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生物化学与生物物理进展 2003年第5期30卷 702-705页

作者：李继霞周克元广东医学院生物化学与分子生物学研究所湛江524023

近来 ,人类发现了一些不同种类的小RNA分子 ,其中miRNA是人类新发现的一类小RNA ,它在进化上具有保守性 ,在数量、序列、结构、表达和功能上具有多样性 .目前 ,大约已发现了 10 0多种miRNA ,它们存在于不同的生物中 ,从四膜虫、线虫、... 详细信息

近来 ,人类发现了一些不同种类的小RNA分子 ,其中miRNA是人类新发现的一类小RNA ,它在进化上具有保守性 ,在数量、序列、结构、表达和功能上具有多样性 .目前 ,大约已发现了 10 0多种miRNA ,它们存在于不同的生物中 ,从四膜虫、线虫、植物、动物到人都已发现了不同的miRNA .miRNA的主要功能是调节内源基因表达 ,它在基因活动调控网络中扮演了重要的角色 .miRNA与siRNA关系密切 ,它们既具有相似性 ,又具有差异性 .小RNA分子研究将是今后分子生物学的研究热点之一 .

关键词： miRNA siRNA 小RNA 内源基因表达调节

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烟草曲茎病毒伴随卫星编码βC1蛋白增强病毒症状功能初步研究

烟草曲茎病毒伴随卫星编码βC1蛋白增强病毒症状功能初步研究

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作者：刘晓倩西南大学

学位级别：硕士

烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,Tb CSV)是双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的病毒,由烟粉虱(Bemisia tabaci)传播,在番茄、烟草等作物上造成病害。在田间,部分分离物伴随烟草曲茎伴随卫星(tobacco c... 详细信息

烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,Tb CSV)是双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的病毒,由烟粉虱(Bemisia tabaci)传播,在番茄、烟草等作物上造成病害。在田间,部分分离物伴随烟草曲茎伴随卫星(tobacco curly shoot betasatellite,TbCSB)。βC1蛋白是双生病毒伴随卫星编码的一个多功能蛋白,其功能包括RNA沉默抑制子、症状决定因子等多种功能。TbCSB与辅助病毒复合侵染,增强辅助病毒症状和病毒积累量,已在多种重要作物上造成严重的经济损失,但对于TbCSBβC1在病毒侵染过程中的具体作用机制及细节尚不明确。本研究利用分子克隆、转基因、酵母双杂交及定量PCR等实验技术,通过对TbCSB编码的βC1蛋白在寄主体内的功能进行分析,研究结果为进一步解析该病毒在侵染植株中的致病机理奠定了基础。为明确TbCSB编码的βC1对植株症状和病毒积累量的影响。首先对TbCSBβC1与其它双生病毒β卫星编码的βC1进行了同源性分析,结果发现其与中国番茄黄化曲叶病毒卫星(tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB-Y38,AJ420315)核苷酸相似性最高,为75.07%。随后将Tb CSV及TbCSB共同接种本氏烟,在接种第50天的时候可以观察到明显的曲茎症状,其病毒积累量与单独接种Tb CSV相比,上调30倍。基于马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)载体的系统表达技术,发现TbCSB编码的βC1可以诱导植株出现叶片卷曲和曲茎症状,接种植株中病毒积累量增加。在接种PVX-ΔβC1的植株上,可以观察到叶片上卷的现象,随后对其病毒积累量检测发现,与接种PVX-βC1相比,其中的病毒积累量下调表达了约82倍。转βC1基因植株上,可以观察到叶片皱缩和上卷的症状。在转βC1基因本氏烟植株接种Tb CSV后,与野生型植株接种Tb CSV相比,病毒积累量上调10倍以上。说明TbCSBβC1作为症状决定因子,能够使植株症状加重并且使其中的病毒积累量升高。为了明确Tb SCBβC1与Tb CSV及寄主因子的互作,利用酵母双杂交(Y2H)技术和双分子荧光互补技术(Bi FC)对可能与βC1存在互作的蛋白进行了探究。通过实验室前期研究发现TbCSB编码的βC1可能与Tb CSV编码的蛋白存在互作,随后通过Y2H技术和Bi FC验证了βC1与C2存在互作。并且对TbCSB编码的βC1及Tb CSV编码的C2在细胞中的亚细胞定位进行分析发现,当将βC1和C2单独接种本氏烟时,βC1定位于细胞核和细胞膜上,C2定位于细胞核内。为进一步解析TbCSB编码的βC1在病毒侵染过程中的作用功能,利用番茄文库,以p GBKT7为诱饵,通过酵母筛库筛选到了4个可能与βC1存在互作的蛋白。分别为solanum lycopersicum probable serine/threonine-protein kinase(STPK),solanum lycopersicum stromal 70 k Da heat shock-related protein(HSRP),solanum lycopersicum probable transcription factor At5g2804(TFAT),solanum lycopersicum chaperone protein dna J A7A,chloroplastic-like(A7A)。进一步利用Y2H技术验证了βC1与STPK存在互作。通过RT-q PCR方法探究了βC1对上述4个基因表达的影响结果表明,当接种PVX-βC1后,4个基因均下调表达,其中,STPK下调表达程度最大,与接种PVX-GUS相比,下调表达5倍左右。当接种Tb CSV和Tb CSV+TbCSB后,4个基因均上调表达,但是当Tb CSV+TbCSB共同接种时,4个基因的上调表达程度与单独接种Tb CSV相比较低。其中,HSRP在接种Tb CSV后,上调表达接近5倍左右,而HSRP在接种Tb CSV+TbCSB后上调表达3倍以上。结果表明TbCSBβC1可通过与辅助病毒Tb CSV编码蛋白及寄主因子互作从而增强病毒症状和积累量。为明确TbCSB编码的βC1对RNA沉默途径相关基因(AGOs,DCLs,RDRs)表达量的影响,我们利用RT-q PCR检测AGOs,DCLs,RDRs相关基因的表达情况。当Tb CSV单独侵染和Tb CSV与TbCSB共侵染(Tb CSV+TbCSB)本氏烟后,AGOs,DCLs,RDRs基因表达量均增加。当Tb CSV与TbCSB(Tb

关键词：烟草曲茎病毒 β卫星 βC1蛋白酵母双杂交内源基因表达

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