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基于转录组测序构建食管腺癌预后相关的内源竞争rna网络

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浙江医学 2021年第10期43卷 1080-1084,1095,I0006页

作者：陈超李冬童国俊胡四平湖州市中心医院(湖州师范学院附属中心医院)麻醉科 313000

目的挖掘食管腺癌中内源竞争rna(cernas)网络,探索预后影响机制。方法提取癌症和肿瘤基因图谱计划(TCGA)数据库中正常食管组织和食管腺癌组织转录组数据,挖掘差异表达且与预后相关的长链非编码rna(lncrna)、短链非编码rna(mirna)及mrna... 详细信息

目的挖掘食管腺癌中内源竞争rna(cernas)网络,探索预后影响机制。方法提取癌症和肿瘤基因图谱计划(TCGA)数据库中正常食管组织和食管腺癌组织转录组数据,挖掘差异表达且与预后相关的长链非编码rna(lncrna)、短链非编码rna(mirna)及mrna。采用权重基因共表达网络分析预后相关基因的关联性,构建cerna网络。采用基因集富集分析(GSEA)探索影响预后的可能机制。结果ACO87388.1、AC131009.3、miR-29c-3p、CDK1、TPX2是在正常组织和食管腺癌组织中预后相关的差异表达基因,并可构成ACO87388.1/miR-29c-3p/CDK1、ACO87388.1/miR-29c-3p/TPX2、AC131009.3/miR-29c-3p/CDK1、AC131009.3/miR-29c-3p/TPX2四种cerna调控网络。结论ACO87388.1、AC131009.3、miR-29c-3p、CDK1和TPX2是影响食管癌患者预后的重要分子。

关键词：癌症和肿瘤基因图谱计划食管腺癌内源竞争rna 基因集富集分析

长非编码rna ILF3-AS1通过调控miR-130a-3p/PTEN轴抑制宫颈癌细胞的增殖

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中国生物化学与分子生物学报 2021年第4期37卷 524-532页

作者：胡盈盈毛蕾蕾潘镏镏屈王蕾温州医科大学附属第二医院妇产科温州市中心医院妇产科浙江温州325000

ILF3反义rna 1(ILF3 antisense rna 1,ILF3-AS1)是一条定位于染色体19p13.2的lncrna,它是白介素增强子结合因子3(interleukin enhancer binding factor 3,ILF3)的反义rna。ILF3-AS1在多种肿瘤发生发展中发挥关键作用,但其在宫颈癌中的作用尚无研究探讨。本文利用TCGA及GTEx数据库进行生物信息学分析提示,ILF3-AS1在宫颈癌组织中低表达(Prna(Prna(P<0.001)及蛋白质(P<0.001)的表达升高被明显抑制。综上,ILF3-AS1可以作为miR-130a-3p的吸附海绵靶向调控PTEN表达,从而抑制宫颈癌细胞的增殖。

关键词：长非编码rna ILF3反义rna miR-130a-3p 内源竞争rna 宫颈癌

葡萄膜黑色素瘤生存预后相关lncrna的初步筛选及相关性分析

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中华眼视光学与视觉科学杂志 2022年第3期24卷 208-215页

作者：尚会平林祥祥温州医科大学附属眼视光医院眼视光学和视觉科学国家重点实验室温州325027 温州医科大学附属第一医院浙江省神经老化与疾病研究重点实验室温州325015

目的:通过构建lncrna-mirna-mrna的内源竞争rna(cerna)网络,筛选与葡萄膜黑色素瘤(UM)生存预后相关的长链非编码rna(lncrna),并进行相关性分析。方法:以生物信息学为手段,通过疾病预后相关分析,Lncrna亚细胞定位检索,从肿瘤基因组图谱... 详细信息

目的:通过构建lncrna-mirna-mrna的内源竞争rna(cerna)网络,筛选与葡萄膜黑色素瘤(UM)生存预后相关的长链非编码rna(lncrna),并进行相关性分析。方法:以生物信息学为手段,通过疾病预后相关分析,Lncrna亚细胞定位检索,从肿瘤基因组图谱数据库中筛选lncrna表达数据集。通过mircode数据库和targetscan数据库找到lncrnas对应的靶microrna(mirna),Venn分析筛选出共同的与UM预后相关的mirna。在多个数据库中同时检索,筛选出共同的mirna-mrna。通过KEGG富集与lncrna-mirna-mrna网络可视化,最终确定出与UM生存预后相关的候选lncrna。结果:在对lncrna的下游靶mirna及功能基因的预测中,鉴定出了630对候选mirna-mrna。通过cerna调控基因表达的机制,筛选出了9个可能发挥cerna功能的lncrna。KEGG分析得到lncrna的下游调控基因主要富集在参与肿瘤病理进程的信号通路中。SHNG6可能通过调控has-miR-214-5p、has-miR-214-3p、has-miR-let-7b-5p、has-miR-let-7c-3p等mirnas,调节下游的功能基因BAX、IGF1R、KRAS、PIK3R1、PDGFD等。结论:lncrnas通过cernas机制,调控一系列参与肿瘤发生发展的致癌基因的表达,影响UM的预后及治疗,SHNG6、LINC01278等lncrnas可能在其发生发展、迁移及侵袭等方面扮演着重要角色。

关键词：葡萄膜黑色素瘤长链非编码rna 内源竞争rna

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环状rna在肿瘤发生发展过程中的作用

中国老年学杂志 2019年第14期39卷 3597-3599页

作者：李欣张金凤周丽艳吉林工程职业学院

环状rna(circular rna)在真核细胞基因表达过程中起到重要的调控作用〔1~3〕。最近的研究表明,circrna在肿瘤的发生、进展和治疗抵抗过程中同样发挥着重要的基因调控功能〔4~6〕,可以作为肿瘤抑制剂或加速器发挥作用〔5〕。随着高通量... 详细信息

环状rna(circular rna)在真核细胞基因表达过程中起到重要的调控作用〔1~3〕。最近的研究表明,circrna在肿瘤的发生、进展和治疗抵抗过程中同样发挥着重要的基因调控功能〔4~6〕,可以作为肿瘤抑制剂或加速器发挥作用〔5〕。随着高通量测序技术的发展,已经可以很容易的比较circrna在肿瘤组织和癌旁组织中表达水平的差异。截至目前,已经发现数千个在肿瘤组织表达水平明显变化的circrna 〔7〕。

关键词：环状rna 肿瘤内源竞争rna 肿瘤分子标志物基因表达调控

骆驼蓬灵调节circ-0002978/miR-130b-3p/MEOX2抑制结直肠癌的转移

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骆驼蓬灵调节circ-0002978/miR-130b-3p/MEOX2抑制结直肠癌的转移

作者：王恺龙天津中医药大学

学位级别：硕士

目的:骆驼蓬(Peganum harmala L.)为蒺藜科骆驼蓬属多年生草本植物,骆驼蓬中β-咔啵啉类生物碱骆驼蓬碱已有报道称其具有抗癌的作用效果,本文则探究结构与骆驼蓬碱相似的骆驼蓬灵(Harmaline)对于结直肠癌转移的抑制作用。考察结直肠癌中... 详细信息

目的:骆驼蓬(Peganum harmala L.)为蒺藜科骆驼蓬属多年生草本植物,骆驼蓬中β-咔啵啉类生物碱骆驼蓬碱已有报道称其具有抗癌的作用效果,本文则探究结构与骆驼蓬碱相似的骆驼蓬灵(Harmaline)对于结直肠癌转移的抑制作用。考察结直肠癌中circ-0002978/mi R-130b-3p/MEOX2与转移之间的关系,阐明骆驼蓬灵对于结直肠癌中circ-0002978/mi R-130b-3p/MEOX2通路的作用,为结直肠癌转移的治疗提供理论依据。方法:(1)MTT实验探究骆驼蓬灵对结直肠癌细胞活力的抑制作用;(2)克隆形成实验探究骆驼蓬灵对结直肠癌细胞单细胞克隆能力的影响;(3)小鼠皮下瘤实验验证骆驼蓬灵对结直肠癌肿瘤的抑制作用;(4)聚合酶链式反应(PCR)探究结直肠癌细胞HCT116、SW480中敲除circ-0002978后mi R-130b-3p表达量的变化、考察骆驼蓬灵对于circ-0002978表达的作用和骆驼蓬灵对于mi R-130b-3p的作用以及mi R-130b-3p的下游靶标MEOX2的调控机制;(5)双荧光素酶报告基因实验(Dual-Luciferase reporter assay)验证circ-0002978与mi R-130b-3p之间的结合以及mi R-130b-3p与MEOX2之间的结合;(6)划痕实验考察骆驼蓬灵以及敲除circ-0002978后、过表达mi R-130b-3p后和敲除circ-0002978或过表达mi R-130b-3p后给予骆驼蓬灵对结直肠癌细胞转移能力的影响;(7)Transwell实验考察结直肠癌细胞在敲除circ-0002978、过表达mi R-130b-3p并给予骆驼蓬灵对细胞转移能力的变化;(8)免疫印迹实验(Western Blot)探究结直肠癌细胞在敲除circ-0002978、过表达mi R-130b-3p及给予骆驼蓬灵后转移相关的标志性蛋白:波形蛋白(Vimentin,VIM),上皮钙黏蛋白(E-cadherin,E-CAD)的变化;(9)网络药理学探究mi R-130b-3p在正常人与癌症病人之间表达量的差异以及mi R-130b表达在癌症病人中的生存率的差异。结果:***实验结果表明骆驼蓬灵对于结直肠癌细胞SW480及HCT116的生存活力均有抑制作用;2.克隆形成实验表明骆驼蓬灵有抑制结直肠癌细胞的增殖能力;3.小鼠皮下瘤实验表明骆驼蓬灵可抑制结直肠癌皮下肿瘤的生长;***实验结果表明:(1)在结直肠癌细胞中敲除circ-0002978后mi R-130b-3p的表达量升高,给予骆驼蓬灵后促进结直肠癌细胞中circ-0002978的表达同时抑制mi R-130b-3p的表达;(2)过表达mi R-130b-3p后MEOX2的m rna水平降低,在结直肠癌细胞中给予骆驼蓬灵后mi R-130b-3p表达降低,同时MEOX2的m rna及蛋白表达量升高。5.双荧光素酶报告基因实验结果表明circ-0002978与mi R-130b-3p存在结合位点,同时mi R-130b-3p结合在MEOX2 m rna 3’UTR区域。6.划痕实验结果表明敲除circ-0002978或过表达mi R-130b-3p,结直肠癌细胞更易发生转移,给予骆驼蓬灵后细胞的转移能力受到抑制。***实验结果表明敲除circ-0002978或过表达mi R-130b-3p后结直肠癌细胞的侵袭能力增强,给予骆驼蓬灵后细胞的侵袭能力受到了抑制。*** Blot表明敲除circ-0002978或过表达mi R-130b-3p后转移相关的标志性蛋白VIM表达量升高,E-CAD的表达量降低;给予骆驼蓬灵后可降低VIM的表达,升高E-CAD的表达量;同时骆驼蓬灵促进MEOX2的蛋白表达。9.网络药理学结果显示与正常人相比患有结直肠癌的病人中mi R-130b-3p的表达量高,生存率分析表明在结直肠癌病人中高表达mi R-130b-3p的病人具有较低的生存率。结论:1.骆驼蓬灵抑制结直肠癌的增殖、转移和侵袭;2.骆驼蓬灵上调circ-0002978的表达,抑制mi R-130b-3p的表达,促进MEOX2的m rna和蛋白表达。

关键词：结直肠癌骆驼蓬灵内源竞争rna 转移

Lncrna PGC1β-OT1对脂肪细胞分化的影响

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LncRNA PGC1β-OT1对脂肪细胞分化的影响

作者：徐晓薇天津医科大学

学位级别：硕士

目的:肥胖是多种代谢性疾病发生发展的重要危险因素,主要以脂肪细胞过度增大、畸形增长和脂肪组织的过量累积为特征。脂肪细胞是脂肪组织的主要成分,且由间充质干细胞分化形成。尽管我们对脂肪分化过程中的主要分子路径有一定的认识,但... 详细信息

目的:肥胖是多种代谢性疾病发生发展的重要危险因素,主要以脂肪细胞过度增大、畸形增长和脂肪组织的过量累积为特征。脂肪细胞是脂肪组织的主要成分,且由间充质干细胞分化形成。尽管我们对脂肪分化过程中的主要分子路径有一定的认识,但对于脂肪形成中长链非编码rna(Long non-coding rna,Lncrna)的调控作用还知之甚少。长链非编码rna是非编码rna中最丰富的一种,并在细胞分化过程中扮演着多种角色。本研究旨在探讨Lncrna在脂肪细胞分化过程中的作用,以特定Lncrna为对象,研究其对脂肪细胞分化的调控及具体的分子机制。方法:1、利用基因芯片技术筛选出在脂肪细胞分化过程中差异表达的Lncrna PGC1β-OT1;采用RT-qPCR技术检测其在脂肪细胞分化过程中的丰度变化;使用5’RACE和3’RACE技术和生物信息学方法分析PGC1β-OT1的长度、编码蛋白能力等基本特征;2、构建和设计PGC1β-OT1的过表达载体及其sirna,分别将空载体及过表达载体或阴性对照(NC)及sirna转染至ST2小鼠骨髓基质细胞,并对其进行成脂诱导分化,通过油红O染色、RT-qPCR和Western Blotting等方法检测受转染细胞的脂肪细胞分化程度,确认PGC1β-OT1在功能获得和功能缺失状态下对脂肪细胞分化的影响;3、通过生物信息学技术预测与PGC1β-OT1结合的mirna(miR-148a-3p);构建PGC1β-OT1和PGC1β-OT1上进行miR-148a-3p结合位点突变的两种报告基因载体;使用双荧光素酶报告基因技术验证PGC1β-OT1是否存在与miR-148a-3p相互结合的作用位点;4、RT-qPCR检测PGC1β-OT1与miR-148a-3p在脂肪细胞分化过程中的表达变化,使用RT-qPCR和Western Blotting方法检测miR-148a-3p的靶基因赖氨酸特异性因子6b(KDM6B)mrna和蛋白表达水平,验证PGC1β-OT1是否通过结合miR-148a-3p而调节其靶基因的蛋白水平;5、采用拯救实验在ST2细胞中转染PGC1β-OT1或/和miR-148a-3p,并对其进行成脂诱导分化,通过油红O染色、RT-qPCR和Western Blotting方法检测脂肪细胞分化,验证PGC1β-OT1是否通过作用于miR-148a-3p而影响脂肪细胞分化。结果:1、根据基因芯片检测结果,PGC1β-OT1在原代培养的骨髓间充质干细胞(MSC)和ST2细胞成脂分化过程中表达量均上升,5’RACE和3’RACE确定PGC1β-OT1全长为1759bp,Coding potential calculator在线软件分析显示PGC1β-OT1无编码蛋白质能力。2、ST2细胞转染PGC1β-OT1过表达载体后,细胞分化为成熟脂肪细胞程度降低,脂肪细胞成脂特异性基因的mrna和蛋白表达减少;ST2细胞转染sirna敲减内源性PGC1β-OT1后,细胞形成脂滴增多,脂肪细胞成脂特异性基因的mrna和蛋白表达增加。3、生物信息学分析显示,PGC1β-OT1上有潜在的miR-148a-3p结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-148a-3p可降低PGC1β-OT1报告基因载体的荧光素酶活性;当PGC1β-OT1上的miR-148a-3p结合位点突变后,对应报告基因载体的荧光素酶活性并未下降。表明PGC1β-OT1上存在与miR-148a-3p的相互结合的位点。4、RT-qPCR结果显示,PGC1β-OT1在一定程度上影响了miR-148a-3p的表达。此外,过表达PGC1β-OT1能够提升miR-148a-3p的靶基因KDM6B的蛋白表达水平。而当PGC1β-OT1上的miR-148a-3p结合位点突变后,KDM6B的蛋白表达水平则无变化。说明PGC1β-OT1能够通过miR-148a-3p调控其靶基因KDM6B的蛋白表达水平。5、miR-148a-3p可促进脂肪细胞分化,PGC1β-OT1可抑制脂肪细胞分化;miR-148a-3p可以逆转PGC1β-OT1对脂肪细胞分化的抑制作用;而过表达PGC1β-OT1则减弱了miR-148a-3p的促脂肪细胞分化作用。说明PGC1β-OT1是通过与miR-148a-3p的结合和相互作用,对脂肪细胞分化进行负向调控。结论:1、PGC1β-OT1在脂肪细胞分化中发挥负向调节作用;2、PGC1β-OT1可以作为miR-148a-3p的内源性竞争分子来调控脂肪细胞分化。

关键词： PGC1β-OT1 脂肪细胞脂肪细胞分化微小rnas miR-148a-3p 内源竞争rna

FENDRR在宣威地区人群肺癌发生发展中分子机制的初步探讨

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FENDRR在宣威地区人群肺癌发生发展中分子机制的初步探讨

作者：赵瑜昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]云南宣威地区肺癌高发,具有非吸烟女性群体高发、患病群体年轻化等特点,并且缺乏有效的诊治指标。在前期基础之上,本研究目的是对差异表达的lncrnaFENDRR在宣威地区肺癌中的作用机制进行初步探讨。[方法]收集23对来自宣威地区肺... 详细信息

[目的]云南宣威地区肺癌高发,具有非吸烟女性群体高发、患病群体年轻化等特点,并且缺乏有效的诊治指标。在前期基础之上,本研究目的是对差异表达的lncrnaFENDRR在宣威地区肺癌中的作用机制进行初步探讨。[方法]收集23对来自宣威地区肺癌患者的手术标本,利用生物芯片对患者的癌组织和癌旁组织进行检测,筛选差异表达的lncrna和mrna,通过生物信息学分析构建差异表达基因共表达网络并结合GO分析进一步筛选出lncrna FENDRR的靶基因。通过提取10对宣威地区肺癌患者的癌及癌旁组织总rna,应用实时荧光定量PCR对筛选出的lncrna FENDRR和靶基因在10对组织中表达水平进行检测,验证芯片结果的准确性。基于cerna(competing endogenous rnas,内源竞争rna)假说,在体外构建过表达和干扰FENDRR的宣威肺癌细胞株XLA-07细胞,进一步验证FENDRR和靶基因表达水平的相关性。通过结合细胞生物芯片和数据库检索,预测FENDRR调控靶基因的作用机制。[结果]通过生物芯片的检测和分析,计算基因差异表达倍数log2|Fold Change(linear)|≥2以及p-valuerna共995条,其中表达上调的lncrna有396条,差异表达的mrna共1948条,其中表达上调的mrna有724条,表达下调的mrna有1224条;结合生物芯片检测结果和生物信息学分析,筛选出具有研究价值的lncrnaFENDRR靶基因KLF4。经荧光实时定量PCR检测10对宣威地区肺癌患者癌组织和癌旁组织中FENDRR和KLF4的表达水平,结果与芯片检测结果一致证实了芯片结果的可靠性。体外构建FENDRR过表达和干扰细胞株,通过实时荧光定量PCR检测发现KLF4与FENDRR的表达水平一致。结合细胞表达谱芯片和数据库检索,筛选出FENDRR 通过 cerna 模式作用于 hsa-miR-424-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-1 0a-5p 等基因来调控 KLF4 的表达,进而证明 FENDRR在宣威地区肺癌中的作用机制。[结论]利用生物芯片发现了在宣威地区肺癌患者肺癌组织中差异表达的lncrna和mrna,进一步筛选出较有研究价值的lncrnaFENDRR的靶基因KLF4。实时荧光定量PCR对芯片筛选结果进行验证,结果证明芯片结果可靠。LncRAN FENDRR 可能通过竞争性结合 hsa-miR-424-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-10a-5p等基因,从而对KLF4的表达水平进行调控,从而导致了宣威地区肺癌患者预后不良。

关键词：宣威地区肺癌长链非编码rna 内源竞争rna 作用机制分子标志物

缺血性脑卒中风痰瘀阻证环状rna表达谱研究

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缺血性脑卒中风痰瘀阻证环状RNA表达谱研究

作者：黄静妍广西中医药大学

学位级别：硕士

目的:环状rna(Circular rna,Circrna)是一种非编码rna。它是一个封闭环状结构,不具备有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴,不易被核酸外切酶rnaseR降解,结构比线性rna更稳定,具备作为疾病诊断的生物标志物的潜质。研究发现circrna参与小... 详细信息

目的:环状rna(Circular rna,Circrna)是一种非编码rna。它是一个封闭环状结构,不具备有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴,不易被核酸外切酶rnaseR降解,结构比线性rna更稳定,具备作为疾病诊断的生物标志物的潜质。研究发现circrna参与小鼠大脑缺血灌注损伤的病理过程,但是,circrna对缺血性脑卒中(Ischemic stroke,IS)证候发生在临床水平的研究还未见报道。本研究旨在从临床水平探索影响缺血性脑卒中风痰瘀阻证发生的circrna,为从非编码rna层面揭示中医“证”的客观基础提供分子生物学依据。方法:本研究纳入了20名缺血性脑卒中风痰瘀阻证患者和20名健康对照。所有研究对象均来自中国汉族。本研究采用人外周血circrna表达谱微阵列芯片(Human Circular rna Array V2.0)检测对5名缺血性脑卒中风痰瘀阻证患者和5名健康对照进行circrna表达水平检测和分析。然后,在20名缺血性脑卒中风痰瘀阻证患者和20名健康对照中,采用实时荧光定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)对circrna表达谱微阵列芯片筛选出的4个差异表达的circrna进行进一步验证。采用生物信息学分析鉴别出circrna相对应的微小rna(microrna,mirna)以及mirna相对应的m rna,构建circrna-mirna-mrna网络和circrna-mrna共表达网络。并预测出mirna调控的信号通路。结果:***芯片一共检测出9241个环状rna,其中差异表达的circrna有288个(Prna和186个下调的circrna。在这些差异表达的circrna中,FDR小于0.05的circrna有21个,其中包括14个上调的circrna,7个下调的circrna。2.在288个差异表达的circrna中,其中差异表达的上调的circrna主要定位在12号染色体(7.84%)、1号染色体(6.86%)、3号染色体(6.86%)、9号染色体(6.86%)和16号染色体(6.86%)。而差异表达的下调的circ rna主要地位在2号染色体(10.29%)、17号染色体(9.71%)、1号染色体(7.73%)和14号染色体(6.84%)。在102个上调的circ rna中,93(91%)个circrna来源于外显子,6(6%)个circrna来源于正义重叠区,2(2%)个circrna来源于内含子,1(1%)circrna来源于反义链。在186个下调的circrna中,174(94%)个circrna来源于外显子,8(4%)个circrna来自于内含子,4(2%)个circrna来源于正义重叠区。3.在20名缺血性脑卒中风痰瘀阻证患者和20名健康对照中,hsaircrna02687(P=0.003),hsaircrna04600(P=0.017)和hsaircrna05035(Prna02687,hsaircrna04600,hsaircrna05035的表达水平均比健康对照的表达水平高。而hsaircrna06494的表达水平在缺血性脑卒中风痰瘀阻证患者和健康对照中没有发现明显差异(P>0.05)。***05035的受试者工作特征曲线下面积(Area Under Curve,AUC)比其他两个差异表达的circ rna的AUC大(AUC=0.83,95%CI:0.69-0.96),has-circrna02687的AUC为0.79(95%CI:0.61-0.91),hsaircrna04600的AUC为0.75(95%CI:0.60-0.91)。5.本研究经鉴别出21个FDR小于0.05的差异表达circrna相对应105个mirna,并对这3个circrna,15个mirna和277个mrna构建circrna-mirna-mrna网络。本研究还发现circrna-mirna-mrna网络中的15个mirna调控约119个信号通路,其中一些信号通路与中风发生密切相关,例如:TGF-beta信号通路、Wnt信号通路、PI3K–Akt信号通路和ErbB信号通路。6.本研究经鉴别出与102个表达上调的circrna共表达的编码基因有972个(PCC≥0.90且Prna构建circrna-mrna共表达网络。结论:1.本研究挖掘出缺血性脑卒中风痰瘀阻证的circrna表达谱和差异表达circR

关键词：环状rna 缺血性脑卒中风痰瘀阻证高通量微阵列芯片内源竞争rna

补体调节蛋白CD59对胶质瘤细胞增殖的调控作用及其机制研究

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补体调节蛋白CD59对胶质瘤细胞增殖的调控作用及其机制研究

作者：黄文钰陕西师范大学

学位级别：硕士

胶质瘤（Glioma）是中枢神经系统中最具侵袭性的原发性肿瘤,在成人脑肿瘤中的占比达到60%以上,且在不同患者中存在高度异质性。目前对胶质瘤的主流疗法仍依赖于手术切除,辅助以放化疗和替莫唑胺的治疗。但由于胶质瘤侵袭力强,疾病复发率... 详细信息

胶质瘤（Glioma）是中枢神经系统中最具侵袭性的原发性肿瘤,在成人脑肿瘤中的占比达到60%以上,且在不同患者中存在高度异质性。目前对胶质瘤的主流疗法仍依赖于手术切除,辅助以放化疗和替莫唑胺的治疗。但由于胶质瘤侵袭力强,疾病复发率高,通过治疗后患者的总体预后仍较差——其中位生存期仅为14-16个月。CD59是一类通过糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol,GPI）锚定在细胞膜上的补体调节蛋白,它通过抑制C5b-8和C9的结合从而限制膜攻击复合物（Membraneattackcomplex,MAC）的形成。肿瘤细胞可以通过CD59的高表达来保护自身免受补体介导的攻击,且肿瘤微环境中免疫细胞的功能会受到CD59的影响。因此肿瘤免疫疗法作为一种抗癌治疗策略目前备受关注。本实验以两种胶质瘤细胞系U87MG和U251MG为研究对象,使用慢病毒这一基因编辑工具向胶质瘤细胞转染短发卡核糖核酸（Short hairpin ribonucleic acid,shrna）从而敲低细胞CD59或转染编码序列（Codingsequence,CDS）过表达细胞CD59,并使用CD59的中和性抗体及膜锚定信号去除剂阻断CD59蛋白表达,观察胶质瘤细胞增殖的变化;进一步通过基因表达谱芯片检测、通路数据库整合分析（Ingenuitypathway analysis,IPA）及实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）验证,初步推测细胞周期蛋白CyclinD家族成员与CD59互为内源竞争核糖核酸（Competingendogenous ribonucleicacid,cerna）,并探讨了 CD59调控胶质瘤细胞增殖的作用机制。主要的研究内容及结果如下:1.胶质瘤细胞增殖的变化我们使用沉默CD59的慢病毒感染胶质瘤细胞以干扰CD59的信使核糖核酸（Messenger ribonucleic acid,mrna）,通过实时无标记细胞功能分析仪检测细胞的增殖曲线变化,并辅以活死细胞染色和AnnexinV染色。结果显示:胶质瘤细胞的增殖受到了抑制,且细胞并未发生凋亡或坏死,提示CD59的下调可能会影响胶质瘤细胞的增殖。且沉默CD59后细胞周期被阻滞在G1/S期。2.通过不同方法影响CD59的表达我们使用CD59的中和性抗体及膜锚定信号去除剂阻断CD59蛋白功能,并使用过表达CD59的慢病毒感染胶质瘤细胞上调CD59,通过RT-PCR检测CD59的表达情况。结果显示:阻断CD59的蛋白功能后细胞增殖并未受到抑制,而改变CD59mrna的表达后,细胞增殖随着mrna的表达量变化,mrna上调细胞增殖加快,mrna下调则细胞增殖受抑制。综合上述结果我们认为胶质瘤细胞的增殖受到CD59mrna表达水平的调控。***59调控胶质瘤细胞增殖的作用机制研究我们利用基因表达谱芯片检测及IPA数据分析,筛选出与CD59下调存在显著相关性的细胞周期蛋白基因,并发现了一条下调CD59后显著抑制细胞G1/S期的信号通路,且通过疾病与功能分析发现下调CD59明显影响了细胞的增殖功能。我们通过实验验证了其中部分基因与CD59表达下调的趋势相关,初步推测细胞周期蛋白CyclinD家族成员与CD59互为cerna。综上所述,本研究发现补体调节蛋白CD59对胶质瘤细胞的增殖有着显著调控作用,并初步探讨了该调控作用的机制,提示了 CD59可能作为胶质瘤的免疫治疗靶点,为脑胶质瘤的临床研究及靶向治疗提供了理论依据。

关键词：补体调节蛋白胶质瘤内源竞争rna 基因表达谱芯片