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基于报告基因的雌激素受体β亚型激动剂细胞筛选模型的建立

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药学学报 2006年第8期41卷 721-726页

作者：陈立敏吕秋军 Satoshi Inoue 卞广兴陈振花温利青军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京100850 东京大学老年医学系

目的建立基于报告基因和雌激素受体β(estrogen receptorβ,ERβ)亚型信号通路的药物筛选模型,以期发现ERβ亚型激动剂。方法构建带有雌激素应答序列(estrogen responsive elem ent,ERE)靶序列和报告基因的诱导性表达载体pTAL-ERE-SEAP... 详细信息

目的建立基于报告基因和雌激素受体β(estrogen receptorβ,ERβ)亚型信号通路的药物筛选模型,以期发现ERβ亚型激动剂。方法构建带有雌激素应答序列(estrogen responsive elem ent,ERE)靶序列和报告基因的诱导性表达载体pTAL-ERE-SEAP,并将其转入人胚肾(HEK293)细胞中,筛选报告基因分泌型碱性磷酸酶(secretedalkaline phosphatase,SEAP)表达受雌二醇(17β-estrad iol,E2)诱导的阳性克隆。选取相关核受体配体进行模型的特异性考察,同时考察模型的稳定性及时效量效关系,以及免疫细胞化学染色鉴定转染后ERβ的表达情况。利用此模型对本实验室样品库中的2 622个化合物进行筛选。结果转染pTAL-ERE-SEAP的HEK293细胞中,SEAP报告基因的表达受E2的诱导并呈剂量与时间依赖关系,E2对阳性克隆细胞无增殖作用,本模型的Z′因子值为0.7,免疫细胞化学染色结果表明,转染后ERβ表达、地塞米松以及其他配体的诱导表达率低。结论利用此模型通过测定SEAP报告基因的诱导表达水平可筛选ERβ亚型激动剂。

关键词：雌激素雌激素应答序列分泌型碱性磷酸酶药物筛选报告基因免疫细胞化学

GC盒不是人胰岛素基因启动子中关键顺式作用元件

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南方医科大学学报 2007年第1期27卷 78-80页

作者：牛新捷王作仁 Jochen Seufert 西安交通大学第一医院肝胆外科德国弗莱堡大学医学院内分泌和糖尿病科弗莱堡79095

目的鉴定人胰岛素基因启动子中的GC盒(-348￣-338)是否是启动子中的关键顺式作用元件。方法用PCR克隆人胰岛素基因启动子,构建由人胰岛素基因启动子驱动的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告质粒,并对报告质粒中人胰岛素基因启动子中的GC盒进... 详细信息

目的鉴定人胰岛素基因启动子中的GC盒(-348￣-338)是否是启动子中的关键顺式作用元件。方法用PCR克隆人胰岛素基因启动子,构建由人胰岛素基因启动子驱动的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告质粒,并对报告质粒中人胰岛素基因启动子中的GC盒进行删除和突变。将报告质粒转染到!细胞系"TC3中,测定细胞培养液上清中SEAP的活性强度,进而判定GC盒与人胰岛素基因启动子转录活性的关系。结果删除和突变人胰岛素启动子中的GC盒不能显著改变胰岛素基因启动子在#细胞中的转录活性。结论人胰岛素基因启动子中GC盒不是一个关键顺式作用元件。

关键词：胰岛素基因 GC盒启动子分泌型碱性磷酸酶顺式作用元件

四个达摩凤蝶新孵幼虫细胞系的建立及其生物学特性

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昆虫学报 2015年第8期58卷 826-835页

作者：丁伟峰冯颖张欣李娴王成业谢世聪中国林业科学研究院资源昆虫研究所国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室昆明650224

[目的]建立达摩凤蝶Papilio demoleus Linnaeus新孵幼虫细胞系,并对其生物学特性进行研究。[方法]使用改良配方的Grace培养基并辅以20%胎牛血清,通过原代和传代培养建立达摩凤蝶新孵幼虫细胞系。通过显微观察、细胞活力分析、核型分析... 详细信息

[目的]建立达摩凤蝶Papilio demoleus Linnaeus新孵幼虫细胞系,并对其生物学特性进行研究。[方法]使用改良配方的Grace培养基并辅以20%胎牛血清,通过原代和传代培养建立达摩凤蝶新孵幼虫细胞系。通过显微观察、细胞活力分析、核型分析和分子鉴定,获得4个新建细胞系的生物学特性数据。使用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组分泌型碱性磷酸酶杆状病毒（Ac MNPV-SEAP）。使用有限稀释法测定达摩凤蝶细胞系对Ac MNPVSEAP的半数组织培养感染剂量（TCID50）,比较达摩凤蝶细胞系对Ac MNPV-SEAP的敏感性。[结果]建立了4个贴壁生长的达摩凤蝶新孵幼虫细胞系（RIRI-Pa De-1,RIRI-Pa De-2,RIRI-Pa De-3及RIRI-Pa De-4）,且均传至60代以上。形态学方面,细胞系RIRI-Pa De-1和RIRI-Pa De-4较为相近,均由圆形、梭形以及多边形细胞组成,细胞系RIRIPa De-2主要为圆形细胞,而RIRI-Pa De-3主要为类似表皮细胞和纤维状细胞。细胞增殖动力学方面,4个细胞系的群体倍增时间分别为69.77,67.42,81.48及65.43 h。核型分析显示4个细胞系染色体数量均呈正态分布,其中RIRI-Pa De-2,RIRI-Pa De-3以及RIRI-Pa De-4的染色体数目分布区间比较接近,在45～97条之间,RIRI-Pa De-1的染色体条数相比偏少,在36～90条之间。通过比对4个达摩凤蝶细胞系和虫卵的细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因序列,证明4个新建细胞系来源于达摩凤蝶组织。比较4个细胞系对Ac MNPV-SEAP敏感性发现RIRI-Pa De-3对此病毒较为敏感,可作为重组杆状病毒表达的宿主。[结论]虽然4个新建达摩凤蝶细胞系的来源相同,具有相同的遗传背景,但其生物学特征仍有明显差异,具有进一步研究的价值。

关键词：达摩凤蝶新孵幼虫昆虫细胞系分泌型碱性磷酸酶重组杆状病毒

人源细胞内物质转运调节分子ARFGAP1对细胞分泌功能的影响

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中国生物化学与分子生物学报 2001年第2期17卷 237-243页

作者：刘晓勤张成岗邢桂春陈清棠贺福初军事医学科学院放射医学研究所北京100850 北京大学第一医院神经内科北京100034

ARF GAP是重要的细胞内物质转运调节分子 .最近 ,在人胎肝 c DNA文库中发现一种新基因 ,其编码的氨基酸序列与大鼠的 ARF1 GAP有 32 %同源性 ,故将其命名为“ARFGAP1”.对ARFGAP1进行功能研究 ,利用分子克隆技术构建绿色荧光蛋白 (GFP) ... 详细信息

ARF GAP是重要的细胞内物质转运调节分子 .最近 ,在人胎肝 c DNA文库中发现一种新基因 ,其编码的氨基酸序列与大鼠的 ARF1 GAP有 32 %同源性 ,故将其命名为“ARFGAP1”.对ARFGAP1进行功能研究 ,利用分子克隆技术构建绿色荧光蛋白 (GFP) - ARFGAP1融合基因表达质粒 (p EGFP- C1 - ARFGAP1 ) ,经脂质体转染将其导入 COS- 7细胞瞬时表达 ,利用绿色荧光确定ARFGAP1的亚细胞定位 .结果显示 ,ARFGAP1位于细胞质部分 ,表达量高时 ,在核周高尔基体区聚集呈团块状或颗粒状 .构建真核表达质粒 pc DNA3.1 /myc- His- ARFGAP1 ,在 COS- 7细胞中表达 ,并用 ARFGAP1和分泌型碱性磷酸酶 (SEAP)真核表达质粒共同转染 COS- 7细胞 ,发现ARFGAP1在细胞中过表达能部分抑制 SEAP的分泌 .结果证明 ,ARFGAP1对细胞的物质转运和分泌功能有调节作用 .

关键词：细胞内物质转运细胞分泌功能 ARFGAP1 分泌型碱性磷酸酶

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分子生物学中报告基因的主要类型及应用现状

环境与健康杂志 2011年第5期28卷 460-462页

作者：刘广文苏旭丁建清阚飙天津市疾病预防控制中心病原生物检测所天津300011 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

报告基因技术在分子生物学领域中已经广泛应用于基因表达调控、启动子活性分析、信号转导、受体功能鉴定以及基因治疗、药物筛选等领域,而且随着技术和检测方法的进步,不断有新的更加灵敏和非损伤性的报告基因出现,尤其是一些不影响细... 详细信息

报告基因技术在分子生物学领域中已经广泛应用于基因表达调控、启动子活性分析、信号转导、受体功能鉴定以及基因治疗、药物筛选等领域,而且随着技术和检测方法的进步,不断有新的更加灵敏和非损伤性的报告基因出现,尤其是一些不影响细胞繁殖、能够实时检测的荧光报告基因的发展更为迅速。该文从报告基因的使用现状出发,对其主要的种类、特征、应用及发展趋势进行论述。

关键词：报告基因分泌型碱性磷酸酶绿色荧光蛋白萤火虫荧光素酶海肾荧光素酶

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报道基因SEAP的应用

生命的化学 2011年第2期31卷 309-311页

作者：杨靖佳井申荣曾韦锟昆明理工大学生命科学与技术学院昆明650224

分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)由于既有很高的灵敏性,又可分泌至培养介质中,因而SEAP基因成为一种广泛使用的报道基因。目前,该基因在中和抗体检测试验、实时监测分析及工程抗体构建与检测方法有较多应用。该... 详细信息

分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)由于既有很高的灵敏性,又可分泌至培养介质中,因而SEAP基因成为一种广泛使用的报道基因。目前,该基因在中和抗体检测试验、实时监测分析及工程抗体构建与检测方法有较多应用。该基因在双报道基因系统中运用,可同时起到定性定量作用。本文将对报道基因SEAP的使用原理与应用加以综述。

关键词：分泌型碱性磷酸酶中和抗体双报道基因系统

基于报告基因和干扰素-α信号通路的药物筛选

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基于报告基因和干扰素-α信号通路的药物筛选

作者：陈振花沈阳药科大学

学位级别：硕士

目的干扰素-α为目前国内外公认的抗病毒药物之一，但干扰素-α为蛋白多肽，存在体外易分解，体内易被代谢，不能口服等问题，因-此建立模型筛选具有干扰素-α样活性的有机小分子化合物，具有重要意义。新药发现是一个复杂和系统的工... 详细信息

目的干扰素-α为目前国内外公认的抗病毒药物之一，但干扰素-α为蛋白多肽，存在体外易分解，体内易被代谢，不能口服等问题，因-此建立模型筛选具有干扰素-α样活性的有机小分子化合物，具有重要意义。新药发现是一个复杂和系统的工作，其中药物筛选模型的建立和先导化合物发现是新药研究的关键环节之一，本课题利用现代分子生物学和细胞生物学技术建立基于细胞的高效和灵敏的药物筛选模型，并利用所建立的药物筛选模型对有机小分子化合物进行了干扰素-α样活性筛选，以期待发现具有新结构类型的拟干扰素-α样活性的有机小分子化合物。材料与方法采用pTAL／SEAP载体，构建含有干扰素-α刺激应答序列(interferon stimulated response element，ISRE)和报告基因的诱导性重组表达载体pTAL／ISRE-SEAP;采用脂质体的方法进行瞬时转染，将重组表达载体pTAL／ISRE-SEAP转染入血管内皮细胞(ECV304)和肝癌细胞(HepG2)中，确定用于稳定转染的细胞株;然后在瞬时转染的基础上，同时将阳性克隆筛选标记pTK-HygB和重组表达载体pTAL／ISRE-SEAP共转染ECV304，用潮霉素B筛选报告基因碱性磷酸酶(SEAP)表达受干扰素-α诱导的阳性克隆;并选取相关的细胞因子干扰素-β、干扰素-γ和生长因子甲状旁腺素(PTH)进行模型特异性考察;对模型的灵敏性、稳定性等进行评价;利用本模型对本实验室化合物库中的300个化合物进行了筛选;对于筛选出的258号化合物采用体外抗乙型肝炎病毒模型(HepG2．2．15细胞)及RT-PCR的方法进行作用机理研究。结果 (1)重组表达载体酶切鉴定，确定成功构建了pTAL／ISRE-SEAP重组表达载体;(2)细胞转染，通过瞬时转染确定了ECV304细胞为稳定转染的细胞，并确定了转染条件;利用潮霉素B(500μg／ml)筛选出了稳定转染pTAL／ISRE-SEAP的阳性单克隆细胞;(3)模型考察，报告基因SEAP的表达受干扰素-α的诱导并呈现剂量依赖关系;干扰素-α的最高诱导表达率分别是IFN-β最高诱导表达率的9.0倍、IFN-γ的8.8倍和PTH的9.1倍，具有相对特异性;干扰素-α对ECV304细胞无增殖作用;本方法的Z′-因子为0.8;(4)化合物筛选，发现了具有激活干扰素-α信号通路的有机小分子化合物258号;258号化合物在体外抗乙型肝炎病毒模型上对s抗原和e抗原的分泌无明显影响，但对DNA拷贝数有抑制作用;RT-PCR实验结果显示258号化合物对OAS3基因的表

关键词：干扰素-α 干扰素-α刺激应答序列 OAS3基因分泌型碱性磷酸酶药物筛选模型报告基因 pTAL/SEAP pTAL/ISRE-SEAP

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转SV40大T抗原基因昆虫细胞系的研究

转SV40大T抗原基因昆虫细胞系的研究

作者：田建肖河北农业大学

学位级别：硕士

昆虫细胞作为重组病毒的受体能成功高效地表达外源基因，生产具有重要医用价值、具备天然活性的生物工程制品，从而使昆虫细胞培养倍受青睐。目前，可以通过转基因的方法改良现有细胞，从而获得高产昆虫杆状病毒和外源蛋白的昆虫细胞系... 详细信息

昆虫细胞作为重组病毒的受体能成功高效地表达外源基因，生产具有重要医用价值、具备天然活性的生物工程制品，从而使昆虫细胞培养倍受青睐。目前，可以通过转基因的方法改良现有细胞，从而获得高产昆虫杆状病毒和外源蛋白的昆虫细胞系。本研究用磷酸钙转染法和电穿孔两种方法，分别将SV40病毒的大T抗原基因转入第80代的Tn5B1-4细胞，经G418筛选，克隆，共得到转基因细胞克隆株62株。通过细胞传代，选出生长且状况良好的克隆株共有54株。54株细胞系分别经PBS，AMD处理，病毒滴度和多角体产量比较筛选出10个细胞克隆株：Tn5B-1-1、Tn5B-1-12、Tn5B-1-15、Tn5B-1-25、Tn5B-1-26、Tn5B-1-30、Tn5B-1-33、Tn5B-2-3、Tn5B-2-9及Tn5B-2-12，这些细胞系分别接种昆虫病毒TnGV、TnNPV、MsNPV、PiNPV，其中仅Tn5B-1-12对所测的所有NPV病毒敏感，将此转基因细胞系命名为Tn5B-SV-40(简写为Tn5B-40)。 Tn5B-40细胞形态主要为纺锤形和圆形，贴壁生长，大小为18.5×42μm。增殖很快，群体倍增时间为22小时，最大生长密度可达2.2×10～6cells／ml。对AcMNPV病毒感染率达95％，多角体产量平均为115 OBs／cell，是一株高产杆状病毒的细胞系。 Tn5B-40有较强的营养抗逆性，细胞在无营养的PBS盐缓冲液中1天以后，Tn5B-40细胞有70％存活，比野生型Tn581-4细胞高出30％，第5天时，Tn581-4细胞全部死亡，Tn5B-40到第6天仍然有5％存活细胞。用含不同浓度放线菌素D的培养基处理Tn5B-40细胞1小时，当放线菌素D浓度为0.31，0.62，1.25和2.5μg／ml时，Tn5B-40细胞的存活率分别比Tn581-4高出38％，50％，60％和35％，当浓度高达5μg／ml时，Tn581-4细胞全部死亡而Tn5B-40细胞仍有30％的生存率。说明此细胞具有抗凋亡的特性。 Tn5B-40是一株高表达重组蛋白的昆虫细胞系。用重组病毒AcMNPV-β-gal侵染细胞，Tn5B-40细胞内β-半乳糖苷酶的产量明显高于野生型细胞系，到第六天，其表达水平达到Tn581-4的2.3倍，第8天时比Tn581-4细胞高出35％，达3.4×10～4IU／ml。随着时间的延长，Tn5B-40培养基中酶量也逐渐增加，第4天就比第2天提高了5倍。第8天时Tn5B-40细胞内和培养基中的酶总表达水平达到最高5.4×10～4IU／ml。AcMNPV-SEAP感染此细胞，其细胞内的分泌型碱性磷酸酶表达水平明显低于培养基中的表达水平，最高只达1 IU／ml。Tn5B-40细胞分泌在培养基中的SEAP在细胞培养后期较高，第9天时比Tn581-4高出25％。Tn5B-40的SEAP总表达水平最高值达到5.7IU／ml。昆虫病毒AcMNPV在Tn5B-40细胞中离体传代10次，病毒未出现继代效应，其病毒滴度、多角体形态及产量、杀虫毒力均无明显变化。Tn5B一40细胞是昆虫杆状病毒离体复制的优良细胞系。

关键词： SV40大T抗原 Tn5B1-4细胞转基因细胞系 β-半乳糖苷酶分泌型碱性磷酸酶

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报告基因研究及其应用进展

国际遗传学杂志 2013年第1期36卷 6-12页

作者：张禾璇单可人官志忠贵阳医学院分子生物学重点实验室

报告基因是现代分子生物学研究领域中用于分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具,通过它的表达产物便捷、可靠、灵敏地解析基因时空表达调控的内在规律。报告基因... 详细信息

报告基因是现代分子生物学研究领域中用于分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具,通过它的表达产物便捷、可靠、灵敏地解析基因时空表达调控的内在规律。报告基因技术广泛应用于基因表达调控、信号转导、转基因、启动子分析、受体功能鉴定、基因治疗以及药物筛选等领域,该文将对报告基因的主要类型、特点及其应用研究进展进行综述。

关键词：报告基因氯霉素乙酰基转移酶分泌型碱性磷酸酶荧光蛋白家族荧光素酶