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调控水稻花器官内稃发育关键基因SHORT PALEA 1的图位克隆

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调控水稻花器官内稃发育关键基因SHORT PALEA 1的图位克隆

作者：朱尚尚南京农业大学

学位级别：硕士

水稻既是世界上30多亿人口的主粮,也是研究单子叶植物的模式作物。水稻花器官的正常发育对籽粒产量和品质的形成都至关重要。作为单子叶模式植物,水稻与双子叶模式植物相比,具有独特的花序结构。水稻的花序主要是由穗轴、一次枝梗、二... 详细信息

水稻既是世界上30多亿人口的主粮,也是研究单子叶植物的模式作物。水稻花器官的正常发育对籽粒产量和品质的形成都至关重要。作为单子叶模式植物,水稻与双子叶模式植物相比,具有独特的花序结构。水稻的花序主要是由穗轴、一次枝梗、二次枝梗和小穗构成,属于圆锥花序。每个小穗由1朵小花、1对护颖和1对副护颖组成。一朵正常的水稻小花由外到内组成依次是一枚外稃、一枚内稃、两枚浆片、六枚雄蕊和一枚雌蕊。目前人们已经了解并掌握了一部分植物花发育的调控机制,如ABC模型。人们对单子叶植物花器官的研究较双子叶植物稍显落后,同时单子叶植物和双子叶植物在花器官发育过程和形态建成上存在着显著差异。人们对水稻花器官的发育有了初步的认识,也建立起适合水稻花器官发育的ABCDE模型。但是要彻底了解其机理还需要大量深入的研究,尤其在水稻内外稃的起源上还存在着争议。本研究利用课题组前期从钴60（30KR）处理籼稻品种9311完熟种子获得的内稃发育异常的突变体shortpalea 1（sp1）和野生型9311以及配制的遗传分离群体为实验材料,对突变基因进行了图位克隆。获得的主要研究结果如下:1.在相同环境和同期播种的条件下,突变体sp1与野生型9311相比,抽穗期略早,并达到了显著差异;同时两者的株高、一次枝梗数、每穗小穗数和结实率均存在极显著差异,总体而言,突变体sp1的内稃短小,株高变矮,一次枝梗数和结实率减少。突变体sp1的内稃发育不良率达到95.57%,内稃无法与外稃勾合,颖花的第2轮结构-浆片、第3轮结构-雄蕊和第4轮结构-雌蕊均暴露在外。2.剥取sp1突变体和9311野生型植株中处于幼穗分化原基至幼穗分化第4期的幼穗,在扫描电子显微镜下进行观察和比较,结果显示在Sp4-Sp7时期,突变体的内稃发育均迟缓于野生型。在幼穗分化第4期,小穗发育完成,突变体的内稃短小而无法与外稃形成一个完整的闭合结构,结果表明sp1突变体的内稃特征在颖花发育的早期就出现了异常变化。***1突变体和9311野生型正反交F1植株上内稃发育正常,与野生型一致,表明短小内稃是隐性性状;分别统计两个F2后代的表型分离情况,经卡方检测,符合一对等位基因表现的3:1分离遗传规律（χ2（1,0.05）＜3.84）,表明sp1突变表型受单位点隐性纯合基因控制。4.利用sp1/日本晴F2群体分离的1170个隐性极端个体将目的基因定位到1号染色体长臂上127.7kb区间内。在该区域内,共有24个开放阅读框。通过对sp1突变体和9311野生型测序对比发现,只有ORF14在突变体和野生型之间存在差异位点,其余23个ORF两者之间没有差异。sp1在ORF14的第447核苷酸位置出现了单碱基G的缺失,造成移码和翻译的提前终止。转基因互补实验证实了基因SP1就是目的基因。*** Time-PCR和GUS组织染色表明,SP1基因只在水稻茎的节间、幼穗（0-5cm）、小穗及雄蕊上表达,而在其它组织包括根、茎和叶片中均没有表达,这表明SP1基因在水稻组织特异性表达。同时亚细胞定位结果表明SP1定位在细胞核中。

关键词：水稻花器官内稃 SHORT PALEA 1 图位克隆

水稻内稃突变体pd（t）的遗传分析和基因定位

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水稻内稃突变体pd（t）的遗传分析和基因定位

作者：杜静静福建农林大学

学位级别：硕士

植物花器官发育是发育生物学研究的重中之重,在禾本科作物中,内外稃的进化关系以及它们与双子叶植物花器官之间的关系有着各种广泛的解释和辩论。本实验室在水稻品种金恢323中发现一个内稃退化的自然突变体pd(t)[palea degradation(t),p... 详细信息

植物花器官发育是发育生物学研究的重中之重,在禾本科作物中,内外稃的进化关系以及它们与双子叶植物花器官之间的关系有着各种广泛的解释和辩论。本实验室在水稻品种金恢323中发现一个内稃退化的自然突变体pd(t)[palea degradation(t),pd(t)]。本研究对该突变体进行了花器官形态特征观察和农艺性状分析,并对该基因进行了遗传分析和分子标记定位,进而对目标基因区域序列分析进行候选基因预测。结果如下:(1)内稃退化突变体与其野生型相比,内稃发育不完全,表现为弯曲导致不能与外稃钩状连结而无法紧密闭合,突变体的雄蕊数目为2-6枚不等。(2)将该突变体分别与水稻品种中花15和ACC8558杂交,F1的植株内稃均正常,而F2群体中分离出内稃正常植株与内稃突变植株,经过卡方检验符合3:1,表明该突变性状受一对隐性基因控制,暂命名为pd(t)。(3)利用pd(t)与ACC8558杂交的F2群体,对突变基因进行定位。结果pd(t)被定位在水稻1号染色体短臂上RM490和RM243两个标记之间,物理距离约为60Kb。(4)在目的区间内共有7个开放阅读框,对最有可能与花发育相关的候选基因LOCs01g12890进行了测序验证表明:在野生型中包括该突变位点的预测的ORF的长度是942bp,共编码了 313个氨基酸;而在突变体中,原来编码野生型中第124个氨基酸为谷氨酸(glu)的密码子GAA变成的终止密码子TAA,导致翻译提前终止。而已知该基因及其相关序列可能是属于一类新的控制小花发育的转录调节蛋白家族,所以推测基因LOC Os01g12890可能是控制内稃发育的目标基因。

关键词：水稻内稃突变基因定位

OsMADS6、OsMADS32和REP1基因相互作用调控水稻内稃发育机理的研究

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OsMADS6、OsMADS32和REP1基因相互作用调控水稻内稃发育机理的研究

作者：张亮四川农业大学

学位级别：硕士

水稻是全球上最重要的粮食作物之一,其花器官(生殖器官)的发育直接影响水稻的产量,花器官发育时期也是农业生产中提高产量的关键时期。在单个水稻花器官中,其外轮器官(内外稃)可以保护内轮生殖器官免受病虫害以及为其提供糖类等营养。因... 详细信息

水稻是全球上最重要的粮食作物之一,其花器官(生殖器官)的发育直接影响水稻的产量,花器官发育时期也是农业生产中提高产量的关键时期。在单个水稻花器官中,其外轮器官(内外稃)可以保护内轮生殖器官免受病虫害以及为其提供糖类等营养。因此,对水稻花器官发育,特别是单子叶植物特有的外轮器官(内外稃)发育分子调控机理的研究具有重要的理论和实际应用意义。通过正反向遗传学的方法,近年来有不少水稻花器官发育分子调控机理的研究被报道,但关于水稻内外稃的属性决定和后期形态形成的分子机理的研究仍然较少。我们实验室前期通过正向遗传学的方法获得了三个参与调控水稻内稃发育的关键调控基因,分别是TGP类转录因子RETARDED PALEA1 (REP1),以及MADS-box类基因OsMADS6和OsMADS32。前期的研究结果表明OsMADS6、OsMADS32、REP1在内稃属性决定上起重要作用。。但这些基因是否有遗传或分子水平的相互作用,在内稃原基发育和后期形态建成过程中如何协议,共同调控正常的发育过程等生物学问题仍不清楚。本论文主要以0smads6、osmads32和 repl三个突变体为研究材料,通过遗传学和分子生物学的方法研究OsMADS6、OsMADS32、和 REPl基因在调控水稻内稃发育中的具体作用机制,得到以下主要研究结果：1.观察osmads6/Osmads32、osmads6/repl双突变和osmads 6/osmads3-2/repl三突变体内稃发育的过程。结果显示无论在单突变体及双突变体中或者三突变体中,内稃属性均发生转化,内稃维管束,边缘mtp结构等内稃属性均像osmads6单突变体,表明在内稃属性建成中,OsMADS6位于OsMADS32和RE pl基因的遗传学上游。在内稃形态建成,即后期细胞分裂分化发育过程中,内稃表皮细胞形态均像osmads6单突变体表型。这些结果暗示OsMADS6在决定内稃发育上具有更具重要的作用。2.通过QRT-PCR及mRNA原位杂交实验,进一步分析了三者基因水平的调控关系。结果表明：OsMADS6、 OsMADS32和REP1在调控内稃早期属性决定及后期形态建成上的调控机理不同。在水稻小花发育早期(内稃起始),OsMADS32基因可能抑制OsMADS6基因转录来调控内稃属性决定;OsMADS6可能通过促进REP1的表达来调控内稃属性决定;OsMADS32可促进REP1的表达来调控内稃属性决定。在内稃后期发育中,OsMADS6可通过抑制OsMADS32的表达,同时促进REP1表达来调控内稃后期的形态建成;OsMADS32可促进OsMADS6及REP1表达调控内稃后期形态建成;REP1可抑制OsMADS6表达来调控内稃后期形态建成。3.通过双酵母杂交实验,研究了这三个基因在蛋白水平上互作关系,结果表明：在酵母双杂交实验体系中,OsMADS6可以与OsMADS32蛋白互作,OsMADS6可以与REP1互作,但OsMADS32与REP1并没有检测到蛋白互作。暗示OsMADS6可能与OsMADS32和REP1可形成蛋白复合体来调控内稃发育。

关键词：水稻内稃 OsMASD6 OsMADS32 REP1 基因互作

裸燕麦小花形态表型鉴定方法与落粒的形态学机制研究

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麦类作物学报 2024年第5期44卷 585-593页

作者：张冰雪李星岩韩冰杨燕麦类种质创新利用自治区高等学校重点实验室内蒙古呼和浩特010029 内蒙古自治区高校燕麦工程研究中心内蒙古呼和浩特010010

落粒性是影响裸燕麦产量与品质的关键性状。本研究对228份具有代表性的裸燕麦材料的落粒性及小花的形态等15个性状进行田间多点鉴定,并建立了裸燕麦小花形态表型的鉴定方法。结果表明,15个性状在3个试验地点之间均表现出了不同程度的差... 详细信息

落粒性是影响裸燕麦产量与品质的关键性状。本研究对228份具有代表性的裸燕麦材料的落粒性及小花的形态等15个性状进行田间多点鉴定,并建立了裸燕麦小花形态表型的鉴定方法。结果表明,15个性状在3个试验地点之间均表现出了不同程度的差异;裸燕麦的落粒性同内稃宽度(相关系数r=-0.36)、内稃面积(r=-0.30)、外稃宽度(r=-0.26)等9个性状呈显著或极显著负相关,与种子同内稃宽度的比值(r=0.37)及种子同外稃宽度的比值(r=0.20)呈极显著正相关,说明内外稃的宽度影响小花中种子的包裹程度,外稃厚度影响小花抵抗外力的能力,从而影响裸燕麦的落粒性。K-means聚类分析将参试材料分为两大类,Ⅰ类占整个群体的48%(110个),内稃和外稃整体上更加窄小,落粒性较高;Ⅱ类占群体的52%(118个),内稃和外稃整体上更加宽大,落粒性较低。对3个地点参试材料落粒性的密度分布进行了分析,提出了裸燕麦落粒性评价的等级划分标准:0~0.03为低落粒性,0.03~0.08为中落粒性,0.08~0.16为较高落粒性,0.16~0.23为高落粒性,大于0.23为极高落粒性。

关键词：裸燕麦落粒性内稃外稃

水稻闭花授粉突变体spw2(t)的表型鉴定与基因初步定位

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分子植物育种 2018年第13期16卷 4314-4319页

作者：陈芳育陈智明王本威郭玉春梁康迳福建农林大学作物科学学院作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室福州350002 福建农林大学作物科学学院福建省作物设计育种重点实验室福州350002

鉴定和利用具有闭花授粉特性的作物种质资源是防止转基因作物基因漂移的一个理想策略。本研究组从水稻育种杂交后代材料中获得一个偏籼型闭花授粉突变体,暂命名为spw2(t)(superwoman2-cleistogamy(t))。表型分析表明,突变体spw2(t)的内... 详细信息

鉴定和利用具有闭花授粉特性的作物种质资源是防止转基因作物基因漂移的一个理想策略。本研究组从水稻育种杂交后代材料中获得一个偏籼型闭花授粉突变体,暂命名为spw2(t)(superwoman2-cleistogamy(t))。表型分析表明,突变体spw2(t)的内外稃交界部位发生整体融合而不开裂,从而产生闭花授粉特性。遗传分析表明,该突变体的突变表型受一对隐性核基因控制,spw2(t)被初步定位于第2染色体短臂的In Del标记In BH8与SSR标记RM423之间,物理距离为4.7 Mb,为进行基因精细定位、克隆和功能研究提供了科学依据。

关键词：水稻闭花授粉内外稃融合内稃外稃

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中国科学家阐明水稻成花逆转分子机制

农业生物技术学报 2010年第2期18卷 207-209页

2010年1月22日出版的《PLoSGenetics》杂志,中国科学院遗传与发育生物学研究所程祝宽课题组和薛勇彪课题组、以及扬州大学研究人员组成的研究团队发表了3个自然发生的水稻生殖突变体,phoenix(pho)、

关键词：水稻护颖假胎生成花逆转突变体突变型内稃外稃分子机制

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水稻长粒和短粒品种稃片的发育及细胞学差异

中国水稻科学 2009年第2期23卷 160-164页

作者：张艳胡春根姚家玲华中农业大学园艺林学学院湖北武汉430070 华中农业大学生命科技学院湖北武汉430070

以籼稻长粒品种明恢63和短粒品种川7为材料,利用石蜡制片技术研究了水稻稃片发育过程,并比较长粒和短粒品种稃片发育的细胞学差异。结果表明,小花原基时,稃片纵向各区段均匀分裂,随着发育的进行,稃片上部细胞最早停止分裂,基部细胞分裂... 详细信息

以籼稻长粒品种明恢63和短粒品种川7为材料,利用石蜡制片技术研究了水稻稃片发育过程,并比较长粒和短粒品种稃片发育的细胞学差异。结果表明,小花原基时,稃片纵向各区段均匀分裂,随着发育的进行,稃片上部细胞最早停止分裂,基部细胞分裂结束最晚。至花粉母细胞末期,稃片细胞结束分裂。花粉母细胞减数分裂期,稃片细胞开始进入快速伸长生长阶段,至小孢子晚期稃片长度达到最大值,而且稃片的中、基部细胞对其长度的贡献大于上部细胞。长粒和短粒水稻稃片发育过程基本一致,但长粒和短粒水稻内稃薄壁细胞数目在稃片发育过程中,始终存在极显著差异,细胞长度在稃片长度定形时并没有明显区别。稃片达终长度时,长粒品种内稃薄壁细胞数目比短粒品种多60.98%,而中、基部细胞长度仅增加1.81%和8.05%。因此,细胞数目是导致水稻长粒和短粒品种稃片长度差异的主要因素。

关键词：稃片内稃水稻粒型细胞学

REP1、REPEN1及OsMADS6共同参与调控水稻花器官形态建成的研究

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REP1、REPEN1及OsMADS6共同参与调控水稻花器官形态建成的研究

作者：廖萍四川农业大学

学位级别：硕士

被子植物是世界上现存最大的植物类群,其主要原因之一便是能够进行有性生殖。而正是因为花的出现才保证被子植物能够有效地进行有性生殖,这也是为什么被子植物被称为显花植物的原因。五彩缤纷、各式各样的花为被子植物提供了更多地生殖... 详细信息

被子植物是世界上现存最大的植物类群,其主要原因之一便是能够进行有性生殖。而正是因为花的出现才保证被子植物能够有效地进行有性生殖,这也是为什么被子植物被称为显花植物的原因。五彩缤纷、各式各样的花为被子植物提供了更多地生殖机会。而花器官的形态结构,特别是花型对称性的发育是影响花多样性的因素之一,因此,对花器官形态建成调控机制的研究也成为了近年来进化发育生物学的研究热点之一。通过对模式植物金鱼草花对称性发育分子调控机制的研究,人们对双子叶植物中的花对称性调控机制也有了较为深入的认识。虽然双子叶植物和单子叶植物在花器官发育的分子机制上具有一定保守性,但是,由于单子叶植物在花器官形态上存在着显著差异,单子叶的花器官形态结构及对称性建成的分子机制可能与双子叶研究结果不同。另一方面,作为最重要的粮食作物之一,水稻具有基因组小,易于进行转基因操作等优点,并且已经完成了全基因测序,因此,水稻作为单子叶模式植物,为我们提供了理想的实验材料。通过筛选突变体,我们发现了内稃发育缺陷突变体并通过对单双突变体的表型观察和表达模式分析,确定这些基因在水稻花器官形成建成及花型对称性发育过程中的作用以及相互关系。研究结果如下： 1、REPEN1缺失影响水稻小花内稃的发育 repen1突变体的内稃侧的稃状结构为内外稃的嵌合体,部分区域具有内稃属性,而部分区域具有外稃属性,这说明repen1突变体的内稃发生了向外稃属性的部分转化,REPEN1的缺失影响水稻小花内稃属性的发育,这种影响早在内稃原基开始起始时就发生了。因此,我们可以推测REPEN1从内稃原基起始时期就开始参与调控了水稻小花内稃发育。 ***1与REP1相互作用,共同参与调控水稻小花内稃发育 rep1/repen1双突变的表型与rep1和repen1单突变体的表型具有显著差异,而且REP1在repen1中的表达量轻微上调。因此,我们推论REPEN1与REP1之间的相互作用是由REPEN1对REP1表达量上的抑制产生的。并且,REPEN1和REP1共同参与到了对水稻小花内稃发育的调控过程中。 ***1与OsMADS6共同作用于水稻小花内稃发育过程 repen1/osmads6双突变的表型与osmads6和repen1单突变体的表型具有显著差异,而且OsMADS6在repen1中的表达量轻微上调,同时在表达部位上也发生明显改变。因此,我们推论REPEN1与OsMADS6之间通过由REPEN1对OsMADS6表达量上的抑制以及表达部位的改变共同参与调控水稻小花内稃发育过程。 ***1、REP1与OsMADS6通过对影响水稻小花内稃发育,共同参与调控水稻花对称性 REPEN1可以通过参与内稃发育,从而参与调控水稻花对称性的。而对rep1/repen1和repen1/osmads6双突变表型的观察,不仅表明了REP1、REPEN1和OsMADS6共同参与水稻小花的内稃发育,同时说明它们的缺失改变了花器官的数量和分布,从而共同参与到花对称性的建成。

关键词：水稻内稃花对称性 REP1 REPEN1 OsMADS6

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水稻花发育基因AFG1的基因定位与克隆

水稻花发育基因AFG1的基因定位与克隆

作者：俞晓琦浙江师范大学

学位级别：硕士

水稻作为一种为世界上大部分人口提供主食的重要谷类作物,提高其产量和品质依然是研究者们关注的问题。由于水稻花器官的发育能直接产生种子从而最终决定稻米产量和品质,因此,了解花器官形态建成的调控机制具有十分重要的实践意义。在... 详细信息

水稻作为一种为世界上大部分人口提供主食的重要谷类作物,提高其产量和品质依然是研究者们关注的问题。由于水稻花器官的发育能直接产生种子从而最终决定稻米产量和品质,因此,了解花器官形态建成的调控机制具有十分重要的实践意义。在本研究中,我们在以云粳17（YJ17）为背景的EMS诱变系中鉴定到一个内稃发育异常的突变体,将其命名为afg1（abnormal flower and grain 1）。首先在大田种植条件下,对突变体afg1和YJ17的表型进行观察比较并在体视镜和扫描电镜下观察了花器官的形态特征;利用石蜡切片进一步观察了各轮花器官的结构特征;利用图位克隆定位并克隆了AFG1基因;酵母实验和双荧光素酶报告法检测了该蛋白的转录活性;并且对afg1和YJ17稻米品质的各项指标进行了检测。主要研究结果如下所示:在大田中,我们鉴定到一个小穗内稃异常增大的突变体afg1,且浆片伸长,雄蕊数量有不同程度的减少,但其他花器官均无明显异常。石蜡切片后进一步观察可见afg1的内稃结构的确发生了改变,它缺失了光滑的边缘结构而表现出类似外稃的细胞形态,从而导致内稃、外稃交界处无法形成互锁结构而出现颖壳开裂的现象。利用扫描电镜对早期花原基的观察发现,afg1内轮花器官的发育相较于野生型明显延迟。考种结果表明,afg1的粒长显著性下降而粒宽显著性增加,千粒重也大大降低。对粒型及细胞增殖扩展相关基因的表达水平进一步检测后发现,这些基因的表达量均有不同程度的改变。稻米品质检测结果表明,在总淀粉以及直链淀粉含量上,afg1稻米表现出显著性下降,而蛋白质和可溶性糖含量显著性上升。另外,糊化温度表现出显著性上升,米粉在尿素中的糊化特征也与野生型有显著性差异。q RT-PCR的检测结果显示一些稻米品质相关基因的表达量也受到了影响。利用大量的突变体单株,通过图位克隆法最终将AFG1基因定位于2号染色体上,此区间大约为76kb,我们发现该区间内有先前报道过的花器官发育相关基因,经测序发现导致afg1突变表型的基因的确与Os MADS6等位。q RT-PCR检测发现AFG1仅在穗和不同发育时期的种子中表达,而在其他器官如根、茎、叶、叶鞘中未见表达。另外,通过转基因技术构建的CRISPR-Cas9敲除株系,证实了的确是LOC＿Os02g45770的突变导致了afg1的异常表型。亚细胞定位结果显示AFG1蛋白在细胞核中表达,我们推测其为转录因子。因此进一步采用酵母实验和双荧光素酶报告法进行了转录活性检测,其结果表明,AFG1蛋白的确具有转录激活活性。综上所述,以上实验结果表明AFG1作为转录激活因子不仅能够与一些花发育相关基因互作,还可能调控着下游细胞增殖扩展及稻米品质相关基因的表达水平,进而影响稻米产量和品质。

关键词：水稻 afg1 内稃转录激活因子稻米产量和品质