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肺癌特异性结合多肽的体外筛选和鉴定

中国药理学通报 2013年第3期29卷 342-346页

作者：潘雪刁何冰王桂香刘金泳曹成明臧林泉广东药学院药科学院药理系广东广州510006 广东药学院药科学院新药筛选与药效学评价中心广东广州510006 广东药学院广东省分子流行病学重点实验室广东广州510310

目的应用噬菌体随机肽库技术筛选出与肺癌细胞特异性结合的多肽。方法以人肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,人胚肺细胞MRC-5为吸附细胞,对噬菌体随机12肽库进行3轮全细胞减性筛选后,随机挑取噬菌体克隆进行ELISA鉴定;对亲和力较高的阳性克隆... 详细信息

目的应用噬菌体随机肽库技术筛选出与肺癌细胞特异性结合的多肽。方法以人肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,人胚肺细胞MRC-5为吸附细胞,对噬菌体随机12肽库进行3轮全细胞减性筛选后,随机挑取噬菌体克隆进行ELISA鉴定;对亲和力较高的阳性克隆进行DNA测序并翻译为氨基酸序列;化学合成异硫氰酸荧光素标记的多肽(FITC-ZS-5),采用细胞和组织免疫荧光法鉴定FITC-ZS-5与肺癌细胞的亲和力及特异性。结果通过3轮减性筛选后,与NCI-H1299细胞结合的噬菌体克隆得到有效的富集;ELISA结果显示5号克隆对NCI-H1299细胞亲和力最高,将其命名为Phage ZS-5;测序结果显示Phage ZS-5所表达的多肽序列在国内外均未见报道,细胞及组织免疫荧光实验结果显示FITC-ZS-5对肺癌细胞及组织具有较高的亲和力和特异性。结论应用噬菌体随机肽库技术筛选到肺癌靶向性多肽ZS-5,为肺癌的靶向治疗和诊断奠定基础。

关键词：肺癌噬菌体展示技术多肽减性筛选 NCI-H1299细胞肽库

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肝癌特异性噬菌体多肽的筛选和初步鉴定

中华肝胆外科杂志 2009年第12期15卷 928-930页

作者：罗时敏臧林泉广州市第一人民医院综合外科 510180 广东药学院药科学院药理教研室广州510006

目的利用噬菌体展示肽库筛选与肝癌HepG2细胞特异性结合的多肽，为筛选及明确新的肝癌早期诊断和治疗标志物打下基础。方法以肝癌细胞HepG2为靶细胞，LO-2为吸附细胞，在37℃条件下对噬菌体随机12肽库进行多轮减性筛选，挑取单克隆扩增... 详细信息

目的利用噬菌体展示肽库筛选与肝癌HepG2细胞特异性结合的多肽，为筛选及明确新的肝癌早期诊断和治疗标志物打下基础。方法以肝癌细胞HepG2为靶细胞，LO-2为吸附细胞，在37℃条件下对噬菌体随机12肽库进行多轮减性筛选，挑取单克隆扩增并鉴定。利用ELISA初步鉴定克隆亲和力，测定阳性克隆DNA测序并进行同源性及氨基酸分析。结果经过3轮减性筛选发现，随机挑选的30个单克隆中，其中ZS-9对HepG2具有较高亲和力，氨基酸测序结果表明，该序列与美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBankDNA序列数据库和SwissProt蛋白数据库中的已知基因和蛋白无同源性，而且，国内外文献均未见报道，表明笔者筛选到一新的肝癌相关抗原的配体。结论利用噬菌体随机12肽库成功筛选到与肝癌细胞HepG2具有较高亲和力的多肽，为筛选鉴定新的肝癌特异的标志物奠定工作基础，也为肝癌的早期诊断和靶向治疗进一步研发确定了靶标。

关键词：癌,肝细胞噬菌体肽库多肽 HepG2 减性筛选

从噬菌体随机肽库中筛选及鉴定肺癌特异性多肽

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广东医学 2009年第4期30卷 524-527页

作者：邓伟雄罗时敏蓝代颜梁伟灿臧林泉广东省广州市第一人民医院综合外科 510180 广东省佛山市西樵山人民医院 528211 广东药学院药科学院药理教研室广州510006

目的利用Phage display随机肽库筛选出与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽,并通过ELISA和免疫组化鉴定其特异性和亲和力,为寻找肺癌早期诊断和治疗标志物打下基础。方法以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细... 详细信息

目的利用Phage display随机肽库筛选出与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽,并通过ELISA和免疫组化鉴定其特异性和亲和力,为寻找肺癌早期诊断和治疗标志物打下基础。方法以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,在37℃下对噬菌体随机十二肽库进行四轮减性筛选,挑取单克隆、扩增纯化噬菌体、并经ELISA初步鉴定噬菌体克隆亲和力;对阳性克隆提取质粒,测序后合成多肽,多肽标记荧光素FITC,以其在肺癌组织芯片上鉴定多肽的亲和力及特异性。结果经ELISA初步鉴定,随机挑选的18个单克隆中,其中3号对NCI-H1299亲和力最高,将其命名为PhageZL-3。细胞免疫荧光试验进一步证明,荧光素标记的多肽FITC-ZL-3对NCI-H1299具有高亲和力。结论利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞具有较高亲和力的多肽ZL-3,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础。

关键词：噬菌体肽库多肽肺癌 NCI—H1299 减性筛选

人食管癌细胞特异性结合肽的噬菌体肽库筛选及鉴定

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人食管癌细胞特异性结合肽的噬菌体肽库筛选及鉴定

作者：单雪吉林大学

学位级别：硕士

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，我国河南和山西是食管癌发病率和死亡率最高的地区，且呈不断上升趋势。食管癌起病隐匿，早期缺乏明显的临床症状，且早期筛查和教育指导没有得到根本的改善，故而患者出现症状时多为中晚期，预后差... 详细信息

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，我国河南和山西是食管癌发病率和死亡率最高的地区，且呈不断上升趋势。食管癌起病隐匿，早期缺乏明显的临床症状，且早期筛查和教育指导没有得到根本的改善，故而患者出现症状时多为中晚期，预后差，患者5年生存率仅10%左右。目前食管癌的治疗方式以手术、化疗、放疗为主，但单一的治疗方式难以达到良好的效果，复发率高，而手术、放化疗结合的综合治疗又因副作用大、效果不明显，在临床应用中未能得到普及。因此，寻求一种能够早期诊断和靶向性高的治疗方式成为一个新的方向。近几年来，肿瘤的生物治疗被广泛的研究和应用于临床，单克隆抗体制备的成功，成为生物治疗的一个重要研究方向。将单克隆抗体偶联的靶向药物准确地结合到肿瘤靶细胞的特异性分子上，从而发挥靶向治疗作用。因此，找到一种可以与食管癌细胞表面分子特异性结合的高亲和力配体作为载体，可有效筛查出早期食管癌患者，降低靶向治疗药物的毒副作用，提高肿瘤细胞局部的药物浓度，增强其在食管癌早期诊断和靶向治疗效果的临床价值。 1985年Smith提出噬菌体展示肽库技术的概念并在1990年由Huse成功的构建了第一个噬菌体组合文库，为肿瘤的早期诊断和靶向治疗提供了一个新的方法。利用噬菌体单链抗体分子量小、组织穿透性强、能够迅速到达靶抗原部位的特点，我们尝试构建人源性食管癌抗体文库，并对食管癌细胞株Eca109进行筛选。本实验旨在应用噬菌体随机肽库筛选出与食管癌细胞Eca109特异性结合的多肽，为食管癌的早期诊断、靶向治疗提供理论依据。本实验以人源食管癌细胞株Eca109为靶细胞，人正常食管上皮细胞为吸附细胞，对噬菌体随机十二肽库进行3轮减性筛选。体外筛选3轮后，随机挑取20个噬菌体克隆，采用细胞ELISA检测、免疫荧光染色方法鉴定阳性噬菌体克隆与食管癌细胞Eca109结合的特异性，排除假阳性或非特异性结合的噬菌体。再利用筛选得到的噬菌体阳性克隆对食管癌组织进行特异性结合实验，采用DAB染色技术证明其不与正常食管组织特异性结合。挑取能与食管癌细胞Eca109特异性结合的噬菌体阳性克隆的DNA并进行测序，进行氨基酸序列的同源性分析。本实验结果显示：经过3轮减性筛选，逐轮提高噬菌体阳性克隆的筛选标准，保持噬菌体投入量，回收量由2.1×10-8增至3.4×10-5，提高约103倍，说明噬菌体在食管癌靶细胞Eca109上出现了明显富集。从蓝斑中随机挑取20个噬菌体阳性克隆，经细胞ELISA检测证实，有9个噬菌体阳性克隆能与食管癌细胞Eca109特异性结合，其中有2个噬菌体阳性克隆只与食管癌靶细胞Eca109特异性结合，而不与正常食管上皮细胞结合。将这2个噬菌体阳性克隆分别与食管癌细胞Eca109进行细胞免疫荧光检测，进一步证实其能与食管癌靶细胞特异性结合，而不与正常食管上皮细胞结合。从这2个噬菌体阳性克隆分别与食管癌组织、正常食管组织结合后的DAB染色中，我们得到这2个噬菌体阳性克隆不与正常食管组织特异性结合。提取上述2个噬菌体阳性克隆的DNA，测序后分析结果显示：2个肽序列中非极性脂肪性氨基酸占41.67%，极性中性氨基酸占33.33%，氨基酸序列未见同源性。经BLAST分析可知，在已有的蛋白质数据库中未发现与这些短肽序列完全一致或有同源性的蛋白质分子。本实验利用噬菌体展示肽库技术，成功筛选出与食管癌细胞特异性结合的噬菌体。通过细胞ELISA和细胞免疫荧光检测鉴定出2个噬菌体阳性克隆对食管癌细胞Eca109有高度特异性和亲和力。DBA染色实验证实其不与正常食管组织特异性结合，经过提取2个噬菌体阳性克隆的DNA，测序后得到2个氨基酸序列，无同源性，BLAST分析该氨基酸序列与已有蛋白质数据库中的蛋白质分子未见一致性或同源性。本实验得到的2个噬菌体阳性克隆有可能成为抑制食管癌的靶向治疗的载体，需进一步合成噬菌体阳性克隆氨基酸序列编码的短肽，并应用到活体实验中，以证实其对食管癌细胞的特异性亲和力，为研制食管癌特异性靶向诊治的药物奠定实验基础。

关键词：噬菌体展示食管癌细胞减性筛选靶向治疗

基于特异性结合多肽ZS-1的肺癌新肿瘤标志物的筛选

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中国临床药理学与治疗学 2010年第12期15卷 1353-1357页

作者：王素军潘雪刁臧林泉王桂香石磊谢海棠广东药学院药科学院药理系皖南医学院弋矶山医院安徽省药物临床评价中心

目的:利用本实验室已获得的与肺癌特异性结合的十二肽ZS-1(EHMALTYPFRPP)从人类肺癌cDNA文库中筛选出肺癌相关标志物,并进行初步确认,为肺癌的临床早期诊断和靶向治疗奠定基础。方法:本实验以ZS-1为探针,通过将偶联生物素的多肽ZS-1固... 详细信息

目的:利用本实验室已获得的与肺癌特异性结合的十二肽ZS-1(EHMALTYPFRPP)从人类肺癌cDNA文库中筛选出肺癌相关标志物,并进行初步确认,为肺癌的临床早期诊断和靶向治疗奠定基础。方法:本实验以ZS-1为探针,通过将偶联生物素的多肽ZS-1固化在亲和素处理的酶标板,筛选人类肺癌cDNA噬菌体展示文库,经过三轮减性筛选后,挑取与ZS-1特异性结合的噬菌体单克隆、扩增、纯化,再通过PCR技术扩增、产物纯化后,进行DNA测序,测序结果经过生物信息学分析,随后采用组织芯片技术对相关生物大分子进行了检测。结果:通过生物信息学分析首次发现与ZS-1结合的肺癌细胞膜受体蛋白为KIAA1199,随后以KIAA199抗体检测人肺癌组织芯片证实,KIAA1199的阳性检出率为32.8%。结论:从人类肺癌cDNA噬菌体展示文库中筛选出潜在的肺癌肿瘤标志物KIAA1199,为肺癌的早期诊治奠定基础。

关键词：多肽ZS-1 cDNA文库减性筛选肺癌肿瘤标志物

噬菌体展示技术筛选乳腺癌血清肿瘤标志物的研究

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噬菌体展示技术筛选乳腺癌血清肿瘤标志物的研究

作者：贺文广西医科大学

学位级别：硕士

目的用噬菌体随机12肽库对乳腺癌患者血清进行差异性筛选,以获得乳腺癌特异性的新的肿瘤标志物。方法1.分别将正常人血清和乳腺癌患者血清用微孔板包被,在37℃条件下,对噬菌体随机12肽库运用减性筛选的方法进行筛选,先将噬菌体肽库与... 详细信息

目的用噬菌体随机12肽库对乳腺癌患者血清进行差异性筛选,以获得乳腺癌特异性的新的肿瘤标志物。方法1.分别将正常人血清和乳腺癌患者血清用微孔板包被,在37℃条件下,对噬菌体随机12肽库运用减性筛选的方法进行筛选,先将噬菌体肽库与正常人血清进行预吸附,然后将未结合的噬菌体再与乳腺癌患者血清进行吸附。以此重复筛选三次,获得重组噬菌体。2.挑取单个肉眼显色较好的噬菌斑进一步扩增,与筛选时的血清结合,鉴定(ELISA方法)其与乳腺癌血清的亲和力情况,选择稳定性和差异性较明显的噬菌体,再次扩大血清样本含量进行鉴定,最终得到特异性较高的单克隆噬菌体。3.将该单克隆噬菌体送DNA测序,并根据短肽的插入位点和氨基酸遗传密码表获得相应插入的短肽序列,并进行同源性分析。结果1.经过三轮筛选,噬菌体得率提高约1000倍。2.挑单个显色较好的噬菌体,经过反复鉴定后,得到两个特异性较好的噬菌体,经DNA测序发现其携带有相同DNA序列的特异短肽,均为QVSAEHKVQGFW.3.该特异的短肽序列与乳腺癌CA153(+)、CA153(-)血清相结合无显著差异性;与乳腺癌血清的结合率高于与宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、肝癌、结肠癌、非霍奇金淋巴瘤患者血清结合率。4.将特异性短肽(QVSAEHKVQGFW)输入美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上的GenBank DNA序列数据库中,和目前的己知基因和蛋白比对,发现并无同源性,且国内外文献均未见报道,因此可能是我们筛选到的一种新的乳腺癌相关抗原的配体。结论本研究利用噬菌体随机12肽库展示,成功筛选到能与乳腺癌相关抗原具有较高亲和力的短肽(QVSAEHKVQGFW),有可能成为诊断乳腺癌的有用血清肿瘤标志物。也为乳腺的癌早期诊断、联合检测和靶向治疗的进一步研究了候选靶标,具有一定的指导意义。

关键词：噬菌体肽库噬菌体展示技术多肽乳腺癌肿瘤标志物减性筛选

噬菌体随机肽库淘选肺癌细胞NCI-H1299特异性结合多肽

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中国药理学通报 2009年第3期25卷 300-304页

作者：石磊潘雪刁王军业潘琴巫玮金桂芳房思练侯炳忠何兴祥臧林泉广东药学院药科学院药理教研室广州广东510006 中山大学附属肿瘤医院广州广东510006 中山大学附属第六医院广州广东510006 中山大学附属第五医院广州广东510006 广东药学院临床医学院广州广东510006

目的利用噬菌体展示肽库筛选出与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽,鉴定其特异性和亲和力,为寻找肺癌早期诊断和治疗标志物打下基础。方法以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,在37℃下对噬菌体随机十二... 详细信息

目的利用噬菌体展示肽库筛选出与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽,鉴定其特异性和亲和力,为寻找肺癌早期诊断和治疗标志物打下基础。方法以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,在37℃下对噬菌体随机十二肽库进行三轮减性筛选,挑取单克隆ELISA初步鉴定噬菌体克隆亲和力;阳性克隆提取质粒,测序后合成多肽,鉴定多肽的亲和力及特异性。结果经ELISA初步鉴定,随机挑选的20个单克隆中,其中6号对NCI-H1299亲和力最高,将其命名为PhageZS6。细胞免疫荧光试验进一步证明,合成的相应多肽FITCZS6对NCI-H1299具有高亲和力。结论利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞具有较高亲和力的多肽ZS6,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础。

关键词：噬菌体肽库多肽肺癌 NCI—H1299 减性筛选

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乳腺癌干细胞新型多肽标志物的筛选

现代肿瘤医学 2020年第11期28卷 1834-1838页

作者：刘婷婷马腾刘焱宋璐李宝江泰安市中心医院乳腺外科山东泰安271000

目的:从噬菌体随机十二肽库中筛选出能够与乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell,BCSC)特异性结合的噬菌体,筛选后提取多肽以研究其与BCSC的亲和力和特异性。方法:通过"无血清-有血清"交替培养法培养人乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞系,... 详细信息

目的:从噬菌体随机十二肽库中筛选出能够与乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell,BCSC)特异性结合的噬菌体,筛选后提取多肽以研究其与BCSC的亲和力和特异性。方法:通过"无血清-有血清"交替培养法培养人乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞系,以求最大化富集BCSC,将hs578bst正常人乳腺细胞和普通培养的乳腺癌细胞用作减性筛选细胞,筛选噬菌体随机肽库;然后根据筛选结果选取阳性噬菌体进行单克隆扩增并测序,得到测序结果后依据合成多肽,标记以FITC;最后,建立乳腺癌动物模型,并在体外观察合成多肽与BCSC结合的特异性。结果:经过3轮筛选,噬菌体富集约200倍;随机选出10株单克隆噬菌体,与BCSC共同培养,其中与MCF7和MDA-MB-231乳腺癌干细胞阳性结合的噬菌体数目分别为6株和8株;分别从中选取1个阳性噬菌体进行测序,合成多肽后分别命名为A3和B8;多肽A3特异性结合MCF7乳腺癌干细胞,同时多肽B8特异结合MDA-MB-231乳腺癌干细胞。结论:噬菌体随机肽库可成功筛选出能够特异性结合BCSC的多肽,为BCSC的靶向治疗和进一步研究奠定了理论基础。

关键词：乳腺癌干细胞减性筛选噬菌体随机肽库多肽

噬菌体展示肽库在乳腺癌血清肿瘤标志物筛选中的应用

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山东医药 2013年第23期53卷 27-29页

作者：贺文曾健贺海平徐佳李富广西医科大学第一附属医院南宁530021 广西医科大学附属肿瘤医院

目的用噬菌体随机12肽库对乳腺癌患者的血清进行差异性筛选,以获得乳腺癌特异性的新的肿瘤标志物。方法对噬菌体随机12肽库进行三轮差异性筛选,用ELISA法测定噬菌体克隆对乳腺癌患者血清结合的特异性。结果经过三轮筛选,噬菌体富集率逐... 详细信息

目的用噬菌体随机12肽库对乳腺癌患者的血清进行差异性筛选,以获得乳腺癌特异性的新的肿瘤标志物。方法对噬菌体随机12肽库进行三轮差异性筛选,用ELISA法测定噬菌体克隆对乳腺癌患者血清结合的特异性。结果经过三轮筛选,噬菌体富集率逐轮递增,经47例乳腺癌患者和正常人血清的ELISA法检测验证,获得一株与乳腺癌患者血清特异较好的噬菌体,经DNA测序和推导,其短肽序列为短肽(QVSAEHKVQGFW)。结论成功筛选到能与乳腺癌患者血清高亲和力特异结合的12肽序列,为今后研究乳腺癌肿瘤标志物奠定了基础。

关键词：噬菌体肽库噬菌体展示技术多肽肿瘤标志物减性筛选