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Meq基因增强RNA沉默的分子机制及其介导病毒抗性的研究

Meq基因增强RNA沉默的分子机制及其介导病毒抗性的研究

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作者：徐杰山东农业大学

学位级别：硕士

Meq基因是马立克氏病病毒的主要致瘤基因,MEQ蛋白N端为碱性亮氨酸拉链结构域,C端为富含脯氨酸结构域,在马立克氏病病毒的增殖和致病中起重要作用。农杆菌瞬时侵染分析表明,MEQ能明显增强植物瞬时侵染介导的RNA沉默,而RNA沉默是植物抵抗... 详细信息

Meq基因是马立克氏病病毒的主要致瘤基因,MEQ蛋白N端为碱性亮氨酸拉链结构域,C端为富含脯氨酸结构域,在马立克氏病病毒的增殖和致病中起重要作用。农杆菌瞬时侵染分析表明,MEQ能明显增强植物瞬时侵染介导的RNA沉默,而RNA沉默是植物抵抗病毒侵染的主要防御策略,对于MEQ沉默增强机制的研究,可以使我们了解RNA沉默途径及机制的更多细节,同时为利用沉默增强基因获得植物广谱病毒抗性提供依据。为了揭示MEQ增强RNA沉默的分子机制,针对亮氨酸拉链和转录激活结构域分别构建了缺失突变体和点突变体,分析沉默增强作用的关键位点和功能域;荧光定量PCR检测Meq基因对沉默途径相关基因表达的影响,探讨其介入RNA沉默途径的可能方式;利用叶盘法和花序侵染法将Meq基因分别转化烟草和拟南芥,接种病毒进行抗性分析。主要的研究结果如下：(1)Meq基因能够显著增强瞬时侵染介导的局部和系统性RNA沉默。构建Meq基因植物表达载体,转化农杆菌GV3101,以GFP转基因本生烟16c为材料,农杆菌瞬时侵染鉴定其对RNA沉默的影响,长波紫外灯下持续观察绿色荧光蛋白的表达。结果表明,侵染后第3d (3dpi), MEQ与GFP共侵染处理已无绿色荧光,而GFP单独侵染仍有较强绿色荧光,Northern blot检测表明,GFP mRNA的积累水平与观察结果一致,而MEQ与GFP共侵染区GFP siRNA的积累水平显著高于GFP基因的单独侵染。侵染15dpi, MEQ与GFP共侵染与GFP单独侵染相比,植株上部有更多新生叶片变红,GFP mRNA的积累水平更低,发生了更强的系统性RNA沉默。(2)MEQ蛋白包含399个氨基酸,1-117位为DNA结合结构域,118-399位为转录激活结构域,其中1-28位为富含Pro/Gln区,有与转录辅阻遏物CtBp互作的位点,28-78位包含2个富含碱性氨基酸残基的DNA结合区及核定位信号,79-117位为亮氨酸拉链区。突变分析表明,△1-28突变体不影响沉默增强功能,而△1-78突变体却丧失了沉默增强功能,说明28-78之间的DNA结合区对MEQ的沉默增强功能是必须的。△118-399的突变使MEQ沉默增强能力丧失,而△175-399突变和△302-399突变都未对沉默增强功能产生影响,说明MEQ的转录激活结构域中118-174是发挥RNA沉默增强功能的核心区。将MEQ亮氨酸拉链中的亮氨酸突变掉2个或3个(L92AL99A和L92AL99AL106A)时其沉默增强功能明显减弱,而仅有1个亮氨酸突变(L92A)不影响其沉默增强功能,这说明亮氨酸拉链结构对MEQ蛋白发挥作用非常关键。亚细胞定位分析表明,与GFP融合表达的MEQ主要分布于细胞核中,而沉默增强功能需要MEQ的DNA结合结构域和转录激活结构域共同起作用,因此推测,MEQ可能以转录因子的方式通过调控其它基因的表达发挥RNA沉默增强功能。(3)为了进一步了解MEQ影响沉默途径的方式,选取本生烟中20个已知的沉默途径相关基因,通过荧光定量PCR检测MEQ基因瞬时侵染对这些基因表达的影响。结果显示,在所检测的基因中,有7个表达量明显上调,AGO10和HEN1基因的表达上调最为明显,其次为MET1、NRPD2a、SGS3、AGOla和DRM3基因。其中HEN1、MET1、NRPD2a、SGS3和DRM3基因与DNA甲基化有关,其余2个基因属于AGO蛋白家族,是RNA沉默途径的重要蛋白,由此推测,Meq基因可能通过影响AGO基因的表达介入RNA沉默途径,同时对DNA的甲基化有影响,但二者之间是否存在联系还需要进一步研究验证。(4)Meq基因农杆菌介导法转化烟草和拟南芥,经卡那霉素抗性筛选PCR检测获得转基因株系若干。选取4个转基因烟草株系扩繁,分别接种黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)进行抗病性分析,ELISA检测和Northen blot结果表明,4个转基因烟草株系对CMV表现不同抗性,而对***无明显抗性,CMV的抗病程度与Meq基因表达水平之间未见明显相关性。转基因拟南芥的抗病性分析还在进行中。

关键词： RNA沉默马立克氏病病毒 MEQ 农杆菌瞬时侵染基因突变分析病毒抗性分析

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