.56、45.00、75.57、149.92倍。将克隆获得的Epl1基因构建原核表达载体pGEX-EpI1,转化大肠杆菌获得Epl1基因原核表达基因工程菌株BL21-TasEpll。通过IPTG诱导使Epl1基因在大肠杆菌BL21中表达,SDS-PAGE检测得到40.5kDa大小的蛋白条带,与预期一致,证明基因在大肠杆菌中大量表达。总之,Epl1基因的克隆为研究棘孢木霉刺激植物响应蛋白Epl1三维结构、功能、蛋白学特性提供了基础数据;也为进一步研究重组Epl1蛋白诱导杨树的抗病能力提供技术支持;同时为重组Epl1蛋白生物农药的研制奠定良好物质基础。

关键词：棘孢木霉刺激植物响应蛋白原核表达生物防治真菌病害

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