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水稻生长素早期反应基因OsIAA6的功能验证

水稻生长素早期反应基因OsIAA6的功能验证

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作者：王文婷福建农林大学

学位级别：硕士

水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病是水稻上的一种重要病毒病,该病在我国的分布极为广泛,对我国水稻的产量造成了重大的损失。对于该病的防治,抗病品种的选育是一种最经济有效的措施。因此研究水稻抗病性的分子... 详细信息

水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病是水稻上的一种重要病毒病,该病在我国的分布极为广泛,对我国水稻的产量造成了重大的损失。对于该病的防治,抗病品种的选育是一种最经济有效的措施。因此研究水稻抗病性的分子机制对于培育抗病性水稻是十分重要的。作者所在实验室利用Microarry技术对不同抗性水稻品种在RSV胁迫下的转录组学差异进行了分析,发现生长素信号传导参与了RSV与水稻互作的过程,其中一些生长素早期反应基因表达差异明显。通过影响早期反应基因Aux/IAA的表达而调控下游基因的表达,生长素在植株的生长发育过程中起到了重要的作用。Aux/IAA基因在像大豆、拟南芥这样的双子叶植物中已经有了很多研究,但是它在水稻中的信号传导机制和在寄主与病原物互作中的作用研究还不深入。本文在RSV与寄主互作的转录组学基因芯片分析结果基础上,选取了在感病品种中存在表达差异的OsIAA6基因,对其功能进行了验证。利用Real-time RT-PCR方法,对OsIAA6基因在病健株中的表达差异进行了验证和分析。OsIAA6基因在RSV侵染水稻悬浮细胞系0～64 h内均表达上调,而在水稻植株内也会出现一个短暂的表达上调高峰期(侵染后的4d);在侵染后第16 d时,OsIAA6基因的表达变化和Microarray分析结果相近,OsIAA6基因表达恢复正常水平。本研究运用RT-PCR对OsIAA6的全长cDNA进行了克隆,并与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组载体pEGAD-OsIAA6。通过农杆菌侵染在烟草叶片和洋葱表皮细胞内瞬时表达,并通过激光共聚焦显微镜和普通荧光显微镜观察, GFP只在细胞核中特异表达,说明OsIAA6为核蛋白。将来自水稻的OsIAA6构建在载体pKYLX上,采用农杆菌介导的叶盘转化法,将目的基因导入了烟草K326中,获得的11株过量表达转基因烟草中,有四株一直处于不生根的生长停滞状态,其余7株虽然可以生根,但与野生型烟草相比,生长缓慢。用烟草花叶病毒侵染过量表达的转OsIAA6基因烟草,TMV的复制增殖比野生型多出了数十倍,其原因尚不清楚。为了进一步揭示水稻OsIAA6的基因功能。应用pKYLX载体,构建了OsIAA6的正义和反义表达载体并转化水稻,获得过量表达和抑制表达的OsIAA6的转基因水稻T0代植株。但与野生型水稻相比,过量表达的T0代转基因水稻难以分化,最终只有一株转基因水稻分化并成苗,但与过量表达的转基因烟草一样,其生长明显迟缓。而获得的50株抑制表达的水稻植株,它们表现为分化率高,株高伸长,分蘖增多的生长优势。这些结果说明水稻OsIAA6基因对烟草和水稻的生长具有明显的调节作用。

关键词：水稻条纹病毒生长素早期反应基因亚细胞定位农杆菌介导的烟草转化农杆菌介导的水稻转化

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水稻抗稻瘟病候选基因的筛选及功能验证

水稻抗稻瘟病候选基因的筛选及功能验证

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作者：罗曼斯南昌大学

学位级别：硕士

稻瘟病作为影响水稻的主要病害之一,对水稻的生产带来了极大的威胁。为了达到控制和防治稻瘟病的目的,育种家将抗稻瘟病基因导入水稻中,对水稻进行抗性改造,使得它自身就能够抵抗稻瘟病的侵害。但是由于稻瘟病菌的生理小种很容易变异,... 详细信息

稻瘟病作为影响水稻的主要病害之一,对水稻的生产带来了极大的威胁。为了达到控制和防治稻瘟病的目的,育种家将抗稻瘟病基因导入水稻中,对水稻进行抗性改造,使得它自身就能够抵抗稻瘟病的侵害。但是由于稻瘟病菌的生理小种很容易变异,新推广的抗病品种常常在种植不久之后就丧失了抗病性,导致失去了其使用的价值。因此,快速、有效地发掘和利用优良的抗稻瘟病品种一直是国内外研究重点。本研究以前期已经进行了对应抗病基因遗传定位的10个稻瘟病菌株和水稻品种窄叶青8(ZYQ8)、京系17(JX17)及其双单倍体(DH)群体的103个株系作为实验材料,结合遗传定位、群体遗传学分析以及生物信息学分析3种方法来定位和筛选抗稻瘟病候选基因,随后进行水稻转化,验证其抗病功能。本研究的主要结果如下:1.分布在10个抗稻瘟病菌QTL定位区域中的NBS-LRR基因有254个,NBS-LRR总基因数为468个,占了NBS-LRR总基因数的54.3%。这10个QTL定位区域的总长度为46,526,191bp,占水稻全基因组总长度的10.8%,说明我们所定位的10个QTL定位区域是NBS-LRR基因的富集区。2.位于ZYQ8抗JX17感的6个QTL定位区域中的基因有119个,其中籼稻中为真基因,粳稻中为假基因的有33个,籼稻和粳稻中均为真基因的有69个,第一类基因按照Pi籼/Pi粳大于20的标准筛选出3个基因,第二类基因按照Pi籼/Pi粳大于5的标准筛选出2个基因,共5个基因作为ZYQ8抗候选基因。3.位于JX17抗ZYQ8感的4个QTL定位区域中的基因有135个,其中粳稻中为真基因,籼稻中为假基因的有30个,籼稻和粳稻中均为真基因的有84个,这两类基因均按照Pi籼/Pi粳小于0.5的标准筛选,从第一类中筛选出1个基因,从第二类中筛选出5个基因,共6个基因作为JX17抗候选基因。4.通过上述的方法,筛选出的水稻抗稻瘟病候选基因共有11个,分布于8个QTL定位区域中。其中ZYQ8抗JX17感的候选基因有5个,位于4个ZYQ8抗的稻瘟病菌定位的区域中;JX17抗ZYQ8感的候选基因有6个,位于4个JX17抗的稻瘟病定位的区域中。5.我们成功构建了5个ZYQ8抗候选基因的互补载体,6个JX17抗候选基因的敲除载体,将以上构建成功的11个载体通过农杆菌介导对水稻品种JX17进行了遗传转化。6.目前有4个基因已经得到了敲除成功的T0代转基因苗,有1个基因得到了T1代转基因苗。目前已经完成了T1代转基因苗的部分检测工作,发现有两株转基因苗表现出明显的感病现象,而对照的JX17表现为抗病性。因此我们初步认为Os11g47780这个基因很可能为我们所寻找的抗稻瘟病基因。7.目前有2个基因已经成功获得了互补载体的转基因苗,对其中的1个基因的转基因苗进行了抗病性检测。其中有3株转基因苗表现为抗病性,而对照的JX17表现为感病性。因此,我们初步认为Os09g11020这个基因很可能为我们所寻找的抗稻瘟病基因。

关键词：水稻稻瘟病抗稻瘟病候选基因农杆菌介导的水稻转化抗病功能检测

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