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CIRP过表达和干扰慢病毒载体的构建与分析

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CIRP过表达和干扰慢病毒载体的构建与分析

作者：李玉恒黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

冷诱导rna结合蛋白(Cold inducible rna-binding Protein,CIRP)是Nishiyam H(1997)等从冷处理的BALB/3T3鼠成纤维细胞中分离和鉴定出的第一种哺乳动物冷休克蛋白，并发现降低温度可以使这种蛋白的表达升高，而升高温度则使其表达水平下... 详细信息

冷诱导rna结合蛋白(Cold inducible rna-binding Protein,CIRP)是Nishiyam H(1997)等从冷处理的BALB/3T3鼠成纤维细胞中分离和鉴定出的第一种哺乳动物冷休克蛋白，并发现降低温度可以使这种蛋白的表达升高，而升高温度则使其表达水平下降。近年来人们发现不论是在冷应激等各种应激条件下还是在低温治疗过程中CIRP都发挥着保护机体的积极作用。我们认为CIRP发挥作用的分子机制研究是揭示冷应激机理和亚低温治疗广泛推广的瓶颈。本研究构建了大鼠CIRP基因的rnai载体和CIRP过表达慢病毒载体，并进行了大鼠海马神经元的原代培养，为评估其在原代大鼠海马神经元中对CIRP基因的沉默和过表达效果奠定了基础。(1)首先构建CIRP的过表达载体：从4℃8小时冷处理的SD大鼠睾丸组织中获得CIRP基因的cDNA序列，利用常规分子克隆方法将其连接到入门载体pENTR-11上，获得入门克隆pENTR-11-CIRP。入门克隆pENTR-11-CIRP与目标载体pLenti6/V5-DEST发生Gateway技术的同源重组LR反应，获得CIRP过表达载体pLenti6/V5-CIRP。(2)构建CIRP的rnai干扰载体：利用软件设计并合成5对CIRP序列特异性pre-mirna双链，并将双链前体克隆到线性质粒表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR，获得5条干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-CIRP-131/264/405/645/707。(3)进行大鼠海马神经元的原代培养，为后期研究CIRP在神经细胞中的功能奠定了基础。实验结果： (1)成功构建CIRP基因的过表达克隆载体pLenti6/V5-CIRP。 (2)成功构建5条干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-CIRP-131/264/405/645/707。 (3)优化和改良了大鼠海马神经元的原代培养方法，为后期的实验研究奠定了技术平台。

关键词：冷诱导rna结合蛋白过表达载体干扰载体大鼠海马神经元的原代培养

CIRP、TGF-β1和MMP-9在不同类型慢性鼻窦炎中的表达及其与组织重塑的关系

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CIRP、TGF-β1和MMP-9在不同类型慢性鼻窦炎中的表达及其与组织重...

作者：蔡芳宇郑州大学

学位级别：硕士

研究目的探讨冷诱导 rna 结合蛋白（Cold-inducible rna-binding protein,CIRP）、转化生长因子β1（Transforming growth factor-β 1,TGF-β1）和基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinases-9,MMP-9）在不同类型的慢性鼻窦炎（Chronic rhinosinusitis,CRS）患者组织中的表达差异以及三者之间的相互关系,并分析CIRP、TGF-β1、MMP-9与CRS组织重塑之间的相关性。研究方法研究对象分为三组:慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）组、慢性鼻窦炎不伴鼻息肉（CRSsNP）组和对照组。选取2020年9月-2021年1月期间在郑州大学第一附属医院鼻科行鼻内镜下鼻窦手术的CRSwNP患者和CRSsNP患者各20例作为实验组,术中收集其筛窦黏膜和鼻息肉组织,同期行鼻内镜下上颌窦囊肿摘除术的上颌窦囊肿患者20例作为对照组,术中收集其钩突黏膜。采用HE染色、MT染色观察黏膜组织重塑情况;通过免疫组化法、实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）法检测组织中CIRP、TGF-β1和MMP-9的表达。三组间年龄分布比较用单因素方差分析,性别分布比较用卡方检验,多组间比较选用Kruskal-Wallis（K-W）检验,变量间相关关系用Pearson相关性分析,以P＜0.05-为差异有统计学意义。结果1 HE染色结果CRS中可见明显的组织重塑改变,CRSwNP组和CRSsNP组的黏膜组织病理改变特征不尽相同。2 马松染色结果胶原纤维被染成绿色,主要沉积于基底膜区和血管腺体附近。对三组间胶原表达情况进行比较,组间差异有统计学意义（H=31.740,P＜0.001）,两两比较显示:CRSsNP组的胶原表达升高,显著高于CRSwNP组（通过Bonferroni校正法调整显著性值,调整后P＜0.001）和对照组（通过Bonferroni校正法调整显著性值,调整后P=0.037）;CRSwNP组的胶原表达降低,显著低于对照组（通过Bonferroni校正法调整显著性值,调整后P=0.005）。3 免疫组化结果3.1 CIRP蛋白的表达CIRP蛋白在鼻窦黏膜中的表达主要位于细胞核和细胞质内。CRSwNP组中CIRP蛋白的表达升高,而在CRSsNP组中的表达无明显变化。三组间比较差异具有统计学意义（H=26.943,P＜0.001）;两两比较显示:CRSwNP组CIRP蛋白的表达显著高于CRSsNP组和对照组（通过Bonferroni校正法调整显著性值,调整后P值均＜0.001）,CRSsNP组中CIRP蛋白的表达量与对照组相比无显著性差异（通过Bonferroni校正法调整显著性值,调整后P=1.000）。3.2 TGF-β1蛋白的表达CRSsNP组、CRSwNP组和对照组的组织中均可见TGF-β1蛋白的表达,TGF-β1在鼻窦黏膜组织中的表达主要位于细胞质内。CRSsNP组中TGF-β1的表达升高,CRSwNP,组中TGF-β1的表达降低,该结果与qRT-PCR结果大致相符。组间比较差异有统计学意义（H=39.004,P＜0.001）,两两比较显示:CRSsNP组中TGF-β1的表达显著高于CRSwNP组（通过Bonferroni校正法调整显著性值,调整后P＜0.001）和对照组（通过Bonferroni校正法调整显著性值,调整后P=0.041）,CRSwNP组中TGF-β1的表达显著低于对照组（通过Bonferroni校正法调整显著性值,调整后P= 0.001）。3.3 MMP-9蛋白的表达CRSsNP组、CRSwNP组和对照组中均可见MMP-9蛋白的表达,其阳性表达主要位于细胞质中。CRSwNP组中MMP-9蛋白的表达升高,CRSsNP组中的表达无明显变化。组间比较差异有统计学意义（H=16.975,P＜0.001）,两两比较显示:CRSwNP组中MMP-9蛋白的表达显著高于对照组（通过Bonferroni校正法调整显著性值,调整后P＜0.001）,CRSsNP组中MMP-9蛋白的表达高于对照组,但差异无统计学意义（通过Bonferroni校正法调整显著性值,调整后P=0.100）,CRSwNP组MMP-9蛋白的表达高于CRSsNP组,但差异无统计学意义（通过Bonferroni校正法调整显著性值,调整后P=0.139）。4 qRT-PCR 结果4.1 CIRP的mrna的相对表达量三组间比较有显著性差异（H=94.800,P＜0.001）;经两两比较,CIRP的mrna的相对表达CRSwNP组显著高于对照组和CRSsNP组（通过Bonferroni校正法调整显著性值,调整后P值均＜0.001）,而CRSsNP组与对照组相比,差异无统

关键词：慢性鼻窦炎组织重塑冷诱导rna结合蛋白转化生长因子β1 基质金属蛋白酶9

CIRBP通过EndMT促进子宫内膜纤维化的初步研究

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CIRBP通过EndMT促进子宫内膜纤维化的初步研究

作者：许程程华中科技大学

学位级别：硕士

目的:研究采用双重损伤法是否能建立宫腔粘连(intrauterine adhesion,IUA)动物模型,并在动物模型中研究内皮间充质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)是否参与IUA纤维化进程。通过动物模型及细胞实验研究冷诱导rna结合... 详细信息

目的:研究采用双重损伤法是否能建立宫腔粘连(intrauterine adhesion,IUA)动物模型,并在动物模型中研究内皮间充质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)是否参与IUA纤维化进程。通过动物模型及细胞实验研究冷诱导rna结合蛋白(CIRBP)对EndMT的调控关系。方法:通过机械损伤联合感染损伤来建立IUA模型。为验证EndMT的存在,在动物模型中检测血小板和内皮细胞粘附分子1(CD31)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、EndMT转录因子Snail的定位及表达变化。为验证CIRBP对EndMT的调控,检测CIRBP、TGF-β1/Smad通路相关蛋白在动物模型中的表达变化;使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC),敲降CIRBP,随后检测EndMT相关标志物蛋白、Snail、TGF-β1/Smad通路相关蛋白的表达变化。结果:造模后腺体的数量显著减少(Prna明显降低(Prna和Vimentin m rna升高(P蛋白变化与m rna结果一致。造模后CIRBP的表达早期下降(P蛋白TGF-β1、Smad3、p-Smad3均在造模后出现表达升高(P诱导IUA动物模型;(2)EndMT促进肌成纤维细胞的增殖,进而促进IUA宫内膜纤维化;(3)CIRBP可通过TGF-β1/Smad信号通路来调节EndMT。

关键词：宫腔粘连纤维化内皮间充质转化冷诱导rna结合蛋白转化生长因子β1

急性脑梗死患者血清miR-106a-5p、NINJ1、CIRP水平及其临床意义

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检验医学与临床 2024年第10期21卷 1354-1359,1364页

作者：孙凤琴郭艳吉黄微云南省第三人民医院神经内科云南昆明650011

目的探讨急性脑梗死(ACI)患者血清微小核糖核酸-106a-5p(miR-106a-5p)、神经损伤诱导蛋白1(NINJ1)、冷诱导rna结合蛋白(CIRP)的水平及其临床意义。方法选择2022年1月至2023年6月该院神经内科收治的151例ACI患者作为ACI组,另选择同期65... 详细信息

目的探讨急性脑梗死(ACI)患者血清微小核糖核酸-106a-5p(miR-106a-5p)、神经损伤诱导蛋白1(NINJ1)、冷诱导rna结合蛋白(CIRP)的水平及其临床意义。方法选择2022年1月至2023年6月该院神经内科收治的151例ACI患者作为ACI组,另选择同期65例体检健康者作为对照组,根据静脉溶栓后90 d预后情况将ACI患者分为预后不良组和预后良好组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测血清miR-106a-5p水平,通过酶联免疫吸附试验检测NINJ1、CIRP水平。采用多因素Logistic回归分析影响ACI患者预后的因素,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-106a-5p、NINJ1、CIRP水平对ACI患者预后的预测价值。结果与对照组比较,ACI组血清miR-106a-5p、NINJ1、CIRP水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。随访90 d,151例ACI患者预后不良发生率为35.10%。与预后良好组比较,预后不良组年龄明显增大,美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分及血清miR-106a-5p、NINJ1、CIRP水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。年龄增加、NIHSS评分升高和血清miR-106a-5p、NINJ1、CIRP水平升高均为ACI患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)。血清miR-106a-5p、NINJ1、CIRP水平联合检测预测ACI患者预后不良的曲线下面积为0.937,大于血清miR-106a-5p、NINJ1、CIRP水平单独检测预测的0.777、0.773、0.778(P<0.05)。结论ACI患者血清miR-106a-5p、NINJ1、CIRP水平升高是预后不良的独立危险因素,血清miR-106a-5p、NINJ1、CIRP水平联合检测对ACI患者预后不良有较高的预测价值。

关键词：急性脑梗死微小核糖核酸-106a-5p 神经损伤诱导蛋白1 冷诱导rna结合蛋白预后

血清CIRBP Notch1水平与AECOPD患者病情严重程度及预后转归的关系

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河北医学 2024年第12期30卷 2107-2112页

作者：高丽华李彦楠俞玲高春张静景阅雯江苏省南京市中心医院呼吸与危重症医学科江苏南京210018

目的:探讨血清冷诱导rna结合蛋白(CIRBP)、缺口受体1(Notch1)水平与慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)患者病情严重程度及预后转归的关系。方法:选取2023年2月至2024年1月我院收治的AECOPD患者157例(AECOPD组)、COPD稳定期患者70例(COP... 详细信息

目的:探讨血清冷诱导rna结合蛋白(CIRBP)、缺口受体1(Notch1)水平与慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)患者病情严重程度及预后转归的关系。方法:选取2023年2月至2024年1月我院收治的AECOPD患者157例(AECOPD组)、COPD稳定期患者70例(COPD稳定期组)和同期健康体检志愿者70名(对照组)。AECOPD患者根据病情严重程度分为轻度AECOPD组(60例)、中度AECOPD组(55例)、重度AECOPD组(42例),根据6个月预后转归分为不良预后组(50例)和良好预后组(107例)。采用酶联免疫吸附法检测血清CIRBP、Notch1水平。绘制受试者工作特征曲线分析血清CIRBP、Notch1水平对其的预测能效。结果:对照组、COPD稳定期组、AECOPD组血清CIRBP、Notch1水平依次升高,差异有统计学意义(F=172.36、104.024,P均<0.001)。轻度AECOPD组、中度AECOPD组、重度AECOPD组血清CIRBP、Notch1水平依次升高,差异有统计学意义(F=64.686、54.409,P均<0.05)。随访6个月,157例AECOPD患者预后不良发生率为31.85%(50/157)。不良预后组血清CIRBP、Notch1水平高于良好预后组(t=7.261、6.956,P均<0.05)。病情程度加重(OR=4.012,95%CI:1.996~8.067)、CIRBP高(OR=1.012,95%CI:1.005~1.020)、Notch1高(OR=1.014,95%CI:1.007~1.022)为AECOPD患者预后转归不良的独立危险因素(P均<0.05)。血清CIRBP、Notch1水平联合预测AECOPD患者预后转归不良的曲线下面积为0.871,大于血清CIRBP、Notch1水平单独预测的0.793、0.798,差异有统计学意义(Z=2.833、2.696,P均<0.05)。结论:AECOPD患者血清CIRBP、Notch1水平升高与病情严重程度加重和预后转归不良有关,血清CIRBP、Notch1水平联合预测AECOPD患者预后转归不良的能效较高。

关键词：慢性阻塞性肺疾病急性加重冷诱导rna结合蛋白缺口受体1

TREM-1与CIRP在胃癌组织中的表达及其对胃癌预后的评估价值

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检验医学与临床 2023年第20期20卷 2990-2995页

作者：蔡喜中苟康李丹阳陕西省咸阳市中心医院普外二科陕西咸阳712000

目的探讨髓样细胞触发受体-1(TREM-1)与冷诱导rna结合蛋白(CIRP)在胃癌组织中的表达及其对胃癌预后的评估价值。方法选取2016年9月至2019年9月该院收治的108例胃癌患者作为研究对象,收集胃癌患者的癌组织标本作为胃癌组,对应的癌旁组织... 详细信息

目的探讨髓样细胞触发受体-1(TREM-1)与冷诱导rna结合蛋白(CIRP)在胃癌组织中的表达及其对胃癌预后的评估价值。方法选取2016年9月至2019年9月该院收治的108例胃癌患者作为研究对象,收集胃癌患者的癌组织标本作为胃癌组,对应的癌旁组织标本作为癌旁组。采用免疫组织化学法检测胃癌组及癌旁组TREM-1、CIRP表达情况;采用χ^(2)检验比较不同临床病理特征胃癌患者TREM-1、CIRP表达情况;采用多因素Cox回归分析胃癌患者预后的危险因素。结果胃癌组TREM-1阳性表达率(78.70%)高于癌旁组(37.96%),差异有统计学意义(χ^(2)=36.876,P5 cm、临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移的胃癌患者TREM-1、CIRP阳性表达率均高于中/高分化、肿瘤最大径≤5 cm、临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移的胃癌患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。TREM-1阳性表达患者3年生存率为41.18%,低于TREM-1阴性表达患者的91.30%,差异有统计学意义(P<0.05);CIRP阳性表达患者3年生存率为36.71%,低于CIRP阴性表达患者的93.10%,差异有统计学意义(P<0.05)。低分化、临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移的胃癌患者3年生存率均低于中/高分化、临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移的胃癌患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,临床分期为Ⅲ~Ⅳ期(HR=2.425,95%CI:1.591~3.697)、有淋巴结转移(HR=2.646,95%CI:1.709~4.096)、TREM-1阳性表达(HR=3.343,95%CI:2.081~5.373)、CIRP阳性表达(HR=2.898,95%CI:1.843~4.557)是胃癌患者生存的危险因素(P<0.05)。结论TREM-1、CIRP在胃癌患者中均呈高表达,且与患者临床病理特征及预后密切相关,能够作为胃癌预后评估的生物学标志物,有望为胃癌提供新的治疗靶点。

关键词：髓样细胞触发受体-1 冷诱导rna结合蛋白胃癌预后

CIRBP对人卵巢癌细胞SKOV3的促癌功能研究

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宁夏医科大学学报 2024年第9期46卷 886-892页

作者：俞梦楚王枚董辉张旭简鹏宁夏医科大学总医院医学科学研究院宁夏医科大学第一临床医学院银川750004 上海市浦东新区公利医院心内科上海200135

目的探索冷诱导rna结合蛋白(CIRBP)对人卵巢癌细胞SKOV3的促癌作用。方法采用生物信息学分析CIRBP在卵巢癌中的表达情况,建立CIRBP基因沉默和过表达的慢病毒稳转SKOV3细胞株,采用CCK-8法、流式细胞法、细胞划痕法分别检测细胞的增殖、... 详细信息

目的探索冷诱导rna结合蛋白(CIRBP)对人卵巢癌细胞SKOV3的促癌作用。方法采用生物信息学分析CIRBP在卵巢癌中的表达情况,建立CIRBP基因沉默和过表达的慢病毒稳转SKOV3细胞株,采用CCK-8法、流式细胞法、细胞划痕法分别检测细胞的增殖、凋亡、周期和迁移,采用细胞免疫荧光法检测β-catenin核转位,采用RT-qPCR检测CIRBP mrna表达水平,采用Western blot检测CIRBP、β-连环蛋白(β-catenin)和磷酸化β-连环蛋白(p-β-catenin)的表达水平。结果CIRBP在卵巢癌中的表达下调(P蛋白核转位水平下降(P蛋白水平下调(P蛋白水平上调(P<0.05),CIRBP的过表达则相反。结论CIRBP促进β-catenin的表达和核转位,从而影响卵巢癌的进展。

关键词：卵巢癌卵巢癌细胞SKOV3 冷诱导rna结合蛋白功能和机制

体外循环术中血液灌流降低主动脉夹层术后急性肾损伤发生风险

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中国体外循环杂志 2023年第5期21卷 277-281页

作者：赵长缨冯哲牛佳兰闫炀刘锋锋闫璐勤郑幸龙西安交通大学第一附属医院心血管外科西安710061

目的探究急性主动脉夹层体外循环术中应用血液灌流器对患者术后急性肾损伤(AKI)发生风险的影响。方法纳入本院2022年7月至2022年10月被诊断为急性A型主动脉夹层并行孙氏手术治疗的患者,回顾性收集其基线资料、手术情况、各项临床生化数... 详细信息

目的探究急性主动脉夹层体外循环术中应用血液灌流器对患者术后急性肾损伤(AKI)发生风险的影响。方法纳入本院2022年7月至2022年10月被诊断为急性A型主动脉夹层并行孙氏手术治疗的患者,回顾性收集其基线资料、手术情况、各项临床生化数据及预后结果进行分析。结果共有57名患者被纳入研究,其中23名患者接受了血液灌流治疗。血液灌流组的AKI发生率显著低于无血液灌流组(43.5%vs.85.3%,P=0.001),特别是AKI 1~2级的发生(34.8%vs.61.8%,P=0.046)。且血液灌流组术后7 d肌酐最大值[121(82,218)μmol/L vs.174(112,220)μmol/L,P=0.216]和胱抑素C最大值[1.63(1.34,2.85)mg/L vs.2.58(1.68,4.23)mg/L,P冷诱导rna结合蛋白的浓度较无血液灌流组未显示出差异[987(664,1335)vs.993(741,1451)ng/L,P=0.733]。结论急性主动脉夹层手术术中联合血液灌流可减少术后AKI发生风险,尤其是1级和2级AKI的风险。

关键词：体外循环血液灌流急性肾损伤主动脉夹层心血管手术冷诱导rna结合蛋白

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eCIRP在感染性疾病中的研究进展

四川医学 2024年第2期45卷 187-190页

作者：陈梦纯郭姝瑾成都中医药大学医学与生命科学学院四川成都610075 四川省医学科学院·四川省人民医院健康管理中心四川成都610072

冷诱导 rna 结合蛋白(cold inducible rna-binding protein,CIRP)是人体细胞中的一种冷休克蛋白 [1] 。人类的CIRP基因定位在第 19 号染色体p13.3位点上 [1] ,它以低水平表达于多种组织和细胞中。在生理情况下,CIRP主要存在于细胞核,通... 详细信息

冷诱导 rna 结合蛋白(cold inducible rna-binding protein,CIRP)是人体细胞中的一种冷休克蛋白 [1] 。人类的CIRP基因定位在第 19 号染色体p13.3位点上 [1] ,它以低水平表达于多种组织和细胞中。在生理情况下,CIRP主要存在于细胞核,通过稳定特异的mrna以促进细胞存活,其在细胞增殖、细胞存活、昼夜节律基因调控、端粒酶维持、应激适应、肿瘤形成和发展等多方面发挥作用 [2];在冷应激、缺氧、毒素等刺激下,CIRP可从细胞核迁移到细胞质,并与靶mrna的3′-UTR结合,进而影响转录的稳定性和翻译,同时可分泌到细胞外也就是细胞外CIRP(extracellular cold inducible rna-binding protein,eCIRP);eCIRP作为重要炎症介质,诱导炎症反应、病理性细胞增殖,调节细胞凋亡,参与炎症、肿瘤等多种疾病的发生发展 [2] 。

关键词：冷诱导rna结合蛋白感染性疾病炎症