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归芍颗粒对大鼠肝损伤的保护作用及部分机制

归芍颗粒对大鼠肝损伤的保护作用及部分机制

作者：翟巧利安徽医科大学

学位级别：硕士

肝脏是人体内最大的实质器官,其结构和功能复杂,也是外源性物质及其代谢产物攻击的主要靶器官。机体短期接触较大剂量外源性物质可引起急性肝损伤(acute liver injury,ALI),在外来因素长期作用下,如果不能完全修复,可发展成慢性肝损伤... 详细信息

肝脏是人体内最大的实质器官,其结构和功能复杂,也是外源性物质及其代谢产物攻击的主要靶器官。机体短期接触较大剂量外源性物质可引起急性肝损伤(acute liver injury,ALI),在外来因素长期作用下,如果不能完全修复,可发展成慢性肝损伤。肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是各种慢性肝损伤的共有病理变化,其持续发展为肝硬化可引起肝功能衰竭甚至肝细胞癌,使得肝脏疾病成为人类发病和死亡的常见原因之一。已知多种致病原因可导致肝损伤,如病毒性肝炎、酒精性肝炎和药物性肝炎等。但目前肝损伤的发病机制尚未完全阐明,仍未发现十分确定、特效的药物,因此,深入研究肝损伤的发病机制,为临床寻找理想的抗肝损伤药物,尤其是抗纤维化的药物,具有重要的理论和临床意义。归芍颗粒(Guishao particle,GP)来源于陈士铎的《石室秘录》,此方通过疏柔并济法治疗肝病。GP由当归、白芍、栀子、甘草和金银花组成,其中君药当归的主要成分是阿魏酸和当归多糖,臣药白芍的主要成分是白芍总苷。课题组前期研究表明白芍总苷与当归提取物合用对四氯化碳carbon tetrachloride,CCl4)和D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)诱导的化学性肝损伤和卡介苗联合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的免疫性肝损伤均具有保护作用,同时可抑制肝细胞凋亡。因此,我们设想GP可能具有保护肝损伤的作用,值得进一步探讨。本研究以大鼠ALI模型和大鼠HF模型为研究对象,观察大鼠病理指标、生化指标、凋亡指标和凋亡相关蛋白在模型大鼠肝组织中的表达以及GP对大鼠ALI和HF的保护作用;同时探讨了GP对凋亡通路的调节和机制。目的：1利用D-GalN联合LPS给药诱导大鼠ALI模型,观察ALI大鼠病理指标、凋亡指标以及凋亡相关蛋白在模型大鼠肝组织中的表达,明确GP对大鼠ALI的保护作用及其部分机制。2利用CCl4诱导大鼠HF模型,观察HF大鼠病理指标、生化指标以及α-SMA在HF大鼠肝组织中的表达,明确GP对大鼠HF的保护作用及其部分机制。方法：1 SD大鼠腹腔注射D-GalN(50mg·ml-1)联合LPS(0.48μg·ml-1)建立大鼠ALI模型。造模成功后,将大鼠随机分为6个组别：正常组,模型组,GP(3.5g·kg-1,7g·kg-1, 14g·kg-1)治疗组,联苯双酯(Bifendate Pills,BP)(200mg·kg)阳性对照组,n=12。光镜下观察肝组织病理学变化,电镜下观察肝细胞的形态及结构;流式细胞仪(Flow cytometric method,FCM)检测肝细胞凋亡及对线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential,MTP);免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、B细胞淋巴瘤／白血病-2(B-cell leukemia/lymphoma 2,Bcl-2)蛋白的表达情况;酶标仪检测天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3)的活性;免疫印迹法(Western blot,WB)检测肝细胞胞质及线粒体内细胞色C(cytochrome C,Cyt C)的表达水平;逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)法检测肝脏中C/EBP同源蛋白质(C/EBP homologous protein, CHOP) mRNA的表达水平。2 SD大鼠背部皮下注射50% CCl4(灭菌橄榄油1：1稀释),1 ml·kg-1,每周2次制备HF模型。造模成功后,大鼠随机分为6组(n=15)：正常组、模型组、GP(3.5g·kg-1,7.0g·kg-1,14g·kg-1)治疗组和秋水仙碱(colchicine,Col) 0.1 mg·kg-1阳性对照组。测定大鼠肝脏指数;取部分肝组织做苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)和Masson染色;取大鼠腹主动脉血检测血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)的活性水平;放射免疫法检测大鼠血清中透明质酸(hyaluronic acid, HA)和层粘连蛋白(laminin, LN)的水平;酶标仪法检测大鼠肝组织中羟脯氨酸(hydroxyproline,HyP)的含量;IHC法检测肝脏中α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)的表达水平。结果：1 GP对D-GalN联合L

关键词：归芍颗粒急性肝损伤肝纤维化凋亡通路

唐古特白刺酰化花色苷提取分离及其改善阿霉素诱导小鼠急性心肝肾损伤的研究

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唐古特白刺酰化花色苷提取分离及其改善阿霉素诱导小鼠急性心肝肾...

作者：李冰陕西师范大学

学位级别：硕士

阿霉素是临床常用的一线化疗药物,用于治疗多种恶性肿瘤。然而阿霉素的临床应用在很大程度上受到非靶器官严重副作用的限制,造成心、肝和肾等多种脏器毒性。因此,开发降低阿霉素脏器毒性的天然产物具有重要意义。唐古特白刺(Nitraria ta... 详细信息

阿霉素是临床常用的一线化疗药物,用于治疗多种恶性肿瘤。然而阿霉素的临床应用在很大程度上受到非靶器官严重副作用的限制,造成心、肝和肾等多种脏器毒性。因此,开发降低阿霉素脏器毒性的天然产物具有重要意义。唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)为蒺藜科(Zygophyllaceae)植物,主要生长在海拔三千多米的青藏高原。其果实为浆果,药食同源,富含花色苷,现代药理研究表明唐古特白刺花色苷具有体内外抗氧化活性。本研究旨在优化唐古特白刺果实酰化花色苷的提取、分离工艺和分析方法,并研究唐古特白刺果实酰化花色苷对阿霉素诱导的小鼠急性心、肝和肾脏毒性的保护作用,进一步在分子水平上阐明其作用机制,为能够改善阿霉素诱导的心、肝和肾脏毒性的药物研究奠定一定的科学基础。主要研究内容和结果如下:1.提取是得到有效成分非常重要的一步,超声提取是提高生物活性成分得率的一种经济、有效和重复性好的技术。本实验在采用HPLC-MS/MS鉴定出唐古特白刺果实中六种酰化花色苷的基础上,采用响应面法优化了唐古特白刺果实中酰化花色苷的超声辅助提取工艺。最佳提取条件是:用70%甲醇提取32 min,提取温度70℃,在此条件下矢车菊素-3-O-(反式-对-香豆酰基)-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-(trans-p-coumaroyl)-diglucoside,MA)和总酰化花色苷(total acylated-anthocyanins,TA)的提取率分别为 80.37±2.66 mg/100 g 和 97.88±4.06 mg/100 g。2.筛选了 9种大孔树脂分离唐古特白刺酰化花色苷,静态和动态吸附结果表明,XDA-6大孔树脂可用于唐古特白刺酰化花色苷的制备,分离的酰化花色苷中矢车菊素-3-O-(反式-对-香豆酰基)-葡萄糖苷的含量(43.30 mg/g)是提取物(0.21 mg/g)的201.89倍,总酰化花色苷的含量从0.36 mg/g增加到了 56.44 mg/g。此外,与提取物和总花色苷的稳定性相比,分离的酰化花色苷中MA和TA的稳定性均有显著提高。3.建立了阿霉素诱导的小鼠急性心脏损伤动物模型,通过检测血清中心脏病理指标CK-MB和LDH的表达以及心脏组织病理切片研究唐古特白刺酰化花色苷对阿霉素诱导小鼠急性心脏损伤的保护作用。为了阐明唐古特白刺酰化花色苷对阿霉素诱导小鼠急性心脏损伤保护作用的机理,检测心脏组织匀浆中MDA、SOD、GSH、TNF-α和IL-1β的表达,进一步采用Western blot检测心脏组织中Bcl-2、Bax、caspase-9和caspase-3的表达。结果表明唐古特白刺酸化花色苷可以显著降低阿霉素诱导的小鼠血清中CK-MB和LDH的升高,缓解阿霉素诱导的心脏组织病理学损伤,并通过降低心脏中MDA、TNF-β和IL-lβ含量,升高GSH和SOD含量来抑制氧化应激和炎症。内凋亡通路蛋白研究表明,唐古特白刺果实酰化花色苷可上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,下调Bax/Bcl-2比值和促凋亡蛋白Bax、caspase-9和caspase-3的表达。因此,唐古特白刺果实酰化花色苷可通过调节氧化应激和内凋亡通路对阿霉素诱导的急性心脏损伤产生保护作用。4.建立了阿霉素诱导的小鼠急性肝肾损伤动物模型,通过检测血清中肝肾病理指标AST、ALT、BUN和Cr的表达以及肝肾组织病理切片研究唐古特白刺酰化花色苷对阿霉素诱导小鼠急性肝肾损伤的保护作用。为了阐明唐古特白刺酰化花色苷对阿霉素诱导小鼠急性肝肾损伤保护作用的机理,检测肝肾组织匀浆中MDA、SOD、GSH、TNF-β和IL-1β的表达,进一步采用Western blot检测肝肾组织中Bcl-2、Bax、caspase-9和caspase-3的表达。结果表明唐古特白刺酰化花色苷可以显著降低阿霉素诱导的小鼠血清中AST、ALT、BUN和Cr的升高,缓解阿霉素诱导的肝肾组织病理学损伤,并通过降低肝肾中MDA、TNF-β和IL-1β含量,升高GSH和SOD含量来抑制氧化应激和炎症。内凋亡通路蛋白研究表明,唐古特白刺果实酰化花色苷可上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,下调Bax/Bcl-2比值和促凋亡蛋白Bax、caspase-9和caspase-3的表达。因此,唐古特白刺果实酰化花色苷可通过调节氧化应激和内凋亡通路对阿霉素诱导的急性肝肾损伤产生保护作用。

关键词：唐古特白刺酰化花色苷阿霉素氧化应激凋亡通路

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维药没食子有效部位的抗辐射作用研究

维药没食子有效部位的抗辐射作用研究

作者：周言新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:用高分子材料MCI、ODS分离没食子丙酮提取物得到不同制备部位，比较没食子不同制备部位的有效成分总鞣质和没食子酸的含量，为筛选没食子有效部位对辐射防护作用的研究提供物质保障。选择有效成分含量高，干粉得率高的制备部位进... 详细信息

目的:用高分子材料MCI、ODS分离没食子丙酮提取物得到不同制备部位，比较没食子不同制备部位的有效成分总鞣质和没食子酸的含量，为筛选没食子有效部位对辐射防护作用的研究提供物质保障。选择有效成分含量高，干粉得率高的制备部位进行细胞学研究。利用现代生物学技术对没食子有效提取部位抗辐射作用进行研究和探讨，发现其可能的辐射防护机制。方法:1.以MCI为分离材料，采用甲醇-水系统对没食子丙酮提取物进行柱层析分离，再以ODS为分离材料，采用甲醇-水系统对没食子MCI提取物进行柱层析分离。以没食子酸为对照品，分别采用干酪素比色法和HPLC法测定没食子药材、没食子不同制备部位中总鞣质和没食子酸的含量。选择有效成分含量高、干粉得率高的制备部位进行细胞学实验。2.由于淋巴细胞对辐射反应极其敏感，所以采用8Gy X射线一次性照射人淋巴母细胞（AHH-1）构建辐射损伤模型，实验分组为阴性对照组、模型组、5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml没食子MCI提取物组，用MTT法筛选最佳辐射防护剂量。在此剂量用PI单染色法检测细胞周期，Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率，荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平，Western blot法考察介导细胞凋亡的线粒体途径和caspase-3家族等信号通路变化，影响细胞凋亡Bax、Bcl-2、caspase-3、JNK、ERK、p-ERK、p-JNK蛋白的表达。结果：1.不同提取部位没食子酸含量差异明显，其中以ODS水提部位含量最高达到54.6%，没食子药材含量为5.76%，ODS水提部位是没食子药材没食子酸含量的9.48倍。不同提取部位总鞣质含量（除ODS水提部位）均比没食子药材含量明显的增高，其中以MCI的40%甲醇最高为63.53%，没食子药材为42.85%。综合没食子酸和总鞣质含量测定结果，结合不同提取部位干粉得率情况，选择MCI的40%甲醇提取部位进行抗辐射活性细胞学研究。2.辐射可导致AHH-1大量凋亡。5μg/ml和25μg/ml没食子MCI提取物组能够提高X射线辐射AHH-1的存活率，以5μg/ml组效果最明显（P凋亡（P凋亡，大幅减少辐射产生的活性氧的作用。抗辐射作用机制可能与没食子MCI提取物抗氧化作用强，能维持细胞原有通路的平衡和稳定，降低辐射诱导线粒体释放细胞色素C和促细胞凋亡bax蛋白，抑制诱导凋亡的MAPK信号通路有关。研究证明没食子有效提取部位的确有较好的辐射防护作用，为开发新型天然辐射防护药奠定基础。

关键词：没食子没食子酸总鞣质没食子MCI提取物辐射防护细胞周期细胞凋亡活性氧凋亡通路

氰戊菊酯诱导雄性小鼠生殖细胞凋亡的分子机制探讨

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氰戊菊酯诱导雄性小鼠生殖细胞凋亡的分子机制探讨

作者：赵显锋安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:研究氰戊菊酯诱导的小鼠睾丸生殖细胞凋亡,探讨Fas/FasL信号通路和线粒体信号通路在氰戊菊酯诱导小鼠睾丸生殖细胞凋亡过程中的作用。方法:将36只SPF级6周龄雄性ICR小鼠随机分为对照组、氰戊菊酯低剂量暴露组和氰戊菊酯高剂量暴露... 详细信息

目的:研究氰戊菊酯诱导的小鼠睾丸生殖细胞凋亡,探讨Fas/FasL信号通路和线粒体信号通路在氰戊菊酯诱导小鼠睾丸生殖细胞凋亡过程中的作用。方法:将36只SPF级6周龄雄性ICR小鼠随机分为对照组、氰戊菊酯低剂量暴露组和氰戊菊酯高剂量暴露组。氰戊菊酯暴露组小鼠连续每天给予氰戊菊酯灌胃染毒(15 mg/kg或60 mg/kg,10 ml/kg,溶于玉米油),连续染毒28天,对照组小鼠灌胃等容量玉米油溶剂。末次染毒24 h后处死小鼠,取睾丸组织称重并进行组织病理学检查;用末端转移酶标记技术检测小鼠睾丸生殖细胞凋亡发生情况;用蛋白质免疫印迹法检测小鼠睾丸组织细胞凋亡信号通路相关蛋白的表达水平。结果:和对照组相比,氰戊菊酯不同剂量暴露组小鼠睾丸组织重量和睾丸系数均显著降低(P凋亡细胞数和凋亡细胞阳性生精小管百分率均显著升高(P凋亡主要发生在睾丸组织成熟期(VII–VIII期)生精小管和IX–XII期生精小管;蛋白质免疫印迹结果显示,和对照组相比,氰戊菊酯各剂量暴露组睾丸组织裂解型Caspase-3蛋白水平显著上调;进一步研究发现,睾丸组织Fas、FasL和裂解型Caspase-8蛋白水平显著上调,且呈剂量-效应关系;小鼠睾丸组织Bax、Bcl-2蛋白水平和对照组相比无明显变化;与对照组相比,氰戊菊酯暴露组小鼠睾丸胞质和线粒体Bax蛋白表达水平均未发生明显变化;线粒体和胞质细胞色素c(cytochrome c,Cyt c)水平也未见明显异常;氰戊菊酯暴露组睾丸组织裂解型Caspase-9蛋白水平与对照组相比亦无明显变化。结论:氰戊菊酯诱导小鼠睾丸生殖细胞凋亡;Fas/FasL信号通路介导氰戊菊酯诱导的小鼠睾丸生殖细胞凋亡发生。

关键词：氰戊菊酯睾丸生殖细胞凋亡通路小鼠

枸橼酸氯米芬抑制大鼠子宫内膜增殖及机制的研究

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枸橼酸氯米芬抑制大鼠子宫内膜增殖及机制的研究

作者：谷海昆明理工大学

学位级别：硕士

研究目的：枸橼酸氯米芬(克罗米芬,Clomiphene Citrate, CC)是临床上常用的微刺激方案中促排卵药物,由于其价格低廉,使用方便,排卵效果好等优点,目前仍是微刺激超排方案中的一线药物。CC可以抑制子宫内膜的增殖,降低子宫内膜厚度和子宫... 详细信息

研究目的：枸橼酸氯米芬(克罗米芬,Clomiphene Citrate, CC)是临床上常用的微刺激方案中促排卵药物,由于其价格低廉,使用方便,排卵效果好等优点,目前仍是微刺激超排方案中的一线药物。CC可以抑制子宫内膜的增殖,降低子宫内膜厚度和子宫内膜容受性,致使试管婴儿临床妊娠率降低、新生儿出生率偏低,但CC影响子宫内膜容增殖的分子机制至今尚未清楚。为了弄清CC如何通过抑制子宫内膜细胞增殖,以提高低刺激方案的临床成功率。本研究采用CC对雌性SD大鼠给药,然后我们用雌二醇(Estradiol, E2)来拮抗CC的抗雌激素作用,以期初步探讨CC对子宫内膜的影响机制,以及E2对CC的抗雌激素作用,缓解子宫内膜增殖障碍机制,为临床提高患者妊娠率提供相应依据。实验方法：本研究以220-250g体重的雌性SD大鼠为研究对象,对大鼠进行枸橼酸氯米芬灌胃给药,取其子宫内细胞做涂片染色,观察大鼠自然发情周期,在发情前期给药：枸橼酸氯米芬(Clomiphene Citrate, CC)、雌二醇(Estradiol, E2),0.9%生理盐水(Contral, CO),给药剂量分别为：CC:1mg/kg/body;E2:1 Omg/kg/body, CC组、CO组各5只,分别给药6天,Western Blot检测凋亡相关的PI3K/AKT、JNK、NF-κB、线粒体信号通路,以及雌激素受体mRNA转录水平的变化;CC+E2、CC、CO各组5只,分别给药10天,给药结束后提取子宫内膜组织总蛋白,Western Blot再次检测凋亡相关的PI3K/AKT、JNK、NF-κB以及线粒体信号通路相关蛋白表达。实验结果：CC给药组子宫内膜生长因子较对照组明显降低(P通路蛋白表达较CO组显著升高,经E2协同给药后,JNK、NF-κB信号通路蛋白较CC组没有显著性变化。ESR1、ESR2荧光定量PCR检测较CO组没有变化,发现ESR1的转录表达显著高于ESR2。结论：1.枸橼酸氯米芬能够降低子宫内膜厚度,影响子宫内膜容受性：2.枸橼酸氯米芬上调子宫内JNK、NF-κB蛋白磷酸化水平,同时下调了生长信号相关蛋白水平;3.CC能够促进子宫内膜细胞的凋亡,抑制子宫内膜增生,而E2+CC的协同给药能够缓解此种症状。其分子机制可能和PI3K、JNK、NF-κB等通路相关;4.CC具有抗雌激素药物效应,但并不影响雌激素受体RNA的转录表达。

关键词：枸橼酸氯米芬雌二醇子宫内膜增殖凋亡通路生长信号通路

新城疫病毒F3-HN的生物信息学分析、抗瘤功能初探及Caspase抑制剂对F3诱导ECA109细胞凋亡的影响

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新城疫病毒F3-HN的生物信息学分析、抗瘤功能初探及Caspase抑制剂...

作者：李冠华河北北方学院

学位级别：硕士

随着医疗水平的不断提高,癌症的治疗受到越来越多的关注,溶瘤病毒为肿瘤的治疗及治愈提供了一个新的视角。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是溶瘤病毒中的一员。研究发现,NDV在人类肿瘤细胞中的复制效率是正常细胞中的10000倍[... 详细信息

随着医疗水平的不断提高,癌症的治疗受到越来越多的关注,溶瘤病毒为肿瘤的治疗及治愈提供了一个新的视角。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是溶瘤病毒中的一员。研究发现,NDV在人类肿瘤细胞中的复制效率是正常细胞中的10000倍[1],其对肿瘤细胞的选择性杀伤作用使其成为潜在的肿瘤生物治疗因子。NDV为不分节段的单负链RNA病毒,属于副黏病毒科副黏病毒亚科的腮腺炎病属。主要受其感染的是禽类,可引起禽类呼吸道炎症,感染人类的概率极小,表现为轻微的结膜炎或温和的呼吸道症状,且为自限性疾病。已有研究结果提示,NDV溶瘤谱广且不良反应轻微,不同的NDV株系其抗肿瘤谱不同其抗肿瘤效果也不尽相同。在NDV外壳上的HN蛋白不仅可以识别唾液酸受体,而且还可以水解唾液酸受体,即它是一种同时具备两种功能的病毒刺突蛋白,在病毒吸附和感染细胞时发挥着重要作用。近年来随着RNA病毒基因工程的反向遗传学技术的不断完善,使得人们可以在c DNA水平上对病毒基因组进行改造和探索,我们实验室保存着一株抗肿瘤新城疫病毒NDV-HBNU/LSRC/F3,是具有强毒株裂解位点的NDV弱毒株。其抗肿瘤效果已被初步探索和证实,且也已经测定了其全基因组序列。研究F3的HN蛋白的结构和功能可以促进更好的认识和解读全病毒抗肿瘤等功能,同时继续探索F3诱导人食管癌ECA109细胞凋亡的信号通路。对更好掌握F3抗肿瘤机制,及更好的改造和发挥其抗肿瘤特性有着重要意义。HN基因及其编码蛋白Gen Bank的登录号分别为KC246549.1和AGL94562.1,首先利用蛋白质分析专家系统(Ex PASy)提供的Prot Param、protscale、TMpred、Coil、Motify Scan及SWISS-MODEL等,NCBI上的CONSERVE DOMON及SMART、Signal P4.0、Bepipred1.0及Net CTL等和Bcepred、ABCpred、SOPMA、SYFPEITHI等生物信息学在线分析程序,结合PSORT II Prediction、rasmol等生物信息学软件,分析、预测HN蛋白的主要特性及T/B细胞抗原表位等。提取F3的总RNA。据HN基因全长编码序列(登录号为KC246549.1)的开放阅读框架和载体C-flag pc DNA3的多克隆位点,设计带酶切位点的HN引物,两步法RT-PCR行目的片段的扩增,并将扩增产物克隆至真核表达载体C-flag pc DNA3的多克隆位点上,构建C-flag pc DNA3-F3/HN真核表达系统,重组质粒经细菌PCR、重组质粒双酶切、测序鉴定,将测序正确的重组质粒C-flag pc DNA3-F3/HN转染人食管癌ECA109细胞,转染后通过间接免疫荧光法和RT-PCR鉴定转染后细胞内HN蛋白和基因的表达,流式细胞仪测被重组质粒转染后肿瘤细胞的凋亡率。课题组前期研究已经证实NDV F3在体外诱导食管癌细胞凋亡时有caspase-8的激活,提示死亡受体途径可能在其诱导食管癌细胞凋亡中发挥着重要作用,因此我们在F3感染ECA109细胞后的36h内每隔4h收集细胞总蛋白一次,运用Western-blot法检测ECA109细胞被感染后细胞内的cleaved Caspase-3、cleaved PARP、FASL、FAS、FADD等蛋白的动态表达变化情况,来研究NDV F3体外诱导肿瘤细胞凋亡的信号通路中死亡受体途径变化情况,同时我们还运用全Caspase抑制剂Z-VAD-FMK观察抑制剂对NDVF3在体外诱导食管癌细胞凋亡的影响,以此观察Caspase依赖性凋亡途径在NDVF3体外诱导食管癌细胞凋亡中的作用。结果显示,扩增的HN基因约为1716bp,经序列分析该蛋白由571个氨基酸组成,分子式为C2766H4316N752O852S24,分子质量单位为62.5k Da,等电点理论值为6.24,HN蛋白富含无规则卷曲(Cc)和α-螺旋(Hh)的跨膜蛋白其主要定位在线粒体和胞质中,共有12个亲水性较高区域(参数得分≥1.9)、17个表面可及性较高区域(参数得分≥1.9)、9个柔韧性较高区域(参数得分≥2.0),36个翻译后修饰位点,17个潜在的B细胞表位,12个CTL表位和辅助性T细胞联合表位。将其克隆到C-flag pc DNA3载体的多克隆位点上后,测序结果经比对与Genbank上报告的HBNU/LSRC/F3株HN基因序列比对测序结果完全一致,将测序正确的重组质粒转染ECA109细胞,36h后转染重组质粒组的ECA109细胞胞质内可见黄绿色荧光,RT-PCR扩增到了HN的m RNA,而对照组则无,证明构建的重组质粒能在体外真核细胞内表达目的蛋白。经初步探索,重组质粒C-flag pc DNA3-F3/HN具有一定的抗肿瘤特性,转染48h时重组质粒组的ECA109细胞的凋亡率高于

关键词：新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶抗肿瘤凋亡通路半胱氨酸蛋白酶依赖性

陆生抑藻细菌分离鉴定及其对赤潮微藻米氏凯伦藻抑藻效果及机制研究

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陆生抑藻细菌分离鉴定及其对赤潮微藻米氏凯伦藻抑藻效果及机制研...

作者：郑宁宁曲阜师范大学

学位级别：硕士

有害赤潮暴发能够破坏海洋生态系统,对水环境、人类健康及各国经济构成严重威胁。寻找有效赤潮防治手段成为当前研究的重要方向。有研究已表明海洋环境中存在对赤潮微藻生长具有显著抑制作用的微生物,且在有害赤潮防治方面表现出较大潜... 详细信息

有害赤潮暴发能够破坏海洋生态系统,对水环境、人类健康及各国经济构成严重威胁。寻找有效赤潮防治手段成为当前研究的重要方向。有研究已表明海洋环境中存在对赤潮微藻生长具有显著抑制作用的微生物,且在有害赤潮防治方面表现出较大潜力。此背景下,本文从海水及河流入海口土壤中筛选对赤潮微藻米氏凯伦藻具有抑制效果的细菌,并探究其对米氏凯伦藻的生长抑制效果、抑制方式及抑制机理。主要研究结果如下:1、米氏凯伦藻抑藻细菌分离鉴定通过共培养实验,从海洋环境筛选到9株抑藻菌,从河口土壤筛选到5株抑藻菌,通过16S rRNA测序确定菌株种属信息,并构建系统发育树。其中,海洋环境筛选到的抑藻菌主要分布于海源菌属、盐单胞菌属、海杆菌属、副球菌属、红杆菌科、交替单胞菌属,48 h抑藻率可达58%-83%;土壤环境筛选到的抑藻菌主要分布于库克菌属、黄杆菌属、假交替单胞菌属,48 h抑藻率可达90%以上,且黄杆菌和假交替单胞菌皆以间接作用方式抑藻。2、假交替单胞菌胞外活性物质对米氏凯伦藻生长生理抑制机理(1)将假交替单胞菌无菌滤液与赤潮微藻米氏凯伦藻共培养,2%滤液体积下,藻细胞生长速度优于对照组,随着滤液体积增加,藻细胞生长受到抑制,4%滤液体积为“最低抑制浓度”,8%滤液体积为“饱和效应浓度”;并于倒置荧光显微镜下观察藻细胞数量及形态,发现随着滤液体积的增加及作用时间的延长,藻细胞逐渐破裂为细胞碎片,绿色荧光下呈现黄绿色。(2)通过流式细胞术检测藻细胞周期,发现4%滤液体积作用12 h,可将藻细胞周期阻滞在G2期;滤液体积增大至8%,藻细胞基因组DNA片段丢失,出现30%Sub-G1峰。因此推测滤液短时间、低浓度作用下,藻细胞周期被阻滞在G2期;长时间、高浓度作用下,藻细胞DNA片段丢失,可能发生藻细胞凋亡。(3)8%体积滤液胁迫下,藻细胞内活性氧累积,且作用3 h活性氧水平最高,荧光显微镜下观察到此时藻细胞完整呈现红色但形态发生不规则变化,作用6 h活性氧水平下降,此时藻细胞破裂呈现黄绿色。(4)不同体积滤液胁迫下,藻细胞内Caspase-3酶的活性增强,在6 h时活性达最高水平,外加活性氧抑制剂NAC后检测发现,藻细胞内Caspase-3酶活性显著降低,表明活性氧累积可激活Caspase-3酶活性。(5)流式细胞术检测表明,假交替单胞菌无菌滤液处理下,藻细胞发生凋亡,且随滤液增加,藻细胞凋亡率升高;此外,随着处理时间延长,凋亡率也随之增大。推测可能是Caspase-3酶的激活导致细胞凋亡发生,外加活性氧抑制剂NAC及Caspase-3酶抑制剂Ac-DEVD-CHO后,藻细胞凋亡率降低,表明ROS介导的Caspase-3酶依赖性凋亡通路参与了菌滤液所致藻细胞的凋亡。

关键词：赤潮米氏凯伦藻抑藻细菌周期阻滞凋亡通路

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急性肾功能不全中凋亡的作用

军事医学科学院院刊 2003年第2期27卷 147-149页

作者：李静高峻钰军事医学科学院附属医院北京100039

急性肾功能不全 (ARF)可单独由缺血和肾毒性损伤或联合作用引起。根据损伤的严重性不同 ,ARF可以引起肾小管细胞的凋亡或坏死。大量证据证明了凋亡在急性肾功能不全中的作用。胱冬肽酶是凋亡通路的介质之一 ,胱冬肽酶抑制剂改善了急性... 详细信息

急性肾功能不全 (ARF)可单独由缺血和肾毒性损伤或联合作用引起。根据损伤的严重性不同 ,ARF可以引起肾小管细胞的凋亡或坏死。大量证据证明了凋亡在急性肾功能不全中的作用。胱冬肽酶是凋亡通路的介质之一 ,胱冬肽酶抑制剂改善了急性肾功能不全 ;

关键词：急性肾功能不全细胞凋亡胱冬肽酶胱冬肽酶抑制剂凋亡通路

芦丁抑制大肠杆菌侵袭鸡肺Ⅱ型上皮细胞的作用机制研究

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芦丁抑制大肠杆菌侵袭鸡肺Ⅱ型上皮细胞的作用机制研究

作者：崔振强吉林大学

学位级别：硕士

鸡大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌的某些致病菌株引起的鸡的一种细菌性传染病。禽致病性大肠杆菌(APEC)往往会导致鸡鸭等禽类心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、败血症等症状,APEC感染时可通过破坏气-血屏障进入血液循环,最终导致败血症... 详细信息

鸡大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌的某些致病菌株引起的鸡的一种细菌性传染病。禽致病性大肠杆菌(APEC)往往会导致鸡鸭等禽类心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、败血症等症状,APEC感染时可通过破坏气-血屏障进入血液循环,最终导致败血症的发生。鸡肺Ⅱ型上皮细胞在维持气-血屏障功能方面具有重要的作用。先前实验室已对鸡肺Ⅱ型上皮细胞进行了分离纯化,通过碱性磷酸酶和电镜观察发现所获得的细胞具有上皮细胞的特点。为了进一步确定鸡肺Ⅱ型上皮细胞的纯度,我们采取流式细胞术和免疫荧光法,通过CD74、TTF1、CK19、CK18、Vimentin等特异抗体染色,来确定细胞纯度。流式细胞术检测发现,鸡肺Ⅱ型上皮细胞占分离细胞数的96%,成纤维细胞占有0.7%,非肺的杂细胞占2%左右。细胞免疫荧光检测发现,除Vimentin外,其他抗体染色均可见特异性的免疫荧光。细胞的高纯度为探讨芦丁抑制大肠杆菌侵袭鸡肺Ⅱ型上皮细胞作用机理奠定了基础。APEC含有许多毒力因子,包括铁摄取相关基因(Iuc D、fyu A),I型菌毛A(Fim A、Fim B、Fim C),卷曲菌毛A(Csg A、Csg B),外膜蛋白A(Omp A)等。这些毒力因子与细菌铁摄取、代谢、黏附和侵袭等密切相关。细菌胞外聚集的信号分子AI-2可以通过群体感应系统对毒力因子转录水平进行调控,影响细菌的致病性。因此,在细菌方面,主要探讨了芦丁对大肠杆菌群体感应系统的影响,结果发现用50μg/m L和25μg/m L芦丁处理APEC-O78 4h时,相关毒力基因(Rpos、H-NS、iuc D,fyu A,Csg A、Csg B、Flic、Lsr B、Lsr K、Luxs、Pfs)m RNA分泌水平显著下降(p通路、细胞凋亡、炎症应答紧密连接、细胞因子—细胞因子受体相互作用、Toll样受体等信号通路。CP II细胞预加药50μg/m L芦丁4h,再除去药物后感染APEC-O78 4h,通过分析比较感染APEC-O78组和加药组,共有222个表达差异显著的基因(P<0.05),其中上调基因有59个,下调基因有163个,芦丁可能通过调节鸡肺Ⅱ型上皮细胞的大肠杆菌感染、吞噬体、间隙连接以及糖酵解/糖异生、糖胺聚糖生物合成、磷酸戊糖途径等途径。综上所述,从细菌和细胞两个方面研究了芦丁抑制大肠杆菌侵袭鸡肺Ⅱ型上皮细胞的作用机理。在细菌方面,芦丁可以通过抑制AI-2的分泌而干扰群体感应系统,降低毒力基因的表达,从而抑制大肠杆菌对鸡肺II型上皮细胞的损伤。在细胞方面,转录组学分析显示,芦丁可能通过调节鸡肺Ⅱ型上皮细胞的大肠杆菌感染、吞噬体、间隙连接以及糖酵解等途径,抑制大肠杆菌所造成的损伤。这为芦丁在兽医学临床和其他生物学领域的应用奠定基础。

关键词：芦丁鸡肺Ⅱ型上皮细胞群体感应凋亡通路转录组测序