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肿瘤细胞与正常细胞对TRAIL凋亡耐受的机制研究

肿瘤细胞与正常细胞对TRAIL凋亡耐受的机制研究

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作者：彭琼昆明理工大学

学位级别：硕士

TNF相关的凋亡诱导配体("NF-related apoptosis inducing-ligand, TRAIL)是TNF超家族的新成员,它能诱导肿瘤和转化细胞凋亡而不伤害正常细胞组织,因此又称为肿瘤凋亡因子。TRAIL在癌症治疗领域中受到极大关注,然而大多数肿瘤细胞对TRAI... 详细信息

TNF相关的凋亡诱导配体("NF-related apoptosis inducing-ligand, TRAIL)是TNF超家族的新成员,它能诱导肿瘤和转化细胞凋亡而不伤害正常细胞组织,因此又称为肿瘤凋亡因子。TRAIL在癌症治疗领域中受到极大关注,然而大多数肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡耐受。研究显示不同的肿瘤细胞对TRAIL凋亡产生耐受的原因可能不尽相同,而TRAIL对正常细胞无毒害作用,它的机理是否与肿瘤细胞有所不同,目前尚无相关报道。TRAIL结合到相应的死亡受体上进而募集FADD和procaspase-8/-10促进DISC形成,DISC 上 procaspase-8/-10二聚化并自切割活化引发caspase级联活化,导致癌细胞的凋亡。TRAIL诱导的凋亡不依赖于p53的状态,不同于放疗和化疗诱导凋亡的机制,后两者主要涉及Bcl-2家族参与的线粒体途径的凋亡。因此,调节DISC水平上起始caspases的活化及执行caspases的活化可能是癌细胞TRAIL凋亡耐受的关键。c-FLIP 与 procaspase-8/-10含有类似的DED结构域,可通过竞争性结合到FADD的DED结构域上,抑制P rocaspase-8/10的活化及随后的凋亡。高水平的凋亡抑制蛋白IAPs直接结合并抑制caspase-3/-7/-9的活化进而导致癌细胞凋亡耐受。本课题首先对TRAIL对不同肿瘤细胞和正常细胞诱导凋亡的耐受机制进行基础性研究。以c-FLIP抑制剂Rocaglamide和IAPs泛拮抗剂AT 406联合活性的rhTRAIL蛋白处理不同的肿瘤细胞和正常细胞,并通过MTT法检测细胞的存活情况,初步了解各细胞可能的耐受原因。结果显示c-FLIP和IAPs是肿瘤细胞对TRAIL耐受的重要原因,其中相对敏感的HCT 116与相对耐受的U2-OS和SK-OV-3细胞在加入两种蛋白的抑制剂或拮抗剂后显示出对TRAIL更为敏感。而原代培养的正常细胞则无明显变化,排除c-FLIP和IAPs对TRAIL诱导正常细胞凋亡耐受的可能原因。此外,在人永生化的正常细胞明显对c-FLIP抑制剂诱导50%的死亡率及加强TRAIL的凋亡效应,暗示着原代的正常细胞和永生化的正常细胞有着不同的耐受机制。其次根据其中一种抑制蛋白c-FLIPs建立一个高通量抗癌特异药筛选的细胞模型。实际是基于TRAIL信号刺激下,c-FLIP 与 procaspase-8/-10竞争性结合到FADD上的蛋白-蛋白之间的相互作用来实现新药发现。具体通过PCR获取c-FLIPs全段序列后双酶切,将c-FLIPs插入到真核表达载体pEGFP-N2中,脂质体转染法使融合有荧光标记的c-FLIPs稳定表达于U2-OS中。通过采集细胞荧光成像,分析TRAIL给药前后的荧光分布变化,将能筛选具有死亡受体激动剂、调节剂或拮抗剂及c-FLIP拮抗剂的化合物。实验结果显示作为对照的空载体转染到U2-OS中,荧光分布在整个细胞,细胞正常分裂生长。而c-FLIPs-pEGFP-N2转染到细胞中,在没有死亡信号刺激下,荧光便发生聚集,培养数日细胞不能正常分裂生长甚至出现细胞死亡。对这些细胞不处理或处理以不同浓度的坏死抑制剂Necrostatin-1,培养数日后细胞仍然不能存活,荧光也随着培养时间的增加而减少直至不见。转染空载体的细胞能正常生长,说明载体及转染试剂对细胞基本无毒。c-FLIPs过量表达可能参与U2-OS细胞中的不利信号导致细胞死亡,具体机制原因还有待进一步研究。本课题通过研究肿瘤细胞和正常细胞对T RAIL凋亡耐受的机制,发现正常细胞和肿瘤细胞耐受机制并不相同。以对肿瘤细胞TRAIL凋亡耐受的蛋白如c-FLIP或IAPs为靶点治疗癌症,将是特异性治疗癌症的理想策略。本课题以研究较少的c-FLIP拮抗剂为重点,建立c-FLIP s特异抗癌药筛选模型,为解决肿瘤细胞对TRAIL的耐药性奠定了基础。

关键词： TRAIL DISC c-FLIP 凋亡耐受机制癌症治疗

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