检索结果-南通市图书馆

南昌大学学报（理科版） 2017年第2期41卷 158-165页

作者：李婧婧李兴章孙士民张登虹黄春洪南昌大学基础医学院江西南昌330006

抗蛇毒血清作为抗蛇伤中毒特效药,其生产和临床应用上的局限导致很多伤者得不到及时救治。PLI(phospholipase A_2 inhibitors)是蛇自身表达的解毒蛋白,它可以抑制蛇毒主要毒素PLA_2进行自我保护。我们实验室前期在华游蛇中分离到一个PLI... 详细信息

抗蛇毒血清作为抗蛇伤中毒特效药,其生产和临床应用上的局限导致很多伤者得不到及时救治。PLI(phospholipase A_2 inhibitors)是蛇自身表达的解毒蛋白,它可以抑制蛇毒主要毒素PLA_2进行自我保护。我们实验室前期在华游蛇中分离到一个PLIγ,它对蛇毒PLA_2酶活性和出血毒均有强抑制效果。本研究通过酵母对华游蛇PLIγ进行表达。将PLIγ连接到pPICZαA表达载体,重组质粒通过电转化方式导入毕赤酵母GS115。在30℃、250r·min-1条件下,使用终浓度0.5%甲醇对筛选的转化子进行诱导,连续培养120h,每隔24h收集发酵液上清,用Western Bolt检测PLIγ表达水平,确定72h为最佳诱导时间。采用镍柱亲和层析分离纯化PLIγ,SDSPAGE检测纯度。活性实验表明:重组PLIγ对五步蛇蛇毒PLA2酶活的抑制效率为84%,并可以有效抑制其出血毒性。体外免疫共沉淀表明重组PLIγ与蛇毒sPLA_2IB和IIA型均存在直接相互作用。

关键词： PLIγ 蛇毒PLA2 酵母表达出血毒性免疫共沉淀

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中华水蛇PLIγ在毕赤酵母中的表达、纯化及活性测定

中华水蛇PLIγ在毕赤酵母中的表达、纯化及活性测定

引用

作者：李兴章南昌大学

学位级别：硕士

磷脂酶A是一类可催化细胞膜和脂蛋白磷脂二位酰基(Sn-2)水解,释放溶血磷脂及游离脂肪酸的酶族,从而参与人体花生四烯酸通路,进一步的产生大量的炎症因子,造成机体损伤。磷脂酶A在生物个体中分布广泛,在多种蛇类蛇毒中已发现多种类型的P... 详细信息

磷脂酶A是一类可催化细胞膜和脂蛋白磷脂二位酰基(Sn-2)水解,释放溶血磷脂及游离脂肪酸的酶族,从而参与人体花生四烯酸通路,进一步的产生大量的炎症因子,造成机体损伤。磷脂酶A在生物个体中分布广泛,在多种蛇类蛇毒中已发现多种类型的PLA,含量丰富,毒性多样,表现出细胞毒性、神经毒性、肌肉毒性以及出血毒性等多种毒性,可以作为开发抗蛇毒药物的关键靶点。据研究发现,一些种类的蛇的肝脏可以表达一种蛋白质,可以特异性中和蛇毒组分PLA,从而保护自己不被自身毒液所伤害,这种蛋白称为PLA抑制剂(phospholipase A inhibitors,PLI)。实验室前期研究中,我们从中华水蛇血清中纯化得到一个新PLIγ,它对五步蛇sv PLA酶活性和出血毒均有强抑制效果。由于蛇资源缺乏且血量较少,从中提取大量PLI较为困难,实验室前期构建中华水蛇PLIγ原核表达系统,但蛋白以没有生物活性的包涵体形式存在,复性效率低,对其酶活有所影响,故将采用真核表达方式得到中华水蛇PLIγ。目的:为更加方便快捷的得到活性更高的中华水蛇PLIγ蛋白,构建p PICZαA-PLIγ重组表达载体,转化进毕赤酵母中进行真核表达,进一步的进行活性测定,为开发新型抗蛇毒药物奠定基础。方法:采用琼脂糖活性平板实验,根据形成透明圈的面积,检测中华水蛇血清PLIγ对3种蛇毒酶活的抑制活性;分别向小鼠皮下注射3种蛇毒粗毒,造成小鼠皮下出血形成血斑,注射天然血清与蛇毒混合溶液,比较出血斑的大小,从而证明中华水蛇天然PLIγ的广谱抗蛇毒作用。设计分别带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的上下游引物,对实验室前期构建的原核表达载体pET28c(+)-PLIγ进行扩增,从而得到全长为570 bp的PLIγ基因,经双酶切之后,连接至酵母表达载体p PICZαA上,转化至DH5α中进行扩增。设置参数1.5 KV,25μF,电转时间5 ms,将线性化后p PICZαA-PLIγ重组质粒,电转化至毕赤酵母GS115中,利用博来霉素筛选阳性克隆。提取阳性克隆酵母DNA,利用PCR进行鉴定。在30℃、250 rpm条件下,使用终浓度0.5%甲醇对筛选的转化子进行诱导,连续培养120 h,每隔24 h收集发酵液上清,western bolt使用anti-His抗体检测目的蛋白PLIγ表达效果,确定最佳诱导时间。采用镍柱亲和层析分离纯化PLIγ,SDS-PAGE检测纯度。使用琼脂糖平板法检测PLIγ对五步蛇毒粗毒酶活的抑制作用,测量透明圈直径,计算抑制率。利用小鼠皮下注射实验,对比血斑面积,检测PLIγ对五步蛇粗毒的出血毒性抑制效果。结果:在针对五步蛇毒和蝮蛇蛇毒的琼脂糖平板实验中,中华水蛇PLIγ实验组透明圈直径减小。在眼镜蛇粗毒组,中华水蛇PLIγ实验组与阳性对照组相比,透明圈直径无明显变化。在小鼠皮下注射实验中,注射中华水蛇PLIγ蛋白致使五步蛇毒和蝮蛇毒的造成的出血斑的面积减小。在眼镜蛇毒组,注射中华水蛇PLIγ蛋白使小鼠的存活时间延长0.5-1 h。成功从pET28c(+)-PLIγ质粒克隆得到目的基因,长度为570 bp,并经过双酶切构建p PICZαA-PLIγ重组质粒,经过测序发现PLIγ基因没有发生任何突变。重组质粒经Sca I酶线性化,成功电转至酵母GS115细胞中,在含博来霉素平板上长出菌落,PCR鉴定其为阳性转化子。甲醇诱导,取发酵液上清,通过western bolt检测到目的蛋白PLIγ的表达,在23 k Da左右处出现条带,并在培养时间为72 h时蛋白表达量最多。发酵液经亲和层析分离纯化后,SDS-PAGE检测得到单一PLIγ蛋白条带。琼脂糖活性平板实验中,PLIγ使透明圈面积减小,对五步蛇毒酶活的抑制效率为84%。五步蛇毒小鼠背部出血试验中,PLIγ显著改善血管破损症状,出血斑面积减小。结论:中华水蛇PLIγ对蛇毒粗毒的酶活性和出血毒性、神经毒性有较好抑制效果,具有广谱抗蛇毒作用。p PICZαA-PLIγ重组质粒在酵母GS115细胞中,可被甲醇诱导产生PLIγ蛋白,且对五步蛇毒的酶活及出血毒性表现出较好的抑制作用,但发酵条件有待进一步优化。

关键词： PLIγ 蛇毒PLA2 广谱抗蛇毒电转化酵母表达出血毒性

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

欢迎您,

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

欢迎您,

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：