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苜蓿组织培养及农杆菌介导的遗传转化研究进展

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中文科技期刊数据库（全文版）自然科学 2024年第1期 135-140页

作者：郭玉朋黄小捷韦丽思冶乙不拉马志明青海民族大学生态环境与资源学院·青海省特色经济植物高值化利用重点实验室·青海省蕨麻产业研究院青海西宁810007

苜蓿是重要的豆科牧草,苜蓿品种的改良对畜牧业的发展有重要意义。转基因育种是利用现代生物技术改良作物性状的重要手段。而农杆菌介导的遗传转化被认为是最有效的转基因方法。对大多数植物,组织培养再生体系的建立是遗传转化的基础。... 详细信息

苜蓿是重要的豆科牧草,苜蓿品种的改良对畜牧业的发展有重要意义。转基因育种是利用现代生物技术改良作物性状的重要手段。而农杆菌介导的遗传转化被认为是最有效的转基因方法。对大多数植物,组织培养再生体系的建立是遗传转化的基础。本文通过在以往苜蓿组织培养及农杆菌介导的遗传转化相关研究的基础上,对这一领域的进展做了综述。

关键词：苜蓿组织培养农杆菌遗传转化

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烟草脆裂病毒介导的人参基因沉默体系的构建

中草药 2024年第1期55卷 232-239页

作者：李冉琪李雅淑汤淼淼曲正义郑培和侯微中国农业科学院特产研究所吉林长春130112 吉林农业科技学院吉林吉林132109

目的人参Panax ginseng中构建烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默体系,为人参中基因功能的验证提供新方法。方法通过序列比对得到人参中八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因的完整序列,利用保守结构域... 详细信息

目的人参Panax ginseng中构建烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默体系,为人参中基因功能的验证提供新方法。方法通过序列比对得到人参中八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因的完整序列,利用保守结构域预测工具得到核心片段,将其整合进pTRV2载体内。重组载体转化农杆菌后侵染人参叶片,观察表型并利用q PCR检测沉默效率。结果通过序列比对得到了2条PDS基因。PgPDS1基因c DNA序列全长1746 bp,编码581个氨基酸;PgPDS2基因c DNA序列全长1299bp,编码432个氨基酸。2个PgPDS蛋白均具有典型的PDS结构域。将重组载体通过农杆菌转化人参叶片,接种3周后叶片表型无变化,5周后叶片尖端以及边缘出现枯萎现象。经q PCR检测,接种后3周和5周人参内源PgPDS基因表达量分别下降至接种前的70.37%和37.35%,表明体系构建成功。结论人参中成功构建了TRV介导的基因沉默体系。

关键词：病毒诱导的基因沉默人参八氢番茄红素脱氢酶烟草脆裂病毒农杆菌

基于高遗传转化率及低幼苗玻璃化率的黑果枸杞叶片组合培养体系

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西北植物学报 2024年第1期44卷 53-62页

作者：闫婷乌日恒鲁敏杨荣王美珍刘雪锋内蒙古自治区林业科学研究院呼和浩特010010 研究中心呼和浩特010010 生态系统与生态工程重点实验室呼和浩特010010

【目的】建立高效稳定的黑果枸杞遗传转化体系,有效降低其再生幼苗玻璃化率,促进其基因功能研究和提高遗传改良效率。【方法】以黑果枸杞叶片作为外植体,利用农杆菌(LBA4404、EHA105)介导的遗传转化法,通过调整基础培养基类型并添加相... 详细信息

【目的】建立高效稳定的黑果枸杞遗传转化体系,有效降低其再生幼苗玻璃化率,促进其基因功能研究和提高遗传改良效率。【方法】以黑果枸杞叶片作为外植体,利用农杆菌(LBA4404、EHA105)介导的遗传转化法,通过调整基础培养基类型并添加相应浓度的植物激素,筛选出最适愈伤组织诱导培养基、分化和选择培养基、生根诱导培养基,将黑果枸杞遗传转化率提高到65%以上,同时降低幼苗玻璃化率至10%以下。【结果】(1)黑果枸杞叶片高效组合培养体系中最佳农杆菌侵染浓度(OD_(600))为0.6,侵染时间为25 min,在此条件下侵染叶片抗性愈伤诱导率达78.2%~96%;(2)黑果枸杞遗传转化中最适分化和选择培养基为:MS+肌醇50 mg/L+烟酸0.25 mg/L+维生素B60.25 mg/L+铁盐母液1 mL/L+甘氨酸1.0 mg/L+维生素B10.05 mg/L+6-BA 0.25 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L+卡那霉素30 mg/L+特美汀300 mg/L(pH=6.0);最适生根诱导培养基为:WPM+IBA 0.25 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L+卡那霉素30 mg/L+特美汀300 mg/L(pH=6.0);(3)在最适分化和选择培养基中,农杆菌LBA4404-pBI121侵染叶片外植体产生的幼苗玻璃化率约为65%,而农杆菌EHA105-pBI121侵染处理则低于10%;(4)采用木本植物低盐WPM培养基可使黑果枸杞再生幼苗生根效率达到81.2%左右。(5)将阳性愈伤数量与总接种叶片数量比值作为遗传转化效率的评价指标,在最适遗传转化体系中,农杆菌LBA4404-pBI121和EHA105-pBI121侵染后遗传转化率分别为51%和65.2%。【结论】黑果枸杞叶片高效组合培养体系能够显著提高其遗传转化率,降低玻璃化幼苗的发生率。

关键词：黑果枸杞农杆菌组合培养体系转化效率幼苗玻璃化

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利用绿色荧光蛋白优化辣椒遗传转化体系

广东农业科学 2024年第3期51卷 103-113页

作者：董依萍刘画刘丹周迎佳李峰邓颖天华中农业大学园艺林学学院/果蔬园艺作物种质创新与利用国家重点实验室湖北武汉430070 湖南省农业科学院蔬菜研究所湖南长沙410125

【目的】农杆菌介导的辣椒遗传转化较为困难,至今仍未建立高效转化体系。绿色荧光蛋白(GFP)基因是植物遗传转化中常用的报告基因,以GFP为报告基因,优化农杆菌介导的辣椒遗传转化体系。【方法】利用GFP表达系统,统计3个辣椒品种(‘HP’‘... 详细信息

【目的】农杆菌介导的辣椒遗传转化较为困难,至今仍未建立高效转化体系。绿色荧光蛋白(GFP)基因是植物遗传转化中常用的报告基因,以GFP为报告基因,优化农杆菌介导的辣椒遗传转化体系。【方法】利用GFP表达系统,统计3个辣椒品种(‘HP’‘8214’和‘L55’)中3种不同外植体(子叶、下胚轴和Flamingo-bill外植体)的不定芽分化率、不定根分化率与荧光阳性率,探究农杆菌侵染浓度、侵染时间、预培养时间和共培养时间等因素对不定芽、不定根分化率及荧光阳性率的影响。【结果】3个辣椒品种的Flamingo-bill外植体不定芽分化率均显著高于下胚轴与子叶外植体,其中‘L55’Flamingo-bill外植体的不定芽分化率最高、达77.59%,故选用‘L55’Flamingo-bill外植体进行后续研究。4种农杆菌不同侵染浓度和时间组合下,‘L55’Flamingo-bill外植体均可产生不定芽、不定根及表达GFP的愈伤组织,当农杆菌侵染浓度为OD_(600)=0.05,侵染时间为30 min时,不定芽分化率和荧光阳性率最高,分别达48.39%、4.84%。在6种不同预培养与共培养时间组合处理下,Flamingo-bill外植体也均产生不定芽和不定根,预培养1 d、共培养1~2 d处理下的不定芽分化率和荧光阳性率最高,分别达48.44%、12.50%。最后对表达GFP荧光的不定根与愈伤组织进行PCR检测,结果显示GFP、Kan和Cas9基因在荧光阳性的组织中均被检测到,表明农杆菌介导的T-DNA插入成功且转化稳定。【结论】辣椒的外植体类型、农杆菌侵染浓度、侵染时间、预培养和共培养时间均对辣椒遗传转化效率有影响。以GFP为报告基因,筛选合适的转化条件可提高农杆菌介导的辣椒遗传转化效率。

关键词：辣椒 Flamingo-bill外植体绿色荧光蛋白遗传转化农杆菌组织培养

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植物遗传转化技术在药用植物中的研究进展

中国实验方剂学杂志 2024年

作者：张昊熙昱林龙飞袁媛刘宇灵李慧中国中医科学院中药资源中心中国中医科学院中医药健康产业研究所中国中医科学院中药研究所江西中医药大学药学院

药用植物种类繁多、杂合度高且育种目标特殊，常规杂交技术难以满足其育种需求。而植物遗传转化技术具有高度选择性，能够特异性的改变植株性状，是药用植物育种研究的重要技术手段。常用的植物遗传转化技术有农杆菌转化法和粒子轰击法... 详细信息

药用植物种类繁多、杂合度高且育种目标特殊，常规杂交技术难以满足其育种需求。而植物遗传转化技术具有高度选择性，能够特异性的改变植株性状，是药用植物育种研究的重要技术手段。常用的植物遗传转化技术有农杆菌转化法和粒子轰击法，农杆菌转化法应用最为广泛，但其特异性强，并非所有药用植物均适用；粒子轰击法无特异性，但其转化效率低、外力损伤细胞及组织等问题也显而易见。随着纳米技术的兴起与发展，新兴的纳米材料介导转化法很好地解决了以上两种技术的难题，但受限于其发展较晚，纳米材料介导遗传物质进入植物细胞的机理尚不明确，因此在药用植物中应用较少。本文就农杆菌转化法、粒子轰击法、纳米材料介导转化法几种常用或新兴的植物遗传转化技术的发展现状以及在不同药用植物中的应用情况进行概述，展望了植物遗传转化技术发展趋势及其在药用植物和中药资源未来发展中的应用前景，以期为药用植物的遗传改良和种质创新提供新的技术思路，为中药资源的可持续发展注入新的动力。

关键词：植物遗传转化技术药用植物农杆菌粒子轰击纳米材料基因组编辑

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桃毛根转化体系的建立与优化

北京农学院学报 2024年第3期39卷 63-68页

作者：张思佳吴凡颖李小姗常明明刘悦萍杨海清北京农学院生物与资源环境学院北京100096 农业农村部华北都市农业重点实验室北京102206 北京市平谷区果品产业服务中心北京101200

【目的】为了解决桃遗传转化中易形成嵌合体、转化过程耗时和工作量大等问题,建立并优化了发根农杆菌介导的毛根转化体系。【方法】以三周龄无菌组培‘中桃24号’桃苗下胚轴、子叶和上部分植株为外植体,利用pCAMBIAsuper1300-GFP质粒转... 详细信息

【目的】为了解决桃遗传转化中易形成嵌合体、转化过程耗时和工作量大等问题,建立并优化了发根农杆菌介导的毛根转化体系。【方法】以三周龄无菌组培‘中桃24号’桃苗下胚轴、子叶和上部分植株为外植体,利用pCAMBIAsuper1300-GFP质粒转化的发根农杆菌MSU440介导转化。将侵染后的外植体转移到含有抗菌素(头孢菌素)的培养基上培养7 d左右。观察到愈伤组织和毛状根的形成。对有毛状根发出的外植体进行体式荧光显微镜检测,观察绿色荧光信号。提取有荧光信号的毛状根总RNA,PCR检测阳性毛状根,并筛选最适转化品种、侵染浓度和侵染时间。【结果】利用发根农杆菌MSU440侵染桃下胚轴,诱导形成毛状根,并通过转化载体表达的GFP快速筛选到转基因毛状根,PCR扩增到了RolB和eGFP基因片段;条件优化结果表明,在OD值为0.8的发根农杆菌侵染液中浸泡30 min为最佳转化条件,最高转化率为63.6%。【结论】在桃上建立了发根农杆菌介导的毛根转化体系,优化了转化条件,为桃基因功能验证和获得稳定转基因桃植株提供技术基础。

关键词：桃遗传转化农杆菌毛状根

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乌饭树再生及遗传转化体系的建立

农业科学 2024年第5期14卷 523-534页

作者：李晨吴清楠汪晴晴张凌云覃雪晶北京林业大学林学院北京

本研究以乌饭树叶片为材料,筛选诱导叶片再生不定芽的植物生长调节剂种类和浓度,建立了乌饭树再生体系。此外,确定了用于筛选转基因材料的抗生素浓度、侵染乌饭树叶片的根癌农杆菌菌液浓度和侵染时间,建立了乌饭树遗传转化体系。结果表... 详细信息

本研究以乌饭树叶片为材料,筛选诱导叶片再生不定芽的植物生长调节剂种类和浓度,建立了乌饭树再生体系。此外,确定了用于筛选转基因材料的抗生素浓度、侵染乌饭树叶片的根癌农杆菌菌液浓度和侵染时间,建立了乌饭树遗传转化体系。结果表明:(1) 乌饭树叶片不定芽再生的最佳培养基配方为:WPM 0.5 mg/L TDZ 4 mg/L ZT;(2) 乌饭树叶片预培养5 d,筛选用抗生素潮霉素浓度为5 mg/L,农杆菌抑制剂头孢霉素浓度为350 mg/L,共培养6 d,农杆菌浓度为0.8,侵染时间为60 min时,遗传转化效率最高。上述结果为在乌饭树中进行基因功能验证和分子育种提供了理论基础和技术支撑。

关键词：乌饭树叶片再生体系农杆菌遗传转化

农杆菌介导法获得辣木PKM-1转双价抗虫基因(sck+Cry1-Ac)愈伤组织

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云南农业大学学报（自然科学版） 2023年第1期38卷 27-33页

作者：杨钺戈李跃张慧阮明菊马丽宣曾千春云南农业大学农学与生物技术学院云南昆明650201

[目的]辣木生产中鳞翅目害虫辣木瑙螟危害日益严重,为提高辣木抗虫性,使用农杆菌介导法将抗虫基因导入辣木,以期获得抗虫转基因转化子。[方法]利用内质网定位修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)和苏云金芽孢杆菌基因(Cry1-Ac)筛选标记基... 详细信息

[目的]辣木生产中鳞翅目害虫辣木瑙螟危害日益严重,为提高辣木抗虫性,使用农杆菌介导法将抗虫基因导入辣木,以期获得抗虫转基因转化子。[方法]利用内质网定位修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)和苏云金芽孢杆菌基因(Cry1-Ac)筛选标记基因nptⅡ;利用农杆菌EHA105介导遗传转化辣木PKM-1的叶片和茎段,以卡那霉素筛选获得抗性植株;采用PCR和NPTⅡImmunoStrip检测确定nptⅡ基因的整合与表达。[结果]辣木叶片和茎段无需预培养可直接进行农杆菌转化,最佳转化条件为:工程菌液OD_(600)值为0.2,侵染时间为2 min,共培养时间为2 d;乙酰丁香酮添加与否对获得抗性愈伤率的影响不明显;200 mg/L提门叮可有效抑制农杆菌生长;卡那霉素抗性愈伤组织PCR检测表明:标记基因nptⅡ已成功整合到辣木PKM-1基因组中;NPTⅡImmunoStrip检测表明NPTⅡ蛋白水平得以表达。[结论]获得了辣木PKM-1卡那霉素抗性愈伤组织,为辣木抗虫分子育种提供了材料。

关键词：辣木抗虫转基因农杆菌愈伤组织

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不同载体和农杆菌对苜蓿瞬时表达影响的研究

植物研究 2023年第6期43卷 835-845页

作者：孙敏杨红红王安琪张悦婧达晓伟张继孙坤吴建平冯汉青西北师范大学生命科学学院兰州730070 西北师范大学新农村发展研究院兰州730070

苜蓿(Medicago sativa)是重要的牧草类植物,为了在苜蓿中有效地实现外源基因的瞬时表达,该研究以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,以本氏烟草(Nicotiana benthamiana)作为对比,研究了2种不同的表达载体(非复制型载体和基于菜豆黄矮病毒... 详细信息

苜蓿(Medicago sativa)是重要的牧草类植物,为了在苜蓿中有效地实现外源基因的瞬时表达,该研究以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,以本氏烟草(Nicotiana benthamiana)作为对比,研究了2种不同的表达载体(非复制型载体和基于菜豆黄矮病毒的复制型载体)、2种不同类型的根癌农杆菌菌株(Agrobacterium tumefa⁃ciens)(LBA4404和EHA105)对苜蓿叶片瞬时表达水平的影响。结果表明,LBA4404与复制型载体的组合(revector/LBA4404)可在苜蓿叶片中有效地实现GFP的瞬时表达。进一步地,研究了re-vector/LBA4404的浓度和侵染后时间对苜蓿叶片瞬时表达的影响。观察显示,随着re-vector/LBA4404菌悬液浓度或侵染后时间的增加,GFP在苜蓿叶片中的瞬时表达水平呈现出先升后降的趋势。菌悬液浓度为1.0(OD600)时,GFP瞬时表达水平最高;侵染后时间为5~7 d时,GFP瞬时表达水平达到峰值。相较于本氏烟草叶片,在苜蓿叶片中实现最高水平的瞬时转化需要更高浓度的农杆菌和更长的侵染后孵育的时间。

关键词：农杆菌瞬时表达苜蓿