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幽门螺杆菌BabA2／UreI融合基因减毒伤寒沙门菌重组活载体疫苗的构建与鉴定

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中华消化杂志 2009年第9期29卷 564-567页

作者：刘东升周南进谢勇胡思隽曹俊吕农华南昌大学第一附属医院消化研究所、江西省消化疾病研究重点实验室 330006 江西省医学科学研究所江西九江学院医学院

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）由于其高感染率和高危害性成为众多科技工作者的研究重点。减毒伤寒沙门菌是近年发展起来的新型疫苗抗原投送系统，已经构建出许多应用于不同疾病的单价、双价或多价疫苗[1-4]，取得了很多令人鼓... 详细信息

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）由于其高感染率和高危害性成为众多科技工作者的研究重点。减毒伤寒沙门菌是近年发展起来的新型疫苗抗原投送系统，已经构建出许多应用于不同疾病的单价、双价或多价疫苗[1-4]，取得了很多令人鼓舞的成果。本研究拟采用平衡致死系统构建表达Hp粘附素BabA2基因和尿素通道蛋白UreI基因的减毒伤寒沙门菌疫苗株，为进一步探索其体内的免疫作用奠定基础。

关键词：减毒伤寒沙门菌 BabA2基因幽门螺杆菌融合基因活载体疫苗平衡致死系统鉴定重组

含体内激活启动子的重组减毒鼠伤寒沙门菌诱导转基因鼠细胞免疫应答(英文)

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生物化学与生物物理学报 2003年第8期35卷 695-701页

作者：王宏卫张珉栾洁胡卫江赵平高军戚中田第二军医大学微生物教研室第二军医大学微生物教研室上海200433

以庚型肝炎病毒 (hepatitisGvirus ,HGV)转基因小鼠为模型 ,探讨逆转免疫耐受的方法及与HGV致病性的关系。首先采用鼠伤寒沙门菌pagC基因的启动子 (PpagC)为转录调控元件 ,构建宿主体内表达HGVNS3抗原的重组减毒鼠伤寒沙门菌 ,并口服接... 详细信息

以庚型肝炎病毒 (hepatitisGvirus ,HGV)转基因小鼠为模型 ,探讨逆转免疫耐受的方法及与HGV致病性的关系。首先采用鼠伤寒沙门菌pagC基因的启动子 (PpagC)为转录调控元件 ,构建宿主体内表达HGVNS3抗原的重组减毒鼠伤寒沙门菌 ,并口服接种免疫HGV转基因小鼠。结果证明对诱导转基因小鼠血清HGVNS3抗体无明显影响 ,但对小鼠血清HGV抗原含量、肝组织HGV抗原及HGVmRNA表达量有明显抑制作用。体外培养脾细胞表现出针对HGVNS3抗原的细胞免疫反应 ,并检测到Th1 型细胞因子IFN γ。过继转移实验证明T细胞可能是通过IFN γ介导的机制抑制转基因鼠体内HGV的表达及复制。组织病理学检查显示 ,转基因小鼠肝组织见淋巴细胞浸润等轻度炎性变。T细胞免疫耐受消除的结果提示 ,这种宿主体内激活目的抗原表达的口服疫苗有望成为治疗病毒性肝炎的新方法。

关键词：庚型肝炎病毒转基因小鼠 PpagC 减毒伤寒沙门菌免疫耐受过继转移

表达ureB/hlyE融合蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌预防幽门螺旋杆菌感染

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世界华人消化杂志 2005年第6期13卷 787-789页

作者：焦志勇陈旻湖朱森林李国庆胡品津广州市南方医科大学南方医院肿瘤科广东省广州市510515 中山大学附属第一医院消化内科广东省广州市510080

目的:建立表达幽门螺杆菌(H pylori)尿素酶B亚单位(UreB) 与血溶素E(hlyE)融合蛋白的减毒沙门疫苗菌,并利用H pylori小鼠感染模型,研究该疫苗菌对H pylori感染的免疫保护作用. 方法:利用分子克隆技术构建携带ureB/hlyE融合基因的重组原... 详细信息

目的:建立表达幽门螺杆菌(H pylori)尿素酶B亚单位(UreB) 与血溶素E(hlyE)融合蛋白的减毒沙门疫苗菌,并利用H pylori小鼠感染模型,研究该疫苗菌对H pylori感染的免疫保护作用. 方法:利用分子克隆技术构建携带ureB/hlyE融合基因的重组原核表达质粒pTrc99A—ureB/hlyE,经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列,并与GeneBank中相关序列进行同源性比较.pTrc99A—ureB/hlyE转化减毒伤寒沙门菌SL3261, 培养后筛选阳性菌落,抽提质粒进行PCR及酶切鉴定.表达的UreB/hlyE融合蛋白SDS—PAGE电泳和Western-blotting 进行鉴定,薄层扫描分析蛋白含量.实验小鼠随机分成4组, 分别灌胃给予生理盐水组、减毒鼠伤寒沙门菌SL3261组、携带pTrc99A—ureB的SL3261组、携带PTrc99A—ureB/hlyE 的SL3261组.免疫后4 wk,予H pylori 107 CFU/只进行攻击(生理盐水组不攻击).攻击4wk后处死动物,取胃组织分别行改良Giemsa染色及定量细菌培养,观察H pylori定植情况. 结果:核苷酸序列测定及同源性分析证实,原核表达质粒pTrc99A—ureB/hlyE中所含的H pylori—ureB及hlyE基因与GeneBank中的H pylori-ureB和hlyE基因同源性分别为97.42% (1 663/1 707)、99.78%(910/912).重组减毒沙门氏菌可表达约100 ku的融合蛋白UreB/hlyE,含量占全菌体蛋白含量的15%;表达的融合蛋白能与小鼠抗H pylori血清特异性反应,具有良好的免疫原性.动物实验证实,疫苗组同空白对照组和SL3261组相比,H pylori定植密度明显下降,有显著性差异(P菌对小鼠H pylori感染具有一定免疫预防作用,hlyE可以增强疫苗株的免疫保护效果.

关键词：融合蛋白幽门螺旋杆菌感染 pTrc99A-ureB/hlyE Western-blotting Hpylori SDS-PAGE电泳改良Giemsa染色 HPylori 重组原核表达质粒减毒鼠伤寒沙门菌减毒沙门疫苗菌尿素酶B亚单位减毒伤寒沙门菌核苷酸序列测定生理盐水组

鼠疫亚单位疫苗的制备及其在猕猴中的免疫保护作用评价——以减毒伤寒沙门氏菌为载体的鼠疫疫苗构建及初步评价

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鼠疫亚单位疫苗的制备及其在猕猴中的免疫保护作用评价——以减毒...

作者：王旺中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

第一部分鼠疫亚单位疫苗制备以及其在猕猴中的免疫保护评价目的:鼠疫是一种由鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis,以下简称鼠疫菌)引起的人畜共患烈性传染病,通常有腺型、肺型和败血症型三种,其传染性强、死亡率高、人类普遍易感,未经治... 详细信息

第一部分鼠疫亚单位疫苗制备以及其在猕猴中的免疫保护评价目的:鼠疫是一种由鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis,以下简称鼠疫菌)引起的人畜共患烈性传染病,通常有腺型、肺型和败血症型三种,其传染性强、死亡率高、人类普遍易感,未经治疗的腺鼠疫病死率达50%至70%,而肺鼠疫发病迅猛,并可以直接在人群中传播,如果治疗不及时,病死率可以达到100%。疫苗是阻断疾病传播的最有效方式,研制出一种安全有效的疫苗是鼠疫防治工作的重点与方向,可以更好的保障人民的生命安全。本实验力图在实验室已有工作的基础上,优化F和V两种蛋白的纯化方法,并找到猕猴在鼠疫亚单位疫苗免疫保护过程中的规律,探讨猕猴作为鼠疫疫苗动物模型的可行性。内容:简化实验方案,从鼠疫菌疫苗株EV76中纯化出天然的F1抗原,并通过克隆表达并用肠激酶切除标签获得了不带标签与天然序列完全相同的V抗原,利用此两种抗原制备亚单位疫苗,并用实验室在小动物实验中已筛选出的免疫方案对猕猴进行了免疫。猕猴共分SV1,SV2,EV76,佐剂空白对照四个组。在初次免疫的第21天加强免疫,并在第10周用鼠疫强毒株进行攻毒,密切观察两周后,解剖动物,观察其体内鼠疫菌存活情况。在免疫的第2,4,6,8,10,11,12周取猕猴血清,测量其血清中的抗体产生情况及血清中细胞因子的分泌情况。方法:采用玻璃珠处理、饱和硫酸铵沉淀和分子筛过滤相结合的方案,从鼠疫菌减毒活疫苗株EV76的培养上清中提取天然的F1抗原。根据已知的lcrV核苷酸序列,避开LcrV抗原产生免疫抑制作用的区段设计引物,克隆表达rV270抗原。表达产物先后经过Co2+亲和层析和Sephacryl S-200 HR凝胶柱纯化,并在纯化过程中应用肠激酶切除His标签。纯化的蛋白用免疫印迹法、N-末端测序、质谱肽图鉴定其性质和纯度。使用氢氧化铝佐剂分别吸附两种抗原后免疫猕猴,使用ELISA方法,测血清中抗体的产生情况和细胞因子的分泌情况。结果:通过SDS-PAGE电泳及WB实验验证,简化方案纯化出的F1蛋白纯度高且具有很好的免疫原性,经肠激酶酶切除掉His标签获得的rV270抗原,通过N-末端测序、质谱测序等方法鉴定其序列正确。利用这两种抗原制备了亚单位疫苗,免疫猕猴发现配制的亚单位疫苗可使动物产生较高的抗体滴度和并具有良好的免疫保护作用。结论:本实验获得了一种简化的从鼠疫中大量纯化天然F1抗原的方法;并通过肠激酶酶切的方法获得了完全不带标签并且无免疫抑制活性的rV270抗原;通过观察猕猴对鼠疫菌感染的敏感性和攻毒后的发病情况,在评价猕猴作为鼠疫动物模型可行性的同时,也得到了亚单位疫苗在类人灵长类中免疫保护的珍贵资料。第二部分以减毒伤寒沙门氏菌为载体的鼠疫疫苗构建及初步评价目的:减毒沙门菌活疫苗是将抗原基因通过减毒的沙门菌这种载体进入体内诱导免疫应答。它的特点是组合了减毒活疫苗强有力的免疫原性和亚单位疫苗的准确度这两个优势。这种活载体疫苗的一个显著特点就是可以在体内有效的诱导细胞免疫。对鼠疫而言,鼠疫菌的在体内的最终清除依赖于机体的细胞免疫,因此这种活载体疫苗在鼠疫疫苗中有着非常光明的前景。本实验目的是构建一株能在体内稳定存在的产生良好免疫保护作用的安全性高的以鼠伤寒沙门菌减毒株为载体的鼠疫活疫苗。内容:本实验以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体构建鼠疫活疫苗,并鉴定了其抗原的表达和分泌情况,体外传代后检查质粒和片段在载体中的稳定性,疫苗接种小鼠检测了其免疫的安全性,并感染巨噬细胞,通过检测TNF-α的分泌来初步判定构建的减毒活疫苗在体内可能引起天然免疫和适应性免疫的能力。方法:利用克隆技术将V抗原的片段克隆进pYA248质粒,并通过化学转化和电转化的方法分步将质粒导入最终宿主菌。SDS-PAGE凝胶电泳和WB鉴定目的抗原的表达和分泌情况。免疫小鼠观察疫苗的安全性。通过感染RAW264.7细胞观察菌对巨噬细胞的激活作用。结果:以鼠伤寒沙门菌减毒株为载体构建了鼠疫活疫苗,初步的实验证明,结果证明构建的减毒鼠疫疫苗,能够在胞外分泌表达V抗原,并且体外传代实验发现质粒和片段在载体菌中可以存在,109cfu口服免疫小鼠安全性良好,感染RAW264.7后能有效激活巨噬细胞,并刺激其分泌大量的TNF-α, 结论:为了解决亚单位疫苗只能产生体液免疫的劣势,我们选用鼠伤寒沙门氏菌作为鼠疫活疫苗的载体,并成功获得了一株能稳定分泌V抗原的疫苗株,免疫小鼠可发现其安全性良好,并且刺激巨噬细胞后能使其大量分泌TNF-α。说明这株菌免疫原性良好,还需要后续实验来观察其在体内产生抗体及免疫保护作用。

关键词：亚单位疫苗猕猴免疫保护鼠疫减毒伤寒沙门菌鼠疫疫苗 V抗原融合PCR

利用减毒沙门菌递送的柯萨奇病毒A16型VP1基因重组质粒的构建和鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2011年第5期27卷 501-503页

作者：刘泽白冰珂高蓉蔡少平胡燕沈宏辉貌盼勇军医进修学院北京100853 解放军第302医院北京100039

目的:构建能够稳定携带柯萨奇病毒A16型(CoxA16)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌并鉴定目的抗原的表达,研发利用减毒沙门菌递送的口服疫苗。方法:利用DNA重组技术,构建表达CoxA16 VP1蛋白的真核表达质粒,体外转染Vero细胞后检测VP1蛋白表... 详细信息

目的:构建能够稳定携带柯萨奇病毒A16型(CoxA16)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌并鉴定目的抗原的表达,研发利用减毒沙门菌递送的口服疫苗。方法:利用DNA重组技术,构建表达CoxA16 VP1蛋白的真核表达质粒,体外转染Vero细胞后检测VP1蛋白表达情况及抗原活性,并将该质粒通过电转化构建重组减毒伤寒沙门菌。结果:构建了表达CoxA16 VP1蛋白的重组质粒,转染vero细胞后检测到CoxA16 VP1蛋白的表达并具有抗原活性;获得能稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌。结论:成功构建稳定携带柯萨奇病毒A16型(CoxA16)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌,为口服CoxA16疫苗的研究打下了基础。

关键词：柯萨奇病毒A16型口服DNA疫苗减毒伤寒沙门菌

口服携带Tip30与人IFN-γ基因减毒沙门菌治疗舌癌荷瘤裸鼠的实验研究

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上海口腔医学 2013年第1期22卷 13-18页

作者：江中明殷新民俞越缪亮危薇周延殷雪萌吴莹莹南京医科大学附属明基医院口腔科江苏南京210019

目的:观察口服携带HIV tip30与人IFN-γ基因减毒沙门菌(SL7207)基因治疗舌癌荷瘤裸鼠的疗效。方法:4周龄BALB/c雄性裸鼠25只,随机分为PBS对照组、单纯SL7207组、携带人IFN-γ基因SL7207-pCI-IFN治疗组、携带HIV tip30基因SL7207-pCI-ti... 详细信息

目的:观察口服携带HIV tip30与人IFN-γ基因减毒沙门菌(SL7207)基因治疗舌癌荷瘤裸鼠的疗效。方法:4周龄BALB/c雄性裸鼠25只,随机分为PBS对照组、单纯SL7207组、携带人IFN-γ基因SL7207-pCI-IFN治疗组、携带HIV tip30基因SL7207-pCI-tip30治疗组和同时携带HIV tip30与人IFN-γ基因SL7207-pCI-tip30/IFN联合治疗组5组。裸鼠下颌下区皮下接种人舌癌Tca8113细胞10 d后,口服相应治疗菌,每周1次,共3次。测定瘤体积及瘤重变化,计算抑瘤率,免疫组化检测肿瘤组织中IFN-γ、Tip30的表达,琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。采用SPSS15.0软件包对数据进行统计学分析。结果:肿瘤生长曲线、动物累积生存率及肿瘤抑瘤率指标均显示,PBS对照组肿瘤呈进行性生长;单纯SL7207组显示一定抑瘤效果(P菌的肿瘤组织内相应蛋白高表达。琼脂糖凝胶电泳分析发现,转tip30基因的肿瘤细胞基因组DNA表现出凋亡DNA"阶梯状"条带。结论:口服重组减毒沙门菌具有体内瘤体转基因的能力,而且可使同时携带的HIV tip30与人IFN-γ2个目的基因同时达到瘤体细胞内表达,发挥协同抗瘤作用,为舌癌的基因治疗提供了新的方法。

关键词： Tip30 γ干扰素舌癌减毒伤寒沙门菌基因治疗

减毒沙门菌承载的质粒DNA在小鼠体内的组织代谢与免疫应答

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减毒沙门菌承载的质粒DNA在小鼠体内的组织代谢与免疫应答

表达幽门螺杆菌NAP蛋白的减毒沙门疫苗菌株预防幽门螺杆菌感染

2009山东饲料科学技术交流大会

作者：方希修乐国伟王冬梅施用辉刘建文江南大学食品学院食品营养与安全研究所、江南大学工业生物技术教育部重点试验室江苏牧医学院营养与饲料研究所

研究外源质粒pcDNA3s被减毒伤寒沙门菌承载后在小鼠体内的组织分布与代谢,研究重组减毒鼠伤寒沙门菌的细胞免疫与体液免疫反应。将质粒pcDNA3s电转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗,分别灌胃饲服昆明种小鼠。通... 详细信息

研究外源质粒pcDNA3s被减毒伤寒沙门菌承载后在小鼠体内的组织分布与代谢,研究重组减毒鼠伤寒沙门菌的细胞免疫与体液免疫反应。将质粒pcDNA3s电转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗,分别灌胃饲服昆明种小鼠。通过PCR方法检测质粒pcDNA3s经口服进入小鼠体内后在各组织中的分布及随时间变化的情况;利用时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）检测小鼠的血清抗体含量,检测重组菌引起的T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应。口服后2周所有的组织均能检测到质粒,外源质粒在小鼠细胞内逐渐被清除;用流式细胞术检测贴壁培养的脾细胞中EGFP阳性率分别为19.20%和17.36%,口服免疫SL8786/pcDNA3s诱导产生了较强的特异性CTL应答。首次免疫后第2、5、8、11周分别测定血清中抗-HBs,口服免疫小鼠第11周的抗HBs含量最高。重组减毒鼠伤寒沙门菌是质粒的良好载体,是研究质粒代谢机制的有效途径,口服免疫途径均能在小鼠体内诱导细胞和体液免疫应答,可能是极具前景的乙型肝炎的治疗方法。

关键词：外源质粒减毒伤寒沙门菌组织代谢免疫应答

来源： cnki会议评论

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中国人兽共患病学报 2006年第7期22卷 629-632页

作者：焦志勇陈旻湖朱森林陈洁李国庆陈为胡品津中山大学附属第一医院广州510080

目的建立表达幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)中性粒细胞活化蛋白(Hp-NAP)的减毒沙门疫苗菌,并利用人类幽门螺杆菌感染的小鼠模型研究疫苗菌对Hp感染的免疫保护作用。方法利用分子克隆技术构建携带Hp-NAP基因的重组原核表达质粒pTrc9... 详细信息

目的建立表达幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)中性粒细胞活化蛋白(Hp-NAP)的减毒沙门疫苗菌,并利用人类幽门螺杆菌感染的小鼠模型研究疫苗菌对Hp感染的免疫保护作用。方法利用分子克隆技术构建携带Hp-NAP基因的重组原核表达质粒pTrc99A-NAP,经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列,并与美国国立医学图书馆基因文库中相关序列的同源性进行比较。重组质粒pTrc99A-NAP转化减毒伤寒沙门菌SL3261,培养后筛选阳性菌落,抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。表达的Hp-NAP蛋白用SDS-PAGE和West-blotting进行鉴定,用薄层扫描分析蛋白含量。C57BL/6小鼠随机分成4组,分别灌胃给予生理盐水(A组)、减毒鼠伤寒沙门菌SL3261(B组)、携带pTrc99A的SL326组(C组)、携带pTrc99A-NAP的SL326组重(D组)。免疫后4周,予Hp攻击,攻击菌量107CFU/只,灌胃2次,每日1次。攻击4周后处死动物,取胃组织分别行改良Giemsa染色及定量细菌培养,观察Hp定植情况。结果核苷酸序列测定及同源性分析证实,克隆的Hp-NAP基因与GenBank中相关序列的同源性为98%(397/402),氨基酸序列的同源性为98%(131/133)。pTrc99A-NAP转化的减毒沙门菌,可表达Mr约15000的Hp-NAP蛋白,表达量约占菌体蛋白量的37·5%;表达的新生蛋白能与小鼠抗Hp血清特异性反应,具有良好的免疫原性。同空白对照组、SL3261组和SL3261(pTrc99A)组相比,表达Hp-NAP的疫苗株组实验动物的胃组织Hp定植密度明显下降(P减毒沙门疫苗菌;重组疫苗菌对小鼠Hp感染具有一定免疫预防作用,可作为未来多组分重组减毒沙门疫苗菌的侯选菌株之一。

关键词：幽门螺杆菌 Hp-NAP 减毒伤寒沙门菌疫苗免疫

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幽门螺杆菌疫苗研究现状

中国实用内科杂志 2006年第24期26卷 1928-1930页

作者：张亚历白杨南方医科大学南方医院消化病研究所

接种疫苗通常被认为是预防和治疗幽门螺杆菌(Hp)感染及其相关疾病最有效的方法.因此,Hp疫苗可以是:(1)预防性的,也就是在感染Hp前给予疫苗.(2)治疗性的,即在感染Hp后,给予疫苗,这样做的目的是减少Hp感染定植的数量甚至根除Hp感染.至今... 详细信息

接种疫苗通常被认为是预防和治疗幽门螺杆菌(Hp)感染及其相关疾病最有效的方法.因此,Hp疫苗可以是:(1)预防性的,也就是在感染Hp前给予疫苗.(2)治疗性的,即在感染Hp后,给予疫苗,这样做的目的是减少Hp感染定植的数量甚至根除Hp感染.至今已在免疫途径、剂型(抗原和佐剂等方面)的选择、疫苗筛选评价平台、疫苗免疫机制等方面进行了广泛而深入的研究.本文就Hp疫苗的研究现状从以上方面作一综述.

关键词：黏膜佐剂小鼠免疫防治小家鼠疫苗抗原 Hp 评价平台减毒伤寒沙门菌保护性免疫抗原蛋白研究现状