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SARS冠状病毒N蛋白激活hfgl2凝血酶原酶基因的研究

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SARS冠状病毒N蛋白激活hfgl2凝血酶原酶基因的研究

作者：姚华宁华中科技大学

学位级别：硕士

目的鉴于纤维介素蛋白(fgl2)与严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)患者血栓形成有密切联系,本课题旨探索SARS冠状病毒结构蛋白与人纤维介素基因(hfgl2)的相互作用机制,为防治SARS提供新的靶点。方法从SARS... 详细信息

目的鉴于纤维介素蛋白(fgl2)与严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)患者血栓形成有密切联系,本课题旨探索SARS冠状病毒结构蛋白与人纤维介素基因(hfgl2)的相互作用机制,为防治SARS提供新的靶点。方法从SARS尸检病毒灭活肺组织中抽提RNA后制备cDNA,分别扩增SARS-CoV的N、M和S2全长基因序列,再分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1上。构建了SARS冠状病毒结构蛋白真核表达质粒pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-M和pcDNA3.1-S2。分别与hfgl2启动子荧光素酶报告基因质粒及β半乳糖苷酶基因质粒(β-Gal )共转染到CHO细胞,采用免疫组织化学鉴定病毒蛋白的表达。通过检测报告基因荧光素酶(LUC)及β半乳糖苷酶的表达活性,反映病毒蛋白对hfgl2启动子的转录激活作用。将一系列hfgl2启动子区5’端缺失而保留共同3’端的启动子虫荧光素酶报告基因质粒,与SARS冠状病毒蛋白真核表达质粒共转染CHO细胞,并检测各组细胞的相对荧光素酶活性,明确在病毒蛋白刺激下该基因5’端非编码区对转录激活起重要作用的转录调控序列。结果 1.通过酶切和核苷酸测序表明:目的片段成功克隆至pcDNA3.1,构建了SARS冠状病毒结构蛋白真核表达质粒pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-M和pcDNA3.1 -S2。免疫组织化学染色可见明显的CHO细胞胞浆棕染,说明N基因、M基因和S2基因的真核表达质粒构建成功,能够在蛋白水平表达。 2.通过与hfgl2启动子共转染实验表明:SARS冠状病毒膜(M)蛋白和刺突糖(S2)蛋白对hfgl2基因的激活与对照组无显著差异,而SARS冠状病毒核心(N)蛋白可激活hfgl2启动子,使其转染活性提高6倍。 3.通过与一系列hfgl2启动子区段共转染实验表明: 转染前三个质粒hfgl2p(-1334)LUC、hfgl2p(-997)LUC、hfgl2p(-816)LUC的细胞荧光素酶活性改变无显著差异,但转染hfgl2p(-468)LUC质粒的细胞荧光素酶的活性较前显著降低,说明在hfgl2基因启动子-816位至-468位(相对于翻译起始点)之间存在着SARS冠状病毒N蛋白激活该基因的调控序列。结论本研究成功构建SARS冠状病毒结构蛋白真核表达质粒,揭示了SARS冠状病毒N蛋白具有增强hfgl2基因转录活性的功能,明确了在SARS冠状病毒核心(N)蛋白作用下与该基因表达有关的调控序列,初步探讨了SARS-CoV与宿主基因间的相互作用,为进一步研究SARS冠状病毒的细胞信号传导途径奠定了基础。本研究的意义近来研究表明SARS患者的肺组织中有血栓形成[5]。根据血栓形成区fgl2基因的高表达现象,我们推测hfgl2基因参与SARS的炎性病变。本研究分别构建了SARS冠状病毒结构蛋白N、M和S2的真核表达质粒和hfgl2启动子荧光素酶报告基因质粒(hfgl2p-LUC)。将两者共转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,通过检测相对荧光素酶的活性,探讨SARS冠状病毒蛋白与宿主基因hfgl2的相互作用及其机制。将构建的一系列hfgl2启动子区段与SARS冠状病毒蛋白真核表达质粒共转染CHO细胞,并检测各组细胞的相对荧光素酶活性,探讨了在SARS冠状病毒核心(N)蛋白作用下与该基因表达有关的调控序列,也为下一步研究该基因表达有关的顺式作用元件及反式作用因子打下了基础。

关键词：凝血致活酶冠状病毒核蛋白质类基因表达调控严重急性呼吸综合征

缬沙坦和卡托普利对兔血管平滑肌细胞组织因子和组织因子途径抑制物表达及活性的影响

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中华心血管病杂志 2006年第10期34卷 922-928页

作者：黎娜朱文玲陈莲凤柯元南卫生部中日友好医院心内科北京1000029 北京协和医院心内科

目的观察氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)、血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂对血管平滑肌细胞组织因子(TF)和组织因子途径抑制物(TFPI)表达和活性的影响。方法采用组织贴块法培养兔主动脉平滑肌细胞,进行形态学和α-肌动蛋... 详细信息

目的观察氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)、血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂对血管平滑肌细胞组织因子(TF)和组织因子途径抑制物(TFPI)表达和活性的影响。方法采用组织贴块法培养兔主动脉平滑肌细胞,进行形态学和α-肌动蛋白(actin)免疫组化鉴定。在细胞水平,采用免疫组化、免疫荧光法检测 ox-LDL 和缬沙坦对 TF、TFPI 蛋白表达的影响,激光共聚焦法检测 ox-LDL 和缬沙坦对 TF 蛋白表达的影响,ELISA 法检测 ox-LDL、缬沙坦和卡托普利对 TF、TFPI抗原表达的影响,发色底物法检测 ox-LDL、缬沙坦和卡托普利对 TF 活性的影响,RT-PCR 检测 ox-LDL和缬沙坦对 TF mRNA 表达的影响。结果 ox-LDL 可增加兔血管平滑肌细胞 TF 抗原活性和 mRNA的表达,在 mRNA 水平调节 TF 的表达。ox-LDL 可降低兔血管平滑肌细胞 TFPI 抗原的表达。不同浓度的缬沙坦和卡托普利可明显减少 ox-LDL 刺激的平滑肌细胞 TF 抗原表达及活性,缬沙坦对 TF 表达的影响呈浓度依赖性,同时缬沙坦还可明显减少 ox-LDL 刺激的 TF mRNA 表达,证明缬沙坦在 mRNA水平上调节 TF 的表达。不同浓度的缬沙坦和卡托普利可增加 ox-LDL 刺激的血管平滑肌细胞 TFPI抗原的表达,缬沙坦对 TFPI 表达的影响呈浓度依赖性,该结果由 ELISA 法得出。结论本实验在细胞水平观察到 ox-LDL 对血管平滑肌细胞 TF 表达和活性有促进作用,血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂对其有抑制作用,但这两种药对 TFPI 的表达有促进作用。从一个新的角度说明这两种药对动脉粥样硬化斑块特别是斑块促凝性的影响,它们可能是通过部分调节 TF 和 TFPI 的表达水平而发挥作用的。

关键词：动脉硬化凝血致活酶血管紧张素转换酶抑制药血管紧张素受体拮抗剂

miR-19a对非小细胞肺癌细胞组织因子的调控作用及细胞增殖的影响

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肿瘤 2014年第9期34卷 803-810页

作者：卢彦霖祁慧薇粟波徐鑫唐亮张颉沈丽平季现秀辛灵艳范理宏同济大学附属上海市肺科医院肿瘤科上海200433 同济大学附属上海市肺科医院中心实验室上海200433 同济大学附属上海市肺科医院医务科上海200433

目的 :探讨微小RNA(microRNA,miRNA,miR)-19a对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)PC9细胞组织因子(tissue factor,TF)的调控作用及细胞增殖的影响。方法 :将hsa-miR-19a模拟物(hsa-miR-19a-mimic)、hsa-miR-19a抑制物(hsa-miR-19a-inhibitor)、hsa-miR阴性对照(hsa-miR-negative control,hsa-miR-NC)分别瞬时转染PC9细胞后,应用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中miR-19a的表达,CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞的增殖情况,FCM法检测细胞周期的变化。利用生物信息学软件预测miR-19a的靶基因,通过荧光素酶报告基因检测系统和蛋白质印迹法对预测的潜在靶基因进行验证。结果 :Hsa-miR-19a-mimic转染组PC9细胞中miR-19a的表达水平明显高于空白对照组(只加脂质体)和阴性对照组(P酶报告基因检测提示,TF基因受miR-19a负调控。Hsa-miR-19a-mimic转染组TF蛋白的表达水平低于空白对照组和阴性对照组,hsa-miR-19a-inhibitor转染组则相反(P<0.01)。结论 :miR-19a可以调控TF的表达并抑制PC9细胞的体外增殖。

关键词：癌非小细胞肺微RNAs 凝血致活酶细胞增殖细胞周期

肺癌组织中凝血、纤溶成分过度表达对非小细胞肺癌预后的影响

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中华医学杂志 2007年第45期87卷 3228-3232页

作者：陈文慧王辰张予辉杨媛华赵宏颖张黎明首都医科大学附属北京朝阳医院北京呼吸疾病研究所100020 首都医科大学附属北京朝阳医院病理科 100020

目的探讨凝血系统成分组织因子(TF)、纤溶系统成分尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA),尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与NSCLC 微血管密度(MVD)、淋巴结转移、血管浸润及预后之间的关系。方法采用免... 详细信息

目的探讨凝血系统成分组织因子(TF)、纤溶系统成分尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA),尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与NSCLC 微血管密度(MVD)、淋巴结转移、血管浸润及预后之间的关系。方法采用免疫组织化学方法检测97例 NSCLC 组织和40例癌旁正常肺组织中 TF、uPA 及 uPAR 的表达。采用 t 检验、x^2检验和 Kaplan-Meier 生存曲线分析 TF、uPA、uPAR 表达与 MVD、淋巴结转移、血管浸润及预后之间的关系。结果 TF、uPA 和 uPAR 在 NSCLC 组织中广泛表达,阳性率分别为61.9%、58.8%和61.9%。癌旁正常肺组织中仅有少量巨噬细胞、纤维母细胞呈弱阳性表达。TF(34/47)、uPA(33/47)及 uPAR(39/47)表达均与淋巴结转移相关(x^2值分别为4.248、4.933、17.243,均 P致性(r=0.432,P<0.01)。TF 与uPAR 协同表达与淋巴结转移和血管浸润均明显相关(P<0.01)。TF、uPAR 及 TF-uPAR 阳性表达组患者中位生存时间较阴性组患者明显缩短。结论 TF 促进肿瘤微血管形成,uPAR 表达与淋巴结转移、血管浸润相关,二者协同表达可能影响 NSCLC 患者预后。

关键词：肺肿瘤凝血致活酶尿激酶型纤溶酶原激活物预后

止、凝血分子标志物监测在急性白血病诊治中的意义

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中华血液学杂志 2001年第3期22卷 141-144页

作者：吴方王学锋璩斌黄霞萍王鸿利上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液学研究所200025

目的　观察急性白血病 (AL)患者止、凝血分子标志物的变化以探索其在AL诊断、治疗及预后判断中的意义。方法　用ELISA法检测 82例AL患者血浆组织因子 (TF)、组织因子途径抑制物(TFPI)、凝血酶抗凝血酶复合物 (TAT)、尿激酶型纤溶酶原... 详细信息

目的　观察急性白血病 (AL)患者止、凝血分子标志物的变化以探索其在AL诊断、治疗及预后判断中的意义。方法　用ELISA法检测 82例AL患者血浆组织因子 (TF)、组织因子途径抑制物(TFPI)、凝血酶抗凝血酶复合物 (TAT)、尿激酶型纤溶酶原激活物 (u PA)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体 (u PAR)、纤溶酶抗纤溶酶复合物 (PAP)。结果　治疗前 ,AL患者TF、TAT、u PA、u PAR显著增高。急性髓系白血病 (AML)患者TFPI、PAP值异常增高。治疗后 ,TF、TAT在AML患者中维持高水平 ;u PA、u PAR在未缓解者持续增高 ;出血严重者PAP、u PA显著升高。结论　不同类型AL患者的止凝血功能异常存在差异 ,可随病情好转逐渐改善。TF、TAT、PAP有助于弥散性血管内凝血防治 ;u PA、u PAR可作为部分AML预后判断的指标。严重出血者需联合应用抗纤溶药。

关键词：急性白血病凝血致活酶纤维蛋白溶解止血分子凝血分子诊断治疗

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组织因子对大肠癌细胞侵袭及血行转移的影响

中华外科杂志 2005年第19期43卷 1265-1267页

作者：万远廉戎龙刘玉村姚宏伟汪欣吴涛潘义生朱静北京大学第一医院外科 100034

目的分析组织因子(TF)表达对人类大肠癌细胞侵袭和血行转移能力的影响。方法利用构建有正义/反义组织因子cDNA(TFcDNA)的质粒pcDNA3.1/Zeo,以脂质体法转染人类大肠癌细胞HT29细胞及LoVo细胞;转染成功的HT29细胞及LoVo细胞采用WesternBlo... 详细信息

目的分析组织因子(TF)表达对人类大肠癌细胞侵袭和血行转移能力的影响。方法利用构建有正义/反义组织因子cDNA(TFcDNA)的质粒pcDNA3.1/Zeo,以脂质体法转染人类大肠癌细胞HT29细胞及LoVo细胞;转染成功的HT29细胞及LoVo细胞采用WesternBlot检测TF表达水平,通过裸鼠皮下成瘤观察细胞体内侵袭能力的变化;通过建立裸鼠体内肺转移及肝转移模型观察细胞体内血行转移能力的变化。结果转染了正义TFcDNA的HT29细胞及LoVo细胞的TF表达水平较未转染的HT29细胞及LoVo细胞升高,转染了反义TFcDNA的HT29细胞及LoVo细胞的TF表达水平则降低;转染了正义TFcDNA的HT29细胞的体内侵袭能力较未转染的HT29细胞增强,转染了反义TFcDNA的HT29细胞的体内侵袭能力则减弱;转染了正义TFcDNA的LoVo细胞的体内血行转移能力较未转染的LoVo细胞增强,转染了反义TFcDNA的LoVo细胞的体内血行转移能力能力则减弱。结论TF可以促进人类大肠癌细胞的侵袭和血行转移的能力。

关键词：凝血致活酶肠肿瘤转染 HT-29细胞 Lovo细胞癌细胞侵袭大肠癌细胞血行转移组织因子 LoVo细胞

组织因子和组织因子途径抑制物1对无复流作用的实验研究

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中华心血管病杂志 2009年第12期37卷 1113-1118页

作者：骆景光陈韵岱田峰王长华吕媛杨秀秀吕树铮解放军总医院心内科北京100863 首都医科大学附属北京安贞医院心内科

目的观察缺血再灌注时兔心肌组织和血浆中组织因子（TF）和组织因子途径抑制物1（TFPI-1）水平的变化，研究外源性TFPI-1对无复流严重程度的影响，探讨TF激活的外源性凝血系统及TFPI-1抑制途径在无复流发病过程中的作用。方法40只新西... 详细信息

目的观察缺血再灌注时兔心肌组织和血浆中组织因子（TF）和组织因子途径抑制物1（TFPI-1）水平的变化，研究外源性TFPI-1对无复流严重程度的影响，探讨TF激活的外源性凝血系统及TFPI-1抑制途径在无复流发病过程中的作用。方法40只新西兰大白兔随机分为4组（每组10只）：缺血再灌注组（IR组，结扎回旋支120min，再灌注60min）、缺血再灌注TFPI-1组（TFPI-1组，再灌注时rTFPI-1 100ng／kg静脉注射，1ng·kg^-1·min。静脉滴注）、缺血组（结扎回旋支180min）和假手术组，每组10只。用硫磺素S和Evan’s蓝活体染色区分无复流区和缺血区。无复流严重程度用无复流面积／缺血面积表示。用逆转录-聚合酶链反应方法测定无复流区、缺血区及正常区心肌组织TF和TFPI-1mRNA表达水平，ELISA方法测定开胸前、冠状动脉结扎前即刻及结扎120min、再灌注10和60min血浆TF和TFPI-1水平。结果开胸前、冠状动脉结扎前即刻及结扎120min，各组血浆TF、TFPI-1水平差异无统计学意义（P〉0．05）；再灌注10和60min时，IR组血浆TF水平均显著高于缺血组和假手术组[10min：（20．7±4．1）pg／ml比（13．9±2．2）pg／ml（P〈0．001），（20．7±4．1）pg／ml比（13．2±2．6）pg／ml（P〈0．001）；60min：（15．8±2．6）pg／ml比（13．5±1．6）pg／ml（P〈0．05），（15．8±2．6）pg／ml比（12．1±0．7）pg／ml（P〈0．001）]。再灌注10min时，IR组血浆TFPI-1水平较缺血组及假手术组无明显变化（P〉0．05）；60min时，血浆TFPI-1水平[（9．7±1．6）ng／m1]反而显著低于缺血组[（11．6±1．6）．g／ml，P〈0．05]及假手术组[（10．1±1．3）．g／ml，P〈0．01]。IR组无复流区心肌组织TFmRNA表达高于缺血组及假手术组（P〈0．05或P〈0．001）；TFPI-1mRNA表达较缺血组无明显变化（P〉0．05）。TFPI-1组无复流严重程度明显低于IR组（0．39±0．11比0．54±0．06，P〈0．01）。结论无复流区心肌组织TF转录水平及再灌注过程中TF血浆蛋白水平表达明显上调；而无复流区心肌组织TFPI-1转录水平无明显变化，再灌注过程中血浆蛋白水平反而相对降低；外源性rTFPI-1可以减轻无复流严重程度。TF激活的外源凝血途径在无复流发病过程中起到重要作用。

关键词：心肌再灌注损伤凝血致活酶无复流

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组织因子对胃癌细胞生物学行为的影响

肿瘤 2014年第9期34卷 811-816页

作者：王东旭张靖苏玲周舒頔中国人民解放军第254医院消化内科天津300142 中国人民解放军第254医院特诊科天津300142

目的 :探讨组织因子(tissue factor,TF)对胃癌SGC7901和MKN45细胞生物学行为的影响。方法 :分别构建反义表达TF和正义表达TF的重组载体pcDNA3.1-antisense TF和pcDNA3.1-sense TF,采用脂质体转染法转入高表达TF的胃癌SGC7901细胞和不表... 详细信息

目的 :探讨组织因子(tissue factor,TF)对胃癌SGC7901和MKN45细胞生物学行为的影响。方法 :分别构建反义表达TF和正义表达TF的重组载体pcDNA3.1-antisense TF和pcDNA3.1-sense TF,采用脂质体转染法转入高表达TF的胃癌SGC7901细胞和不表达TF的MKN45细胞中。分别采用MTT法、FCM法及Transwell小室法,观察抑制或过表达TF对胃癌细胞生长、细胞周期分布及侵袭能力的影响。结果 :转染反义表达TF的重组载体后,SGC7901细胞中TF的表达被抑制,与亲本细胞及转染空载体细胞相比,细胞增殖能力明显下降(P<0.05),增殖指数(proliferation index,PI)由亲本细胞的0.357下降至0.286,同时穿过人工基质胶的细胞数目明显减少(P<0.01);而不表达TF的MKN45细胞转染了正义表达TF的重组载体后,与亲本细胞和转染空载体细胞相比,其增殖能力明显增高(P<0.05),PI值由亲本细胞的0.277上升至0.366,同时细胞的侵袭能力明显增加(P<0.01)。结论 :TF可能是一种与胃癌细胞增殖和侵袭相关的调控因子。

关键词：胃肿瘤凝血致活酶细胞增殖细胞运动

组织因子在子宫颈病变过程中的表达及其与瘤内血管生成的关系

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实用肿瘤杂志 2009年第4期24卷 349-352页

作者：李青陈陆俊谈炎虞华明鲁常青陈同钰樊祥山常州市第一人民医院病理科江苏常州213003 常州市第一人民医院综合实验室江苏常州213003 南京市鼓楼医院病理科江苏南京210008

目的通过检测子宫颈上皮内瘤变和子宫颈鳞状细胞癌组织中组织因子表达和微血管分布,探讨组织因子在子宫颈病变过程中表达水平的变化及与瘤内血管生成的关系。方法采用组织芯片技术和免疫组织化学方法,分别检测子宫颈上皮内瘤变和子宫颈... 详细信息

目的通过检测子宫颈上皮内瘤变和子宫颈鳞状细胞癌组织中组织因子表达和微血管分布,探讨组织因子在子宫颈病变过程中表达水平的变化及与瘤内血管生成的关系。方法采用组织芯片技术和免疫组织化学方法,分别检测子宫颈上皮内瘤变和子宫颈鳞状细胞癌组织中组织因子的表达和微血管分布。结果组织因子在正常子宫颈组织中均不表达,而在子宫颈病变过程中其表达水平显著上调(P<0.0001),瘤内微血管密度亦显著增加(P<0.0001);同时,子宫颈病变过程中组织因子的表达水平和瘤内微血管密度呈显著正相关(r=0.3705,P<0.0001),和患者年龄无关(P=0.7089)。结论组织因子参与子宫颈癌的发生与发展,并促进瘤内微血管形成,可作为一个潜在的子宫颈癌诊断和治疗的分子靶标并应用于临床。

关键词：宫颈肿瘤/病理学凝血致活酶宫颈肿瘤/血液供给癌,鳞状细胞/血液供给免疫组织化学新生血管化,病理性芯片分析技术