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小鼠诱导性多能干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究

小鼠诱导性多能干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究

引用

作者：陈静南昌大学

学位级别：硕士

研究背景:感音神经性耳聋是耳鼻喉科的常见疾病,其主要原因是由内耳毛细胞和/或螺旋神经元的损伤导致,然而在哺乳动物,以上二者的损伤是不可能再生与修复的,因此干细胞移植替代受损的毛细胞和/或螺旋神经元治疗由此引起的感音神经性耳... 详细信息

研究背景:感音神经性耳聋是耳鼻喉科的常见疾病,其主要原因是由内耳毛细胞和/或螺旋神经元的损伤导致,然而在哺乳动物,以上二者的损伤是不可能再生与修复的,因此干细胞移植替代受损的毛细胞和/或螺旋神经元治疗由此引起的感音神经性耳聋已成为耳科学研究的重点和热点问题。目的:1.通过体外培养建立稳定的诱导性多能干细胞(i PSCs)培养体系;2.利用耳毒性药物制作小鼠感音神经性耳聋模型;3.利用显微注射法将经CM-Di1标记的i PSCs经圆窗移植入小鼠耳蜗,观察移植细胞在耳蜗内的存活、迁移、分化情况,为利用i PSCs移植治疗感音神经性耳聋提供理论依据。方法:1.i PSCs的培养与标记:利用贴壁培养法培养稳定传代的小鼠i PSCs,并用荧光染料CM-Di1标记。2.感音神经性耳聋模型的制作:利用幼鼠皮下连续注射新霉素,通过听性脑干反应检测小鼠听力损失情况。3.小鼠i PSCs耳蜗移植:取40只造模成功小鼠随机平均分为实验组A和对照组B,同时取20只同批次正常小鼠作为正常组C,A组利用显微注射法将标记的小鼠i PSCs经圆窗移植入耳聋鼠耳蜗的Rosenthal’s管中,B组注射等量的DMEM基础培养液,4周后处死A、B、C组小鼠各10只,通过免疫荧光染色法和RT-PCR法观察移植细胞在耳蜗内的存活、迁移与分化情况。剩余小鼠用于ABR阈值的连续性观察。4.i PSCs移植后耳蜗HE染色鉴定是否有畸胎瘤形成。结果:1.成功建立稳定的小鼠i PSCs培养体系,并能在体外培养形成EB,RT-PCR可检测i PSCs多能性基因Nanog,Oct4,Sox2。2.连续皮下注射新霉素12天后,小鼠反应阈达70-80d Bn HL。3.A组和B组术后ABR阈值无改善。A组蜗轴和Rosenthal’s管中均可见红色标记的i PSCs,并且部分细胞表达毛细胞标记物和螺旋神经元标记物。B、C组耳蜗内未见红色荧光表达。4.各组小鼠术前、术后ABR阈值差异无统计学意义。***染色鉴定i PSCs移植后耳蜗暂未见畸胎瘤形成。结论:1.本实验可成功建立稳定的小鼠i PSCs培养体系。***-Di1可用于体外细胞转染和体内细胞的示踪。3.新霉素可诱导小鼠感音神经性耳聋,建立稳定的耳聋模型。4.小鼠i PSCs耳内移植后可分化为表达毛细胞标志物的毛细胞样细胞。5.小鼠i PSCs耳内移植后可分化为表达螺旋神经元标志物的螺旋神经元样细胞。6.经Rosenthal’s管径路移植i PSCs不能明显改善耳聋鼠的ABR阈值。7.小鼠i PSCs移植后短期内未见畸胎瘤形成。8.移植后的i PSCs主要分布于Rosenthal’s管和蜗轴中。

关键词：诱导性多能干细胞内耳移植毛细胞螺旋神经元细胞分化

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大鼠骨髓间充质干细胞培养及体外诱导向神经元样细胞分化的研究

大鼠骨髓间充质干细胞培养及体外诱导向神经元样细胞分化的研究

引用

作者：秦华丽中南大学

学位级别：硕士

目的：建立SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外培养体系,诱导分化为神经元样细胞,筛选较好的体外诱导方法,为下一步内耳移植实验提供前期研究基础。方法：LBMSCs培养：主要采用全骨髓直接贴壁法培养BMSCs并传代,取P3代行流式细胞仪检测B... 详细信息

目的：建立SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外培养体系,诱导分化为神经元样细胞,筛选较好的体外诱导方法,为下一步内耳移植实验提供前期研究基础。方法：LBMSCs培养：主要采用全骨髓直接贴壁法培养BMSCs并传代,取P3代行流式细胞仪检测BMSCs表面标志CD29, CD90及造血细胞表面抗原CD45的表达。2.取P4代BMSCs,由碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24h后,分别加入：A组诱导剂：神经营养素3(NT-3),维甲酸(RA);B组诱导剂：p-硫基乙醇(BME)。诱导lh,5h,24h,7d,14d,21d后,采用细胞免疫荧光方法鉴定,检测成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达情况,观察两组是否有染色阳性的神经元样细胞及比较阳性率的高低。结果：1.全骨髓贴壁筛选法简便,所获得的细胞数量多,增殖分化快。2.流式细胞仪检测BMSCs表达CD90、CD29;不表达CD45,结合细胞形态分析,符合BMSCs的特征。3.细胞免疫荧光结果示NSE阳性表达,A组诱导分化为神经元样细胞的阳性率明显高于B组。结论：1.全骨髓贴壁筛选法分离培养的BMSCs所获得的细胞数量多,增殖分化快,纯度高。2.采取分步诱导和联合诱导BMSCs,由bFGF预诱导24h后,换用NT-3+RA诱导分化为神经元样细胞NSE阳性率明显高于BME诱导,是一种比较好的诱导方案。

关键词：骨髓间充质干细胞诱导方法神经元样细胞内耳移植

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诱导性多能干细胞正常小鼠耳蜗内移植的实验研究

诱导性多能干细胞正常小鼠耳蜗内移植的实验研究

引用

作者：朱恒涛南昌大学

学位级别：硕士

研究目的：利用显微注射的方法将诱导性多能干细胞（iPSCs）移植至正常小鼠耳蜗内，观察其分化转归情况，为iPSCs的耳聋治疗提供一定的理论依据和试验基础。研究方法： 1.建立稳定的小鼠iPSCs的培养体系，对稳定传代的小鼠iPSCs进行... 详细信息

研究目的：利用显微注射的方法将诱导性多能干细胞（iPSCs）移植至正常小鼠耳蜗内，观察其分化转归情况，为iPSCs的耳聋治疗提供一定的理论依据和试验基础。研究方法： 1.建立稳定的小鼠iPSCs的培养体系，对稳定传代的小鼠iPSCs进行体外鉴定。 2.小鼠iPSCs细胞的标记和移植：用CM-Dil染料标记iPSCs，流式细胞仪鉴定标记效率。20只正常6-8周龄SPF级CD-1/ICR鼠随机平均分为A、B两组：A组为试验组，B组为对照组，将左耳定为试验耳，实验组移植CM-Dil标记的iPSCs，对照组移植等体积的DMEM基础培养基。两组均在术前1周和术后1月对小鼠左耳行听性脑干反应（ABR）的检测。 ***耳蜗移植后分化细胞的鉴定：细胞移植1月后免疫组织荧光染色鉴定移植后的细胞是否表达毛细胞标志物（Myosin Ⅶa、Espin）和神经元细胞标志物（Nestin、Neurofilament-M）。 ***耳蜗内移植后用HE染色鉴定是否有畸胎瘤形成。结果： 1.成功建立了稳定的小鼠iPSCs培养体系。稳定传代的小鼠iPSCs经AP染色鉴定阳性且可形成EBs。 2.荧光染料（CM-Dil）对小鼠iPS细胞的标记效率达到96.42%。术前1周，A组、B组ABR反应阈分别为24.50±5.50dB SPL、26.00±6.15dB SPL;A、B两组术前1周的ABR反应阈比较差异无统计学意义(p=0.572＞0.05)。术后1月，A组、B组ABR反应阈分别为70.50±4.97dB SPL、68.00±5.37dB SPL;A、B两组术后1月的ABR反应阈比较差异无统计学意义(p=0.295＞0.05)。A、B两组ABR反应阈术后均较术前高（p值均＜0.05)，差异有统计学意义。 3.A组小鼠耳蜗的内外淋巴内及蜗轴内均可见CM-Dil标记的小鼠iPSCs，并且部分红色荧光标记的细胞表达毛细胞标志物（Myosin Ⅶa、Espin）和神经元细胞标志物（Nestin、Neurofilament-M）。B组耳蜗内未见有红色荧光表达。 ***染色鉴定移植miPSCs后耳蜗内可见畸胎瘤形成。结论： 1.耳蜗内移植后的小鼠iPSCs可以分化为表达毛细胞标志物的细胞;2.耳蜗内移植后的小鼠iPSCs可以分化为表达神经元标志物的细胞;2.小鼠iPSCs耳蜗内移植后有形成畸胎瘤的可能;4.经圆窗径路耳蜗移植iPSCs短期内不能改善因为损伤导致的小鼠听力下降。

关键词：诱导性多能干细胞内耳移植毛细胞螺旋神经元听性脑干诱发电位

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