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基于别构效应的抗血栓中药有效成分辨识及配伍研究

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基于别构效应的抗血栓中药有效成分辨识及配伍研究

作者：张栩北京中医药大学

学位级别：硕士

血栓是指血液中的有形成分在血管内形成栓子,从而造成血管的部分或完全阻塞,引起相应部位供血障碍的病理过程,其已成为威胁人类健康的主要疾病。血栓的体内形成途径清晰,已上市的药物作用靶点明确,中药抗血栓疗效确切。近年来,随着人们... 详细信息

血栓是指血液中的有形成分在血管内形成栓子,从而造成血管的部分或完全阻塞,引起相应部位供血障碍的病理过程,其已成为威胁人类健康的主要疾病。血栓的体内形成途径清晰,已上市的药物作用靶点明确,中药抗血栓疗效确切。近年来,随着人们对血栓发病机制研究的不断深入以及药物设计和筛选技术的日臻成熟,别构抗血栓靶标相继涌现,如P2Y1、整合素、凝血酶等,其以明显的优势成为抗血栓新药研发的热点。别构抗血栓靶标具有两个或多个结合位点,不同位点的化合物可以发挥协同或拮抗作用。本文以别构抗血栓靶标为研究载体,开展中药抗血栓的药效成分辨识研究,并基于辨识结果开展正构及别构位点的抗血栓中药成分配伍研究,从分子层面上阐释方剂药效成分配伍的作用机制。本文选取了具有别构效应的4个靶标:嘌呤受体P2Y1(p2y purinoceptor 1,P2Y1)、整合素 α2β1(Integrin α2β1)、蛋白酶活化受体 1(protease-activated receptor-1,PAR1)和凝血酶(Thrombin),利用分子模拟技术构建其正构及别构位点的药效成分辨识模型,并对中药化学成分数据库(TCMD)进行筛选,得到各靶标正构及别构位点的潜在活性成分。随后通过分析分别作用于正构和别构位点的中药成分间的相互作用,探讨正构、别构的协同与拮抗作用和中药分子发挥配伍效应的关系,为组分配伍提供新的思路。本文研究内容包括以下三个方面:药效成分辨识模型的构建及虚拟筛选、基于别构效应的中药成分配伍研究、药效学实验验证化合物活性。1.药效成分辨识模型的构建及虚拟筛选:首先,本文基于经典抗血栓靶标嘌呤受体P2Y12(p2y purinoceptor 12,P2Y12)及具有别构效应的靶标代谢性谷氨酸受体(Metabotropic glutamate receptor,mGluRs)开展了基于分子模拟技术发现具有别构效应的抗血栓靶标的有效成分的方法学研究,探讨了基于不同数据特点选择不同分子模拟方法的原则:1)根据各靶点的活性化合物的结构特点选择合适的药效团模型构建方法。如mGluRs的活性化合物数量参差不齐,化合物结构骨架类型单一,因此选用GALAHAD的方法构建药效团模型;P2Y12的活性化合物数量较多,骨架具有多样性且活性值分布广泛,因此选择Hypogen和Hiphop的方法构建药效团模型;2)分析各靶标晶体结构的特征,采取不同方法对蛋白活性位点定义的合理性进行验证。例如,mGluR1具有复合了配体的晶体结构,则通过考察对接前后原配体的均方根偏差(root-mean-square-deviation,RMSD)值来评价活性口袋定义的合理性;mGluR5中不具有复合了拮抗剂的晶体结构,因此可通过比较活性化合物的分子对接打分值与其活性值(Ki)之间的相关性来验证口袋的合理性;对于既缺少原配体也缺少具体活性数据的相关靶标,可通过采用对接阳性化合物,并根据其是否对接成功来判断口袋的合理性。随后,根据各靶标数据信息的特点,采用不用方法构建了 4个靶标8个活性位点的药效成分辨识模型。P2Y1作为最新解析出来的靶标,以往的文献中对于其活性化合物结合位点并无太多区分,因此本文首次利用相似性搜索的方式对其化合物的结合位点进行区分,并利用GALAHAD构建了药效团模型,利用测试集对药效团模型进行评价,选择各靶点的最优药效团模型用于活性化合物筛选;整合素α2β1暂无完整的晶体结构,本文采用多模板同源模建技术构建其三维结构从而进行分子对接研究;凝血酶的晶体结构多达上百个,因此本文利用了交叉对接的方法选取了对接普适应最高的晶体结构开展分子对接研究。各靶点分子对接模型能够较好地重现原配体与受体的结合模式,可用于评价药效团命中结果并阐释配体-受体间相互作用机制。最后,利用各靶标最优的辨识模型分别对TCMD数据库进行虚拟筛选:P2Y1正构拮抗剂辨识模型共命中796个潜在有效成分,其中前胡-Comp.1和黑昆布-Comp.1具有文献验证其具有抗血小板聚集的活性,赤芍-Comp.1具有较好的预测结果;P2Y1别构拮抗剂辨识模型筛选得到961个潜在有效成分,其中前胡-Comp.2和川芎-Comp.1具有较高的预测结果;整合素α2β1正构拮抗剂辨识模型共命中了 2002个中药成分,其中灵芝-Comp.1,白芍-Comp.2和红花-Comp.1具有较好的预测结果;整合素α2β1别构抑制剂辨识模型共命中了 107个中药成分,其中灵芝-Comp.2,桂枝-Comp.1和白芍-Comp.3具有具有较好的预测结果;PAR1正构拮抗剂辨识模型共命中了 2177个中药成分,其中丹参-Comp.1、黄芪-Comp.1具有较好的预测结果;PAR1别构抑制剂辨识模型共命中了 494个中药成分,其中丹参-Comp.2和赤芍-Comp.2具

关键词：别构抗血栓分子模拟配伍

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PLK1激酶KD的别构抑制剂

PLK1激酶KD的别构抑制剂

中国化学会第30届学术年会-第二十八分会：化学生物学

作者：刘莹云泰康翔覃覃来鲁华北京大学化学与分子工程学院北京大学前沿交叉学科研究院

Polo-like kinase 1（PLK1）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在有丝分裂中发挥重要作用。PLK1由相互抑制的结构域Kinase domain（KD）和Polo-box domain（PBD）组成。KD是催化结构域,其抑制剂具有抗肿瘤等功能【1】。已报道的PLK1 KD抑制... 详细信息

Polo-like kinase 1（PLK1）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在有丝分裂中发挥重要作用。PLK1由相互抑制的结构域Kinase domain（KD）和Polo-box domain（PBD）组成。KD是催化结构域,其抑制剂具有抗肿瘤等功能【1】。已报道的PLK1 KD抑制剂主要作用于ATP结合位点,这些ATP竞争型抑制剂活性高但选择性低、毒副作用大,寻找PLK1的非ATP竞争型抑制剂有望克服上述缺点。我们开展PLK1 KD的非ATP竞争型抑制剂探索,应用本实验室研发的Cavity程序【2】对于PLK1 KD的表面进行分析,预测出两个可药性结合位点:除了ATP结合位点外,还有一个新的位点。我们对新位点进行分子对接虚拟筛选,购买打分排在前列的近两百个有机小分子,通过全长PLK1酶活测定,发现四个具有抑制活性的化合物。对活性最好的小分子进一步研究发现:1)其对于KD的酶活抑制与ATP不存在竞争关系;2)其对于KD的结合与ATP或底物不存在竞争关系【3】。这表明新位点是KD的别构位点,有活性的小分子是PLK1 KD的別构调控抑制剂。这些工作为获得新理念的PLK1抑制剂奠定了基础。

关键词： PLK1 KD 新位点别构抑制剂

力学信号调控的蛋白质功能动力学分子模拟研究

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力学信号调控的蛋白质功能动力学分子模拟研究

作者：李嘉晨南京大学

学位级别：硕士

细胞粘附是重要的细胞分子生物过程,在细菌生长繁殖、多细胞生命体的组织结构维持以及免疫反应等过程中起了关键作用。细胞粘附过程通常由细胞表面的受体蛋白与近邻细胞表面的配体小分子/蛋白质分子或细胞间质的非共价结合来实现。与通... 详细信息

细胞粘附是重要的细胞分子生物过程,在细菌生长繁殖、多细胞生命体的组织结构维持以及免疫反应等过程中起了关键作用。细胞粘附过程通常由细胞表面的受体蛋白与近邻细胞表面的配体小分子/蛋白质分子或细胞间质的非共价结合来实现。与通常的物理化学粘附不同,细胞粘附需要满足更为复杂的生物学要求,并受到多种因素的动态调控。特别是细胞粘附过程普遍依赖于拉力导致的粘附结合增强现象,即所谓的逆锁键(catch-bond)效应。这种力学信号调控下细胞粘附的重要生物学与医学意义促使人们开始思考细胞粘附过程对力学信号响应的物理基础以及逆锁键效应产生的微观分子机制,吸引了来自物理学、化学、以及生物学领域研究人员的广泛兴趣。目前,关于力学信号调控细胞粘附的研究主要采用实验手段,而相关的计算机模拟研究仍非常有限。本论文采用粗粒化分子模拟的方法研究力学信号调控下,白细胞表面受体蛋白CD44与配体分子结合微观物理机制。另外,单链DNA在相应结合蛋白上的折叠组装对转录、复制以及DNA修复至关重要,但相关分子机制仍不清楚。本论文也将探讨单链DNA在结合蛋白上的折叠组装过程,及其受机械外力的调控。具体内容如下:一、力信号调控的细胞粘附蛋白CD44逆锁键效应产生机制研究。免疫反应要求白细胞在感染位置富集。而白细胞在血管内壁的滚动是实现由血液向感染位置富集的关键步骤,并依赖于CD44介导的细胞粘附。人们发现,这种白细胞的滚动运动依赖于(血流等)流体环境下产生的拉力。在静态环境下,白细胞主要以自由运动为主,限制了其与血管壁的滚动粘附。而在一定的流速下,白细胞倾向于与血管壁粘附并发生滚动运动。人们猜测这种流体拉力导致的滚动运动可能与CD44介导的逆锁键效应有关,但相关的微观物理机制尚不清楚。本论文基于蛋白质能量面理论和多势阱模型,建立了一个描述机械力调控下蛋白质分子别构运动以及配体结合的粗粒化模型,并使用分子动力学模拟的方法研究了机械力作用下CD44的构象运动及其与配体分子的结合和解离过程。模拟结果发现,随着机械外力的增加,CD44的C端螺旋发生解折叠,并与CD44的核心结构域分离,进而导致CD44核心结构域的构象变化和配体分子亲核性的增强,表现出逆锁键效应。当机械外力继续增加时,配体分子亲和性降低。因此,本论文的分子模拟结果支持CD44受体蛋白逆锁键产生的别构机制,从而能够解释实验观测到的白细胞在流体环境下倾向于在血管内壁滚动的现象。相关结果对理解细胞免疫反应机制具有重要的参考意义。二、单链DNA在结合蛋白的折叠组装动力学及其力学调控研究。在转录、复制以及DNA修复过程产生的单链DNA(ssDNA)需要与其他蛋白(结合蛋白)结合才能维持稳定性,避免被水解破坏。人们发现,ssDNA与结合蛋白存在多种结合模型,并受到机械拉力、盐浓度等外部因素的调控,但相关的分子机制仍不清楚。本论文尝试建立了一个描述ssDNA与结合蛋白相互作用的粗粒化模型,并基于分子动力学模拟的方法研究了ssDNA在大肠杆菌单链DNA结合蛋白(SSB)以及复制蛋白A(PRA)上的折叠组装及其力学调控。分子模拟能够成功实现ssDNA的折叠组装,模拟所得到的复合体结构能够与实验结果很好的符合。另外,通过对自由能面的刻画,发现随着拉力的增加,ssDNA-SSB复合体在多种结合模式之间发生转变,在一定程度上解释了已有实验数据。本论文内容安排如下:第一章对力学信号调控的细胞粘附现象、ssDNA的结合组装动力学、分子模拟方法等作了综述;第二章给出了CD44与配体相互作用的粗粒化模型以及逆锁键效应产生机制的分子模拟结果;第三章给出了ssDNA与结合蛋白的相互作用粗粒化模型并讨论了ssDNA折叠与组装过程及其力学调控;第四章是论文总结和对相关研究的展望。

关键词：分子模拟自由能面别构逆锁键构象变化粗粒化模型单链DNA结合蛋白受体蛋白透明质酸单链DNA

CDK2新型小分子抑制剂的设计、合成及生物活性研究

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CDK2新型小分子抑制剂的设计、合成及生物活性研究

作者：邵媛媛上海交通大学

学位级别：硕士

肿瘤是一种细胞周期性疾病,严重威胁人类健康。细胞周期依赖性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)是一类丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,负责调控细胞周期的进程。其中直接参与细胞周期调控的CDK2起关键作用。CDK2的活性依赖于与cycli... 详细信息

肿瘤是一种细胞周期性疾病,严重威胁人类健康。细胞周期依赖性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)是一类丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,负责调控细胞周期的进程。其中直接参与细胞周期调控的CDK2起关键作用。CDK2的活性依赖于与cyclin E和cyclin A的结合,调控细胞G-S期的转变以及S期的进程。研究表明,大约86%的癌症中CDK2出现过表达。目前针对CDK2的抑制剂大多数为ATP竞争性抑制剂,且结构与ATP类似,在CDKs家族或其他激酶中选择性低、毒副作用大,因此寻求高效、高选择性的CDK2抑制剂是急需解决的问题。CDK2的晶体结构对以CDK2为靶标进行的合理药物设计提供了依据。本文的研究目的是寻找CDK2新型小分子抑制剂,包括ATP竞争性抑制剂和别构抑制剂,为后续的选择性小分子抑制剂的研究奠定基础。本文综合运用计算机辅助药物设计、化学合成和体内外生物活性测试等方法,设计了两类新型结构且不同作用位点的抑制剂。我们针对CDK2-cyclin A和CDK2的晶体结构,分别在ATP结合位点上和别构位点上进行虚拟筛选,挑选购买了一系列化合物,并通过构建的CDK2体外激酶活性检测体系对其进行活性测试,得到结构新颖的先导化合物。其中,对于ATP竞争性抑制剂,我们对先导化合物进行结构优化,得到22个衍生物,发现CDKI-C018显示较好的活性(IC=12.58μM)。此外,我们选取了活性较好的CDKI-C018和CDKI-C015,进行了HepG2细胞增殖抑制实验;对于别构抑制剂,初筛结果显示,S71和S70表现出较好的CDK2抑制活性,在100μM的浓度下的抑制率分别为57.59%和41.64%。并且,S71和S70有着类似的化学骨架结构,这为进一步改造出CDK2潜在的别构抑制剂奠定了基础。

关键词：细胞周期 CDK2抑制剂竞争性别构虚拟筛选合成

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论书绝句一百首(七)

爱尚美术 2019年第6期 136-137页

作者：启功不详

三十一出墨无端又入杨,前摹松雪后香光。如今只爱张神囧,一剂强心健骨方。右六首皆题张猛龙碑。碑主张君名猛龙,字神,此字聚讼最多,实则字即,之别构耳。郭宗昌《金石史》释为字,又注其音为勿骨切,固风马牛不相及也。其后碑石微剥,晚拓... 详细信息

三十一出墨无端又入杨,前摹松雪后香光。如今只爱张神囧,一剂强心健骨方。右六首皆题张猛龙碑。碑主张君名猛龙,字神,此字聚讼最多,实则字即,之别构耳。郭宗昌《金石史》释为字,又注其音为勿骨切,固风马牛不相及也。其后碑石微剥,晚拓本字又似,于是又有释者,盖以古渊字附会也。余所获明精拓本,其字固分明为“口”中“只”字,继见魏齐郡王妃常季繁墓志中此字作,其为之别构,益足信而不疑。

关键词：论书骨方猛龙别构围义字神拓本聚讼主张

维普期刊数据库

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生物网络调控研究

生物网络调控研究

第十三届全国量子化学会议

作者：来鲁华北京大学化学与分子工程学院

生物分子间存在着复杂的相互作用和调控关系,对于其中一种生物分子的调控会在网络水平上带来连锁效应。事实上常见的很多疾病,如癌症、炎症、糖尿病和心血管疾病等都是由多基因控制的,受特定分子网络调控。报告人的实验室针对生物网络... 详细信息

生物分子间存在着复杂的相互作用和调控关系,对于其中一种生物分子的调控会在网络水平上带来连锁效应。事实上常见的很多疾病,如癌症、炎症、糖尿病和心血管疾病等都是由多基因控制的,受特定分子网络调控。报告人的实验室针对生物网络开展研究,提出了针对疾病相关分子网络寻找关键结点和最优控制方案的方法,发展了多靶标药物设计方法、针对蛋白质别构位点以及无序蛋白质的药物设计方法。在生物网络和单个结点蛋白质水平上研究了别构调控的影响,发展了蛋白质别构位点预测方法,并通过分子设计手段获得了可以上调或下调蛋白质活性的化合物,为进一步揭示蛋白质别构调控机理和针对性的生物网络调控提供了基础。将介绍报告人实验室的相关研究进展,并讨论大尺度生物网络研究对于基于靶标药物设计领域所带来的机遇与挑战。

关键词：生物网络分子相互作用别构结合动力学

蛋白激酶A（PKA-C）突变L205R的致癌机制与特性抑制剂设计

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蛋白激酶A（PKA-C）突变L205R的致癌机制与特性抑制剂设计

第十一届全国化学生物学学术会议

作者：王英杰 Caitlin Walker 高加力 Gianluigi Veglia 深圳湾实验室系统生物学研究所 Department of Chemistry and BMBB University of Minnesota

蛋白质激酶的突变是诸多癌症的直接诱因,因而激酶抑制剂是当前癌症靶向治疗的一线药物。最近研究发现蛋白激酶A催化亚基（PKA-C）的诸多突变可直接导致库欣综合征,其中最主要的L205R点突变晶体结构与野生型几乎没有差异,因而其致癌机理... 详细信息

蛋白质激酶的突变是诸多癌症的直接诱因,因而激酶抑制剂是当前癌症靶向治疗的一线药物。最近研究发现蛋白激酶A催化亚基（PKA-C）的诸多突变可直接导致库欣综合征,其中最主要的L205R点突变晶体结构与野生型几乎没有差异,因而其致癌机理尚未定论,同时也给临床治疗带来了诸多困难。我们综合采用分子动力学模拟,结合蛋白质核磁共振实验及多种热力学定量测量方法,共同阐明了该突变对蛋白质运动及别构效应改变的物理化学基础。尤为关键的是,我们发现L205R突变减弱了激酶与原生蛋白抑制剂（PKI）的结合力,同时改变了PKA-C的底物选择性,从而重构了别构网络和信号转导。基于对该机制的理解,我们结合计算与实验,设计了针对L205R的特异抑制多肽,相较于PKI,其对L205R的选择性抑制提升了600多倍。该项研究表明,针对激酶致癌突变的机制性研究有助于研发新一代更具特异性和选择性的激酶抑制剂。

关键词：激酶分子动力学模拟 NMR 别构