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千岛湖外生菌根真菌内生细菌多样性及促生功能研究

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千岛湖外生菌根真菌内生细菌多样性及促生功能研究

作者：徐漫南京师范大学

学位级别：硕士

外生菌根真菌具有重要的生态意义和良好的食药用价值,一直受到人们的广泛关注。有关外生菌根真菌的大量研究表明,外生菌根真菌子实体内生细菌多样性具有差异,且多数为菌根促生菌,与外生菌根真菌的生长密切相关。外生菌根真菌特异的内生... 详细信息

外生菌根真菌具有重要的生态意义和良好的食药用价值,一直受到人们的广泛关注。有关外生菌根真菌的大量研究表明,外生菌根真菌子实体内生细菌多样性具有差异,且多数为菌根促生菌,与外生菌根真菌的生长密切相关。外生菌根真菌特异的内生细菌群落是多种因素共同作用的结果,对其生长发育有着不可替代的作用,这种内生细菌的特异性可能与外生菌根真菌子实体生长特定的需求有关,满足子实体的发育条件。外生菌根真菌不仅是珍稀野生食用菌,也是重要的功能保健品,其品质十分重要。然而,大量研究只关注菌根促生菌对外生菌根真菌生长的促进作用,而关于内生细菌对其品质及真菌丝中相关化合物含量的影响都未见报道。千岛湖因其独特的条件,成为研究生境片段化效应的理想场所,岛屿化引起的生态学效应取得了很多研究成果。千岛湖岛屿森林中分布多种外生菌根真菌,且不同岛屿间的外生菌根真菌多样性存在差异,是研究外生菌根真菌子实体内生细菌多样性及其影响因子的良好平台。因此,本研究拟对千岛湖外生菌根真菌子实体内生细菌群落进行研究,探讨子实体内生细菌群落的调控因素,并从菌丝体品质成分角度来探究内生细菌对外生菌根真菌的影响,解读内生细菌的潜在作用。通过对千岛湖外生菌根真菌子实体内生细菌群落的分析,结果表明千岛湖同一岛屿不同外生菌根真菌子实体内生细菌多样性和组成具有差异,不同岛屿同种外生菌根真菌子实体内生细菌多样性和组成也有差异,且差异细菌类群主要体现在科和属水平。外生菌根真菌子实体内生细菌优势菌属具有实质性差异,子实体内生细菌群落会因宿主真菌种类、生长环境不同而产生变化。进一步对外生菌根真菌子实体内生细菌群落的影响因素进行探究,发现子实体正下方和周围土壤理化性质对其内生细菌群落没有显著影响。外生菌根真菌子实体内生细菌表现出明显的岛屿异质性,表明生境片段化效应对子实体内生细菌群落具有一定的影响。宿主真菌特异性(种和属)和岛屿异质性(岛屿面积、周长)对子实体内生细菌群落作用显著,是外生菌根真菌子实体内生细菌群落的调控因子,共同调控外生菌根真菌子实体内生细菌群落。通过细菌代谢物—真菌共培养实验,我们发现荷叶离褶伞内生细菌对真菌菌丝体生长和品质具有有益影响,其中菌株Ld13(嗜麦芽寡养单胞菌)的作用效果最显著。菌株Ld13具有良好的固氮、溶磷、解钾活性,不仅对真菌菌丝生长具有显著促进作用,还能显著提高菌丝的营养及品质。菌株Ld13显著促进菌丝生长,使真菌菌丝生物量提高了1.2倍;对真菌非挥发性化合物(可溶性糖、蛋白、游离氨基酸、5’-核苷酸、有机酸)也有显著作用,并使菌丝的等鲜浓度EUC提高了7.3倍,显著提升了菌丝的营养和品质。

关键词：外生菌根真菌菌根促生菌千岛湖内生细菌多样性非挥发性化合物促生功能

Cd污染下两种生态型东南景天内生细菌多样性的比较

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Cd污染下两种生态型东南景天内生细菌多样性的比较

作者：邓平香华南农业大学

学位级别：硕士

超累积生态型和非超累积生态型东南景天(Sedum alfredii)在吸收和积累重金属方面存在明显差异,然而,目前对两种生态型东南景天内生细菌群落结构的差异尚不清楚。因此,本论文首先采用培养方法比较了生长在自然条件下超累积生态型与非超... 详细信息

超累积生态型和非超累积生态型东南景天(Sedum alfredii)在吸收和积累重金属方面存在明显差异,然而,目前对两种生态型东南景天内生细菌群落结构的差异尚不清楚。因此,本论文首先采用培养方法比较了生长在自然条件下超累积生态型与非超累积生态型东南景天根际土壤、根系、茎和叶片种可培养内生细菌的数量,分离和纯化代表性内生细菌,并测定菌株对锌、镉抗性水平、分泌吲哚乙酸、高铁载体和溶解无机磷的特征。进一步通过盆栽实验,研究在不同Cd污染土壤上超累积生态型和非超累积生态型东南景天叶、茎和根内生细菌多样性差异,利用RDA(冗余分析)分析土壤理化性质、植物生长特征、植物重金属Cd含量对内生菌多样性的影响,以期从土壤-植物-内生菌的相互关系的角度来阐释超累积东南景天对镉吸收、解毒及积累的生态机制。本论文取得的主要研究结果如下:(1)生长在浙江衢州铅锌矿的超累积生态型东南景天和浙江杭州九溪茶园的非超累积生态型东景天叶、茎、根、根际土中存在大量可培养细菌,其中超累积生态型东南景天叶和根内生菌数量高于非超累积特性东南景天,但茎的数量则相反。从超累积生态型东南景天叶、茎、根组织中分离纯化得到30株内生菌,从非超累积生态型景天叶、茎、根组织中分离纯化得到32株内生菌。在超累积生态型东南景天和非超累积生态型东南景天内生菌中,Zn抗性水平大于5 mmol·L-1、Cd抗性水平大于0.5mmol·L-1、IAA(吲哚乙酸)浓度大于15 mg·L-1、铁载体活性单位小于20、溶磷圈直径大于2 mm的比例分别为43.33%和12.50%、36.67%和18.75%、25.00%和50.00%、87.50%和16.67%、71.43%和100%。(2)随着土壤Cd浓度的增加,超累积生态型东南景天叶的可培养内生菌数量减少,茎内生菌数量增加,根内生菌数量先增加后减少,非超累积生态型东南景天叶、茎、根内生菌均减少。(3)生长在不同土壤Cd浓度土壤上的两种生态型东南景天的叶、茎和根内生细菌的丰富。在Phylum水平,两种生态型东南景天的根、茎和叶组织种的优势菌群均为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)等。在属水平,超累积生态型东南景天的优势菌群为链球菌属(Streptococcus),鞘脂单胞菌属(Sphingomonas),奈瑟氏菌属(Neisseria),新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)和罗思氏菌属(Rothia)等,非超累积生态型东南景天的优势菌群为拟杆菌属(Bacteroides),鞘脂单胞菌属(Sphingomonas),甲基杆菌属(Methylobacterium),梭状芽孢杆菌属(Clostridium),芽孢杆菌属(Bacillus)和红球菌属(Rhodococcus)等。在对照土壤上,优势菌群为链球菌属(Streptococcus),奈瑟氏菌属(Neisseria),罗思氏菌属(Rothia),新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)等;当土壤镉浓度增加时,优势菌群为鞘脂单胞菌属(Sphingomonas),鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium),肠球菌属(Enterococcus),甲基杆菌属(Methylobacterium),慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium),普氏菌(Prevotella),链霉菌属(Streptomyces)和罗尔斯通菌属(Ralstonia)等。(4)RDA分析发现,超累积生态型东南景天叶片组织中的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)丰度主要受叶Cd含量的影响;茎组织中鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterococcus)的丰度主要受茎Cd含量的影响;在超累积生态型东南景天叶片组织中韦永氏球菌属(Veillonella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和拟杆菌属(Bacteroides)的丰度与植株高度、叶片鲜重正相关;在超累积生态型东南景天根组织中,叶杆菌属(Phyllobacterium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的相对丰度与土壤有效Cd含量、根Cd含量正相关,梭状芽胞杆菌属(Clostridium)和根瘤菌属(Rhizobium)相对丰度与土壤pH正相关。

关键词：东南景天内生细菌多样性高通量测序镉

牛肝菌子实体内生细菌多样性及其生态学功能研究

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牛肝菌子实体内生细菌多样性及其生态学功能研究

作者：白红艳南京师范大学

学位级别：硕士

外生菌根是土壤真菌和植物之间高度进化的互利共生体,宿主植物可以通过真菌菌丝体的外延菌丝从土壤中吸收矿质养分,而外生菌根真菌则可以获得宿主植物的光合碳素同化物。在外生菌根真菌与宿主植物共生体建立过程中,可与其周围其他生态... 详细信息

外生菌根是土壤真菌和植物之间高度进化的互利共生体,宿主植物可以通过真菌菌丝体的外延菌丝从土壤中吸收矿质养分,而外生菌根真菌则可以获得宿主植物的光合碳素同化物。在外生菌根真菌与宿主植物共生体建立过程中,可与其周围其他生态位的菌根促生菌(mycorrhiza helper bacteria,MHB)等微生物种群相互作用,影响外生菌根真菌菌丝生长、菌根定殖及其子实体的形成。前期研究发现,除菌根促生菌以外,外生菌根真菌子实体、菌根表面及地下菌丝可以为土壤细菌提供一个特殊的生态位,在真菌分泌物的趋化作用下,土壤细菌可能会在菌丝表面形成生物膜,逐步进入子实体内部定殖,形成特异的子实体内生细菌种群。目前,对外生菌根真菌子实体内生细菌种群的研究还鲜有报道。此外,外生菌根的外延菌丝虽然可以通过扩大植物根毛的吸收面积,释放有机酸和磷酸酶等物质溶解土壤磷素的方式,促进植物对土壤磷素等养分的吸收,但外生菌根真菌在土壤中存在生长速度慢,自身解磷能力也十分有限。在自然土壤中,外生菌根真菌如何实现对土壤磷素等养分的高效吸收仍不可知。前期研究表明,子实体内生细菌种群不仅与子实体组成成分密切相关,还可以影响宿主菌丝体的生长及有机酸等代谢产物的分泌。因此外生菌根真菌子实体的内生细菌种群可能对于宿主菌丝生长及磷等矿质营养吸收都具有重要的生物学功能。在本研究中,通过16S r DNA基因高通量测序对外生菌根真菌苦粉孢牛肝菌(Tylopilus felleus)、蜜色粉孢牛肝菌(Tylopilus areolatus)、削脚牛肝菌(Boletus queletii)子实体内生细菌种群和菌柄附着土壤的细菌种群进行对比分析,比较细菌种群结构差异,其中三种牛肝菌于2018年采集于浙江省千岛湖的36岛和59岛。结果表明苦粉孢牛肝菌,蜜色粉孢牛肝菌和削脚牛肝菌子实体的内生细菌种群存在显著差异,而它们相应的菌柄附着土壤的细菌种群间却无差异。其中,三种牛肝菌子实体中厚壁菌门的相对丰度远大于菌柄附着土壤中的相对丰度,并且厚壁菌门是牛肝菌子实体内生细菌的优势菌门。在细菌纲和细菌属水平上,牛肝菌子实体和菌柄附着土壤的细菌种群也存在明显差异,这些结果表明外生菌根真菌对其子实体内生细菌种群具有特异性选择定殖特性。为了进一步探究牛肝菌子实体选择的内生细菌的生态学功能,本研究通过活体分离培养三种牛肝菌子实体内生细菌,并在纯培养条件下探究子实体内生细菌产生的气体挥发物和代谢物对外生菌根真菌厚环乳牛肝菌菌丝生长以及菌丝品质的影响。另外,内生细菌也在外生菌根共生体中扮演重要角色,协助真菌菌丝促进植物对土壤养分的吸收。利用可培养方法共分离到31株内生细菌,分别属于厚壁菌门(14株芽孢杆菌属)和变形菌门(12株假单胞菌属,4株伯克霍尔德菌属,1株寡养假单胞菌属)。内生细菌与厚环乳牛肝菌非接触共培养实验结果表明,B11菌株Bacillus pumilus strain NFS-CAP-1和B12菌株Bacillus sp.strain CRE2产生的气体挥发物能够促进菌丝生长,增加菌丝的生物量和面积,提高了菌丝体中葡萄糖和淀粉的含量。气相质谱结果表明,这可能与B11菌株特有的挥发性物质棕榈酸乙酯hexadecanoic acid ethyl ester和2,4-叔丁基苯酚2,4-Di-tert-butylphenol,B12菌株特有的挥发性物质十四甲基环庚硅氧烷Tetradecamethyl-Cycloheptasiloxane有关。另外,内生细菌的代谢物与厚环乳牛肝菌共培养的实验结果表明,B13菌株Bacillus subtilis strain PK5-6和B21菌株Pseudomonas sp.strain 102515的代谢物显著促进厚环乳牛肝菌的生长,增加菌丝的生物量和面积,提高菌丝体中蔗糖和蛋白质的含量。此外,外生菌根子实体内生细菌可能在外生菌根共生体中扮演重要角色,协助外生菌根体系对土壤养分的吸收。实验结果表明,内生细菌具有良好的固氮、溶磷、产生物膜和生长素的能力;子实体内生细菌与外生菌根真菌厚环乳牛肝菌在协同促进对难溶性无机磷和有机磷的解磷作用中具有重要作用。其中,外生菌根真菌厚环乳牛肝菌自身难以溶解难溶性无机磷,而子实体内生细菌可以通过分泌有机酸等物质促进难溶性无机磷的溶解,使培养液中可溶性磷含量达到30.07–60.81 mg/L。另外,厚环乳牛肝菌和子实体内生细菌单独溶解卵磷脂的能力都较弱;单独接种内生细菌和单独接种外生菌根真菌的培养液可溶性磷含量分别为2.37和1.19 mg/L,而二者共培养之后的培养液可溶性磷含量平均值达到7.91 mg/L。

关键词：外生菌根真菌牛肝菌菌根促生菌千岛湖内生细菌多样性促生功能固氮溶磷

纽荷尔脐橙叶片和幼果内生细菌群落多样性及其功能预测

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江西农业大学学报 2023年第4期45卷 884-893页

作者：游婧刘冰熊桂红蒋军喜宋珏萍雷若琦朱珍谢忠建江西农业大学农学院江西南昌330045

【目的】柑橘溃疡病是脐橙上的一种重要病害,影响其发生的因素较多。通过了解纽荷尔脐橙内生细菌群落组成和其潜在的生物学功能,探索内生细菌在脐橙感染溃疡病中的作用。【方法】从纽荷尔脐橙树上随机采集未表现任何病害症状的幼果和嫩... 详细信息

【目的】柑橘溃疡病是脐橙上的一种重要病害,影响其发生的因素较多。通过了解纽荷尔脐橙内生细菌群落组成和其潜在的生物学功能,探索内生细菌在脐橙感染溃疡病中的作用。【方法】从纽荷尔脐橙树上随机采集未表现任何病害症状的幼果和嫩叶,嫩叶分别在春、夏、秋3个季节进行采样,每个样品设3个重复。对4个样品进行表面消毒后从中提取DNA,PCR在25μL反应体系中进行,扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检查,选取主条带清晰的400~500 bp片段进行测序。采用基于16S rRNA基因V3-V4可变区的高通量测序技术及Tax4Fun功能预测对纽荷尔脐橙内生细菌菌群及其功能进行了测定和分析。各样本数据在FLASH V1.2.7上进行拼接,利用QIIMEV1.7.0对产生的原始数据进行质控,用Uparse V7.0.10012对有效数据进行聚类,在97%的相似度水平上生成OTU。为每个OTU挑选一个代表序列,并使用SSUrRNA数据库进行物种注释分析使用,获得分类学信息并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成,并用MUSCLE(V3.8.31)进行α多样性(样本内)和β多样性(样本间)分析。通过UProC和PAUDA 2种方法将功能信息对应到SILVA数据库中,实现功能注释。【结果】季节和采摘部位对脐橙内生细菌群落组成的多样性和物种丰富度存在一定的差异,脐橙幼果中的内生细菌数量多于叶片,夏季相较于其他季节内生细菌群落丰富度更高;脐橙内生细菌群体在门水平上的组成相似,但丰度占比不同,且厚壁菌门、变形菌门和蓝菌门为主要优势门,各优势细菌纲数目、组成及其丰度随不同脐橙样本而异,芽孢杆菌属为主要优势属;Tax4Fun功能预测显示纽荷尔脐橙内生细菌包含大量关于膜运输、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、翻译、复制和修复、能量代谢、辅因子和维生素的代谢等基因信息,其中功能基因丰度较大的为碳水化合物代谢和氨基酸代谢,且脐橙夏天叶片的细胞过程和环境信息处理功能信息高于其他3种样品,幼果的遗传信息处理、新陈代谢、有机系统和人类疾病功能信息高于其他3种样品。【结论】纽荷尔脐橙内生细菌群落多样性丰富,具有大量代谢相关的有益菌,研究结果可为今后探索纽荷尔脐橙内生细菌菌群的利用和柑橘溃疡病的生物防治提供思路。

关键词：纽荷尔脐橙内生细菌多样性功能预测高通量测序群落结构 Tax4Fun功能预测

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腾冲红花油茶花梗内生细菌的多样性

南方农业学报 2023年第7期54卷 1997-2004页

作者：黄融吴晓漫荀利杰孟庆鑫田亚凯董坤龚雪阳董霞云南农业大学动物科学技术学院/云南农业大学东方蜜蜂研究所/云南省蜜蜂资源可持续利用工程研究中心云南昆明650201 云南农业大学食品科学技术学院云南昆明650201

【目的】探究腾冲红花油茶花梗内生细菌群落结构及其多样性,为腾冲红花油茶花梗中有益微生物的筛选和利用提供科学依据。【方法】采集12和60年生树龄的腾冲红花油茶花梗,基于高通量测序技术探究其内生细菌多样性及群落结构差异。【结果... 详细信息

【目的】探究腾冲红花油茶花梗内生细菌群落结构及其多样性,为腾冲红花油茶花梗中有益微生物的筛选和利用提供科学依据。【方法】采集12和60年生树龄的腾冲红花油茶花梗,基于高通量测序技术探究其内生细菌多样性及群落结构差异。【结果】分类操作单元(OTU)和α多样性分析表明,2种树龄腾冲红花油茶花梗内生细菌丰富度和物种种类存在差异。在2种树龄腾冲红花油茶花梗中均检测出4个细菌门,其中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度最高,在2组样品中占比均达60%以上。60年生样品检测到的特有细菌属包括游动放线菌属(Actinoplanes)、小单孢菌科未分类属(unclassified_f_Micromonosporaceae)和甲基球菌科未分类属(unclassified_f_Methylopilaceae),优势细菌属为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基杆菌—原单胞菌属(Methylobacterium-Methylorubrum)、1174-901-12、羊膜杆菌属(Amnibacterium)和Kineosporia;12年生样品的优势细菌属为1174-901-12、鞘氨醇单胞菌属、甲烷氧化细菌属(Methylocella)、酸杆菌属(Terriglobus)和甲基杆菌—原单胞菌属。2组样品中部分内生细菌在门和属水平的相对丰度呈显著差异(P内生细菌的基因功能主要涉及碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢等。【结论】腾冲红花油茶花梗含有丰富的内生细菌,树龄大的腾冲红花油茶花梗中内生细菌多样性和丰富度显著增多,且优势细菌种类和相对丰度也发生改变。挖掘和利用腾冲红花油茶功能菌株时需充分考虑树龄因素。

关键词：腾冲红花油茶树龄内生细菌多样性高通量测序

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烟草种子内生细菌群落结构与多样性

微生物学报 2020年第3期60卷 601-616页

作者：谢红炼汪汉成蔡刘体周浩刘畅陆宁史彩华王香萍长江大学农学院湖北荆州434025 贵州省烟草科学研究院贵州贵阳550081 长江大学生命科学学院湖北荆州434025

【目的】为了解烟草种子内生细菌的群落结构和多样性。【方法】分别对3个品种(K326、云烟85、云烟87)烟草种子内生细菌的16S rRNA基因V3–V4区进行扩增,采用Illumina MiSeq测序技术对扩增片段进行高通量测序,并对3个品种烟草种子内生细... 详细信息

【目的】为了解烟草种子内生细菌的群落结构和多样性。【方法】分别对3个品种(K326、云烟85、云烟87)烟草种子内生细菌的16S rRNA基因V3–V4区进行扩增,采用Illumina MiSeq测序技术对扩增片段进行高通量测序,并对3个品种烟草种子内生细菌群落结构和多样性进行分析。【结果】3个品种种子共获得的V3–V4区高质量序列片段128558条,Shannon指数计算为2.03–3.73,K326和云烟85内生菌多样性指数高于云烟87。3品种烟草种子内生细菌的优势门均为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicute和拟杆菌门Bacteroidete。3个品种烟草种子内生细菌共有菌属共有27个,K326和云烟85的最优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas),云烟87的最优势菌属为大肠杆菌志贺菌属(Escherichia-shigella)。16S功能预测显示各种子中产生了丰度较高的蛋白质、核苷酸、糖类、辅酶及代谢产物合成的有益功能信息。【结论】烟草种子内生细菌多样性丰富,不同品种种子细菌群落组成基本相似,其丰度存在一定差异性。种子中存在的潜在有益细菌包括假单胞菌、类芽孢杆菌、根瘤菌、马赛菌、藤黄单胞菌、萨勒河菌、Lelliottia菌等,具有大量代谢相关的有益功能。研究结果为今后烟草种子内生菌的功能研究和利用以及种子病害生物防控提供参考信息。

关键词：烟草种子内生细菌多样性 Illumina 高通量测序群落结构

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植物内生细菌对植物健康的作用

植物医生 2020年第1期33卷 6-11页

作者：张淑婷周利华赵文卓西南大学植物保护学院重庆400715

植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类群,存在于没有外在感染症状的健康植物组织内,并与宿主植物协同进化.随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断更新,植物内生菌与植物健康的关系以及应用逐渐成为研究热点.本文主要综述了内生... 详细信息

植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类群,存在于没有外在感染症状的健康植物组织内,并与宿主植物协同进化.随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断更新,植物内生菌与植物健康的关系以及应用逐渐成为研究热点.本文主要综述了内生细菌的多样性、进入植物组织内的机制以及内生细菌的主要功能及应用,提出了现阶段内生菌研究存在的问题,并展望了内生菌研究的前景.

关键词：植物内生细菌内生细菌多样性应用功能

土壤Zn污染水平对东南景天内生菌多样性及其定殖分布特征影响

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土壤Zn污染水平对东南景天内生菌多样性及其定殖分布特征影响

作者：陆丽婷华南农业大学

学位级别：硕士

东南景天是一种锌、镉超积累植物,其体内含有大量的内生菌。研究表明,东南景天的内生菌多样性受环境因素、宿主植物、内生细菌本身等影响,其中土壤环境对它的影响尤为重要。但目前关于东南景天在锌污染水平下的内生菌的群落结构及其定... 详细信息

东南景天是一种锌、镉超积累植物,其体内含有大量的内生菌。研究表明,东南景天的内生菌多样性受环境因素、宿主植物、内生细菌本身等影响,其中土壤环境对它的影响尤为重要。但目前关于东南景天在锌污染水平下的内生菌的群落结构及其定殖分布特征差异尚不清楚。因此,本研究以东南景天为研究对象,通过高通量测序的方法,分析其根际土壤、根系、茎和叶片组织内生菌多样性差异,并探讨土壤环境因子和植物组织中的重金属含量对内生菌多样性的影响;进一步利用平板菌落技术方法结合双光子激光共聚焦显微镜观察的方法,检测绿色荧光标记菌ⅡL-GFP在东南景天植根系、茎、叶片及根际土壤定殖的情况,以期从土壤-植物-内生菌的相互作用的角度来补充阐释东南景天对锌吸收、积累及解毒的生理生态机制。本论文取得的主要研究结果如下:(1)在门水平上,东南景天的茎、叶的优势菌门为变形菌门、蓝细菌门、拟杆菌门和放线菌门;而根系为变形菌门、放线菌门和拟杆菌门。不同Zn污染水平下,东南景天茎和叶片中的拟杆菌门和放线菌门的相对丰度随着Zn浓度增加而不断增加,而蓝细菌门则不断减少,变形菌门则先增加后减少;东南景天根系中的拟杆菌门和放线菌门的相对丰度随着Zn浓度增加而不断增加,而变形菌门则不断减少。不同性质土壤中,种植在Zn浓度为500 mg·kg土壤(Zn500)中的东南景天,其茎叶体内的变形菌门、拟杆菌门和放线菌门的相对丰度均高于复合污染土壤(MMPS),而蓝细菌门则与之相反。(2)在纲水平上,东南景天的优势菌纲主要为α-变形菌纲、β-变形菌纲、纤维粘网菌纲、Saprospirae和放线菌纲。不同Zn污染水平下,东南景天叶片体内的α-变形菌纲、纤维粘网菌纲和Saprospirae随着Zn浓度增加而不断增加,而β-变形菌纲则不断减少;东南景天茎体内的α-变形菌纲随着Zn浓度增加而不断增加,而纤维粘网菌纲、放线菌纲则不断减少,其中β-变形菌纲呈现先增加后减少降的趋势;东南景天根系中的α-变形菌纲、放线菌纲和纤维粘网菌纲随着Zn浓度增加而不断增加,而β-变形菌纲和Saprospirae则先增加后减少。不同性质土壤中,种植在Zn500土壤上的东南景天体内(叶茎根)的α-变形菌纲、β-变形菌纲、放线菌纲等菌纲的相对丰度均高于种植在MMPS土壤中的东南景天。(3)在属水平上,东南景天的优势菌属主要为链霉菌属、Flavisolibacter、鞘氨醇单胞菌、Paucibacter、红长命菌属、柠檬酸细菌属、罗尔斯顿菌属、假黄色单胞菌属、Acidovorax、柄细菌属、伯克氏菌属和土壤杆菌属等。CCA分析发现东南景天内生细菌的多样性受植物组织Zn含量、土壤有效Zn含量、土壤营养水平等的影响。Spearman相关性的热图分析表明,贪铜菌属、罗尔斯顿菌属假诺卡氏菌属、黄杆菌属主要受叶组织与根际土壤Zn含量的影响;食酸菌属、鞘氨醇单胞菌、无色杆属、黄杆菌属主要受茎组织与根际土壤Zn的影响;伯克氏菌属、根瘤菌属主要受根系组织与根际土壤Zn的影响。(4)标记菌株ⅡL-GFP不仅成功在东南景天扦插苗与组培苗的根际土壤中定殖,且可以通过根系侵入植物体内,进一步向地上部(茎和叶片)迁移,并成功在茎和叶片组织中定殖;在同一取样时间,ⅡL-GFP的数量均表现为根际土壤>根系>茎>叶片;此外,到幼嫩的茎叶组织中更适合于ⅡL-GFP的生长繁殖。基于双光子共聚焦显微镜观察结果可知,在器官水平,标记菌株数量及荧光强度表现为根系>>茎>叶片;在组织水平,标记菌株菌ⅡL-GFP主要分布在根系组织的表皮层,茎和叶片组织的维管组织;在细胞水平,标记菌株菌ⅡL-GFP主要分布在细胞间隙。初步表明内生菌是避开植物Zn浓度高的部位进行生长与定殖的。综上所述,本研究能初步知道,东南景天体内内生菌的群落结构多样性随着土壤Zn浓度水平与性质而发生变化;同时,内生菌是避开植物Zn浓度高的部位进行生长与定殖的。

关键词：东南景天内生细菌多样性高通量测序锌标记菌株Ⅱ8L4-GFP 侵染途径

豌豆成熟期内生菌多样性及固氮菌促生长的研究

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豌豆成熟期内生菌多样性及固氮菌促生长的研究

作者：刘璐青岛科技大学

学位级别：硕士

豌豆（Pisum sativum L.）是蔷薇目蝶形花科豌豆属作物,其营养全面、种植广泛。在豌豆的整个生长周期中,豌豆植株的内生细菌扮演十分重要的角色,因此关于豌豆内生菌的研究逐渐受到科研工作者的重视。植物成熟期是农业生产的重要阶段,对... 详细信息

豌豆（Pisum sativum L.）是蔷薇目蝶形花科豌豆属作物,其营养全面、种植广泛。在豌豆的整个生长周期中,豌豆植株的内生细菌扮演十分重要的角色,因此关于豌豆内生菌的研究逐渐受到科研工作者的重视。植物成熟期是农业生产的重要阶段,对这个时期的内生菌进行研究,有助于改善作物质量和产量。本研究对不同豌豆品种成熟期的叶片、根部、荚皮和荚豆共152个样品的内生细菌进行Illumina MiSeq高通量测序,得到样本的多样性分析,研究内生细菌群落的组成、丰度和多样性,以及纵向研究苗期、花期和成熟期的豌豆中内生菌的传递性,这有助于豌豆菌种资源库的构建,为进一步的研究应用打下理论基础;同时,对样品的内生细菌进行分离,鉴定其菌株形态,并筛选得到具有固氮酶活、溶解无机磷和有机磷、解钾、ACC脱氨酶、分泌吲哚乙酸、纤维素酶和果胶酶促生特性的固氮细菌;最后,将促生特性优良的固氮菌株,应用到甘薯苗培育和田间种植的初步实验中,探究其对甘薯的种植和产量等方面的初步影响。主要的研究结果如下:（1）成熟期豌豆叶片、根部、荚皮和荚豆共152个样品的微生物多样性分析表明,这些组织中丰度最高的4个门是变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）。同时,对不同组织的属水平统计得到,叶片、根部、荚皮和荚豆中分别得到850个属、890个属、874个属和815个属,其中,根部微生物群落的多样性最高,其次是叶片和荚皮,荚豆的微生物多样性最低。（2）成熟期不同品种豌豆的不同组织进行组内和组间多样性结果表明,同一品种中微生物多样性和群落丰度较为相近,不同品种中微生物多样性和群落丰度存在差异,不同的组织中微生物多样性和群落丰度存在明显差异,同时,在不同品种的不同组织中,特异性菌株的丰度不同。（3）苗期、花期和成熟期的叶片和根部分别进行主成分分析表面,对于苗期叶片SL、花期叶片FL、成熟期叶片ML来说,大部分样品的群落总体差异性比较大,小部分样品的微生物群落具有一定的相似度,说明叶片中的细菌群落传递性较低,受外界环境影响较大;对于苗期根SR、花期根FR和成熟期根MR来说,除了个别样品的内生细菌群落差异性较大外,大部分样品中的内生细菌群落结构相似度较高,且分布较为均匀,说明根部的细菌群落传递性较高。（4）成熟期豌豆叶片、根部、荚皮和荚豆中共得到86株内生固氮细菌,并进行形态学统计,大部分菌株是为圆形或近圆形、淡黄色和白色、边缘整齐、不透明、表面隆起、湿润且不分泌特殊物质。其中共筛选得到49株具有固氮酶活特性的内生细菌,固氮酶活能力较高的菌株有MQK10、MQK44和MQK76。（5）成熟期豌豆不同组织中共筛选得到51株可以溶解无机磷的内生细菌,20株可以溶解有机磷的内生细菌,8株可以溶解钾长石粉的内生细菌,其中,有13株内生细菌可以同时溶解无机磷和有机磷,有2株内生细菌可以同时溶解无机磷、有机磷和钾,这两株菌为MQK41和MQK47。（6）成熟期豌豆不同组织中共筛选得到83株可以分泌吲哚乙酸IAA的菌株,其中菌株MQK07、MQK10等分泌IAA的能力比较强,浓度超过3μg/mL。同时,共筛选得到56株具有ACC脱氨酶能力的菌株。（7）成熟期豌豆不同组织中共筛选得到51株具有纤维素酶活、22株具有果胶酶活的内生细菌,另外有20株菌株同时具有纤维素酶和果胶酶能力。（8）成熟期豌豆组织中筛选得到性质较好的内生固氮菌,扩繁制备微生物菌剂应用到甘薯的种植初步实验中,可以得到,与没有菌剂处理的对照组甘薯苗相比,微生物菌剂处理组甘薯苗在育苗期间出现白色汁液多、叶间距变短、叶面积变大等优良特征,同时处理组甘薯苗在快繁期间继续保持了这些较为优良的性状,在大田种植收获后,结果表明菌剂处理显著的提高了甘薯苗的生长质量和甘薯的产量。综上所述,本论文既重点探究了豌豆成熟期中内生菌群的结构特征,又探究了内生菌在不同发育时期的传递规律;本论文还构建了具有促生长特性内生菌的种质库,优异的促生菌促进了甘薯苗的健康成长,提高了甘薯产量。

关键词：豌豆内生细菌多样性传递性固氮菌促生长特性