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内毒素结合肽及其突变体的表达纯化和抗内毒素／脂多糖活性研究

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中华烧伤杂志 2006年第4期22卷 291-295页

作者：孙亚丽刘友生杨海捷王长松马建洲第三军医大学西南医院病理学研究所重庆400038 解放军第三二三医院眼科

目的使内毒素结合肽(EBP)及其突变体mEBP在*** DH5α中表达,纯化后鉴定其抗内毒素／脂多糖(LPS)活性。方法(1)将含PinpointXa3-EBP及其突变体PinpointXa3-mEBP的工程菌DH5α活化,加入异丙硫半乳糖苷(IPTG)诱导其表达生物素融合蛋白。分... 详细信息

目的使内毒素结合肽(EBP)及其突变体mEBP在*** DH5α中表达,纯化后鉴定其抗内毒素／脂多糖(LPS)活性。方法(1)将含PinpointXa3-EBP及其突变体PinpointXa3-mEBP的工程菌DH5α活化,加入异丙硫半乳糖苷(IPTG)诱导其表达生物素融合蛋白。分离纯化表达产物,因子Xa酶切融合蛋白分离目的肽EBP和mEBP。采用亲和层析及反相高效液相色谱法纯化目的肽,用氨基末端10个氨基酸残基序列分析法鉴定突变体mEBP。(2)分离正常人外周血单核细胞(PBMC),用5 mg／L异硫氰酸荧光素(FITC)-LPS+不同浓度EBP或mEBP(均为2．0、5．0、12．5 mg／L)刺激PBMC,检测其平均荧光强度。用1 mg／L LPS+3种浓度(同前)EBP或mEBP刺激PBMC,5 h后取上清液,检测肿瘤坏死因子(TNF)α和白细胞介素(IL)6浓度。(3)将25只昆明小鼠分为正常对照组(5只):腹腔注射等渗盐水0．2 ml;模型组(5只):小鼠造成20％TBSAⅢ度烧伤,伤后腹腔注射LPS(1 mg／kg);治疗组(15只):小鼠同前致伤后,腹腔注射多黏菌素B(PMB,5 mg／kg)或EBP或mEBP(后两者均为10 mg／kg)。6 h后检测各组小鼠血清TNF-α、IL-6浓度及肝组织中TNF-αmRNA的表达水平。结果(1)纯化后的目的肽EBP、mEBP纯度均达98％以上,mEBP氨基末端10个氨基酸残基序列分析符合预期结果。(2)随着mEBP或EBP浓度的增加,PBMC表面的平均荧光强度逐渐减弱;且在同一浓度下,加入mEBP后平均荧光强度的减弱程度较加入EBP明显。与用1 mg／L LPS刺激PBMC比较,加入1 mg／L LPS+12．5 mg／L EBP以及1 mg／L LPS+3种浓度mEBP刺激后, PBMC培养上清液中IL-6及TNF-α的水平均明显降低(P肽可通过原核表达获得;EBP及mEBP均具有抗LPS活性,其中mEBP拮抗作用更强。

关键词：基因表达内毒素类内毒素结合肽突变体纯化

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内毒素结合肽的改良、原核表达及纯化

中国生物工程杂志 2006年第3期26卷 42-46页

作者：孙亚丽刘友生杨海捷第三军医大学西南医院病理研究所重庆400038

目的:对人内毒素结合肽(endotoxinbindingpeptide,EBP)进行改良,获得突变体mEBP(mutateofendotoxinbindingpeptide,mEBP)基因并进行原核表达,纯化获得高纯度的mEBP。方法:应用PCR定点诱变方法获得mEBP基因,构建PinpointXa3/mEBP融合表达载体,在BL21(DE3)pLysS宿主菌进行表达,溶菌酶裂解法提取包涵体,融合蛋白经PinpointTMXa纯化后,由factorXa酶切,获得目的肽,RPHPLC纯化获得高纯度的mEBP。结果:应用PCR定点诱变技术完成了EBP第5,18位谷氨酰胺→赖氨酸的定点突变,且通过原核表达,色谱纯化获得了高纯度的mEBP。结论:成功获得高纯度的mEBP,为下一步的抗内毒素功能检测奠定基础。

关键词：内毒素结合肽突变表达纯化

内毒素结合肽在烧伤合并内毒素血症大鼠模型中的作用

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第三军医大学学报 2004年第5期26卷 373-377页

作者：麻莉刘友生王晓东章容李永旺第三军医大学西南医院病理科重庆400038 第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所全军呼吸病研究重点实验室重庆400037

目的　观察重组人内毒素结合肽蛋白在烧伤合并内毒素血症大鼠中的作用。方法　采用烧伤合并内毒素血症大鼠模型 ,分为模型组 (n =3 6)、治疗组 (n =3 6)及对照组 (n =6)。模型组在烧伤后立即腹腔内注射 1mg/kg内毒素(用 1ml生理盐水配制... 详细信息

目的　观察重组人内毒素结合肽蛋白在烧伤合并内毒素血症大鼠中的作用。方法　采用烧伤合并内毒素血症大鼠模型 ,分为模型组 (n =3 6)、治疗组 (n =3 6)及对照组 (n =6)。模型组在烧伤后立即腹腔内注射 1mg/kg内毒素(用 1ml生理盐水配制 ) ;治疗组腹腔内注射 1mg/kg内毒素 (用 0 5ml生理盐水配制 )后 ,再注入 40 0 μg/kg制备好的内毒素结合肽 (用 0 5ml生理盐水配制 ) ;模型组和治疗组分别在处理后 1、3、6、12、2 4、48h取血和肝、肺组织 ,对照组仅在脱毛后腹腔内注入 1ml生理盐水 ,取血和肝、肺组织作总体对照。采用生化速率法、ELISA法及组织学切片染色和电镜制样等方法 ,测定血清中丙氨酸转氨酶 (ALT)、肿瘤坏死因子 α(TNF α)、白介素 6(IL 6)的含量变化以及光、电镜观察肝、肺组织的病理学变化。结果　模型组于伤后 1h血清TNFα显著高于对照组 (P <0 0 1) ,6h达峰值 ;治疗组与模型组比较各时相点血清TNFα含量均显著降低 (P <0 0 1,P <0 0 5 )。血清IL 6含量测定结果 ,模型组于伤后 1h血清IL 6显著高于对照组(P <0 0 1) ,12h达峰值。治疗组 3～ 48h各时相点血清IL 6含量均显著低于模型组 (P <0 0 1,P <0 0 5 )。大鼠血清中谷丙转氨酶的动态变化提示。

关键词：内毒素结合肽脂多糖内毒素血症

内毒素结合肽表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

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解放军医学杂志 2003年第4期28卷 302-304页

作者：麻莉刘友生王晓东葛晓冬李永旺第三军医大学西南医院第三军医大学新桥医院

应用PCR技术 ,从含人NH·LBPcDNA的质粒中扩增出 93bp的内毒素结合肽 (endotoxinbindingpeptide,EBP)基因片段 ,插入原核融合蛋白表达质粒PinpointXa3的多克隆位点构建成表达质粒 ,转化大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组子PinpointXa3 EB... 详细信息

应用PCR技术 ,从含人NH·LBPcDNA的质粒中扩增出 93bp的内毒素结合肽 (endotoxinbindingpeptide,EBP)基因片段 ,插入原核融合蛋白表达质粒PinpointXa3的多克隆位点构建成表达质粒 ,转化大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组子PinpointXa3 EBP并进行酶切鉴定及序列分析。异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导重组融合蛋白的表达 ,经SDS PAGE及Westenblot鉴定得到分子量约为 16 .5kD的生物素化EBP融合蛋白 ,为进一步研究其内毒素拮抗效应打下良好基础。

关键词：内毒素结合肽表达质粒构建大肠杆菌融合蛋白

一种合成的新型内毒素结合肽突变体的体内外拮抗内毒素效应初步研究

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免疫学杂志 2012年第3期28卷 241-246页

作者：徐小明段光杰朱江许建华刘友生第三军医大学西南医院病理学研究所重庆400038

目的设计构建新型内毒素结合肽突变体(mutant of endotoxin binding peptide,mEBP),并研究其体内外拮抗内毒素效应。方法采用F-moc固相合成法获得内毒素结合肽(endotoxin binding peptide,EBP)及其突变体mEBP;CCK-8法检测mEBP对RAW264.7细胞增殖的影响;ELISA法检测mEBP对内毒素(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6的影响;Western blot法检测mEBP对LPS诱导的RAW264.7细胞表达p-p38 MAPK的影响;中性红法测定mEBP对LPS诱导的RAW264.7细胞吞饮功能的影响。复制烧伤合并内毒素血症小鼠模型;检测mEBP对建模后6 h小鼠血浆中TNF-α、ALT和AST浓度的影响;检测mEBP对模型小鼠48 h生存率的影响。结果 mEBP无可见的细胞毒性;mEBP可降低LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6(P内毒素血症模型小鼠血浆中的TNF-α、ALT和AST浓度(P内毒素活性,其中mEBP拮抗活性更强。

关键词：内毒素内毒素结合肽内毒素结合肽突变体生物活性

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内毒素结合肽模拟肽P11的体外活性研究

医学分子生物学杂志 2010年第4期7卷 309-315页

作者：杨海捷段光杰朱江陈锐刘友生第三军医大学西南医院病理学研究所重庆市400038 成都军区昆明总医院昆明市650032

目的对从噬菌体展示随机肽库筛选获得的内毒素结合肽模拟肽进行体外拈抗内毒素活性鉴定。方法采用FMOC固相合成法化学合成内毒素结合肽模拟肽P11，并进行拮抗内毒素活性和细胞毒性测定。结果亲和ELISA检测显示P11与LPS有较高的亲和力，... 详细信息

目的对从噬菌体展示随机肽库筛选获得的内毒素结合肽模拟肽进行体外拈抗内毒素活性鉴定。方法采用FMOC固相合成法化学合成内毒素结合肽模拟肽P11，并进行拮抗内毒素活性和细胞毒性测定。结果亲和ELISA检测显示P11与LPS有较高的亲和力，通过生长曲线和流式细胞学分析细胞周期显示P11对人U937细胞生长无明显影响。流式细胞检测显示P11呈剂量依赖性抑制FITC—LPS与人外周血单核细胞（PBMC）结合。细胞因子生成抑制实验显示10μg/mlP11可显著抑制LPS诱导PBMC和U937细胞TNF—αmRNA转录和蛋白表达。结论体外活性鉴定结果表明化学合成的模拟肽P11可抑制LPS诱导的炎性反应。

关键词：脓毒血症内毒素结合肽模拟肽生物活性

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新型重组人内毒素结合肽突变体的设计与构建

新型重组人内毒素结合肽突变体的设计与构建

作者：许成燕第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景和目的脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein, LBP)是一种介导LPS与其受体(CD14等)相结合的关键载体蛋白分子。其羧基末端将LPS递呈至受体CD14,并以LPS-LBP-CD14复合体形式启动TLR4-MD2-MyD88活化及跨膜信号转导... 详细信息

研究背景和目的脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein, LBP)是一种介导LPS与其受体(CD14等)相结合的关键载体蛋白分子。其羧基末端将LPS递呈至受体CD14,并以LPS-LBP-CD14复合体形式启动TLR4-MD2-MyD88活化及跨膜信号转导,从而激活下游信号转导通路。多项研究表明:LBP、BPI和LALF等天然蛋白的衍生肽均具有中和内毒素能力,且可以通过阻断LBP-LPS的结合来抑制LPS诱发的体内外炎症反应。同时,它们具有一共同特点,即与LPS结合区域均富含正电荷及疏水性氨基酸残基。LPS分子结构中含有带负电荷的磷酸基团及疏水性长链脂肪酸,容易结合带正电荷及疏水性分子。因此,我们可以通过氨基酸替换来增加阳性电荷数和疏水性,从而增加这类小分子肽的拮抗内毒素活性。然而由于不同的氨基酸残基所带电荷及疏水性均不同,任意一个残基的替换都可能会使肽的电荷、疏水性乃至空间结构发生改变,所以,我们需了解此肽段中哪些氨基酸是与LPS结合的关键位点,并选择除这些关键氨基酸之外的位点进行突变,即把非关键氨基酸替换成疏水性、碱性氨基酸或重要结合位点氨基酸。LBP的NH2-末端部分(NH2-LBP)是LPS的结合部位,尤其是富含疏水性、碱性氨基酸的第108到133位氨基酸,与带有负电荷的磷酸基团及疏水性长链脂肪酸的内毒素分子有着高效亲和力。因此,本研究针对内毒素分子结构特征,在本课题组以往研究中已证实LBP108-133肽段,即内毒素结合肽(endotoxin binding peptide, EBP)具有一定中和内毒素活性能力的基础之上,为进一步提高其生物活性,我们对EBP基因片段进行改建,在构建表达载体的同时,选择可能影响其生物活性的氨基酸所对应的碱基进行突变,以期增强其抗内毒素活性,通过分子克隆、定点突变和表达纯化获得重组人内毒素结合肽突变体,为研究该肽段的功能奠定了基础。主要技术方法以本实验室已有的pET-30-LBP重组质粒为模板,采用PCR法,扩增EBP25基因,构建pET-30-EBP25融合表达载体并转化*** DH5α扩增。重组质粒经酶切和测序鉴定后,应用快速定点突变法将EBP25第2位缬氨酸、第5位谷氨酰胺、第15位苯丙氨酸、第18位天冬酰胺和第22位天冬氨酸所对应的碱基依次替换成赖氨酸、赖氨酸、色氨酸、赖氨酸、丙氨酸所对应的碱基,突变后重组质粒再经测序鉴定后,将表达量较高者转化至*** BL21(DE3) PlysS后经IPTG诱导表达,表达产物采用Western印迹进行鉴定后,用His-Tag亲和层析对融合蛋白进行纯化。结果 1.重组质粒pET-30-EBP25的构建:采用PCR技术,以pET-30-NH-LBP为模板,扩增得到产物大小约为96 bp的EBP25基因,将其克隆入原核表达载体pET30a(+),经酶切及测序鉴定,成功构建重组质粒。 2.重组质粒突变体pET-30-mEBP25的获得:采用快速定点突变法,以pET-30- EBP25为模板,依次将EBP25第2位缬氨酸、第5位谷氨酰胺、第15位苯丙氨酸、第18位天冬酰胺、第22位天冬氨酸所对应碱基分别替换为赖氨酸、赖氨酸、色氨酸、赖氨酸、丙氨酸所对应的碱基。 3.融合蛋白的表达及鉴定:构建好的五种重组质粒分别转化表达菌*** BL21(DE3) plysS,其中,EBP25及m1EBP25以包涵体形式获得高表达量,而其他三种突变体融合蛋白表达量低,甚至不表达。SDS-PAGE电泳结果表明,EBP25及m1EBP25重组阳性菌诱导后表达出约8 kD大小的新生融合蛋白带,与预期融合蛋白分子量相符。Western blot鉴定结果显示该蛋白与小鼠anti-His单克隆抗体有特异性结合能力。 4.融合蛋白的纯化及纯度鉴定:分离溶解包涵体,用Invitrogen公司的Ni-NTA agarose进行6×His标签融合蛋白的亲和层析纯化、透析复性,获得人EBP25和m1EBP25融合蛋白,经质谱检测m1EBP25融合蛋白的纯度为96.8%。结论本研究通过基因克隆等方法,构建pET-30-EBP25和突变后pET-30-m1-5EBP25融合表达载体,筛选出突变后表达量较高的重组菌,纯化出EBP25和mEBP25融合蛋白,为进一步研究其中和内毒素/脂多糖活性奠定了基础。

关键词：内毒素结合肽原核表达 LPS 定点突变蛋白纯化

新型重组人内毒素结合肽突变体的构建及原核表达纯化

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医学分子生物学杂志 2010年第2期7卷 131-135页

作者：许成燕刘友生段光杰朱江徐小明第三军医大学西南医院病理学研究所重庆市400038

目的构建新型人内毒素结合肽（a new endotoxin binding peptide consisting of 25 amino acid residues，EBP25）及其突变体（mutant of EBP25，mEBP25）的原核表达重组质粒，并在大肠埃希菌中诱导表达。方法采用PCR法，扩增EBP25基因... 详细信息

目的构建新型人内毒素结合肽（a new endotoxin binding peptide consisting of 25 amino acid residues，EBP25）及其突变体（mutant of EBP25，mEBP25）的原核表达重组质粒，并在大肠埃希菌中诱导表达。方法采用PCR法，扩增EBP25基因，构建pET-30-EBP25.融合表达载体并转化Ecoli DH5α扩增。重组质粒经酶切和测序鉴定后，应用快速定点突变法将EBP25第2位缬氨酸和第5位谷氨酰胺所对应碱基均替换成赖氨酸所对应的碱基，突变后重组质粒再经测序鉴定后，将二者转化至*** BL21（DE3）PlysS后经IPTG诱导表达，表达产物采用Western印迹进行鉴定后，用His—Tag亲和层析对融合蛋白进行纯化。结果两次测序结果显示人EBP25，和mEBP25重组序列和理论设计序列完全一致后，经IPTG诱导表达获得目的融合蛋白，通过SDS—PAGE电泳、Western印迹证实蛋白表达的特异性，并对蛋白进行纯化，获得EBP25和mEBP25融合蛋白。结论构建、表达纯化了EBP25和mEBP25融合蛋白，为进一步研究其中和内毒素／月旨多糖活性奠定了基础。

关键词：内毒素结合肽定点突变原核表达纯化

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人内毒素结合肽基因的突变及突变体蛋白表达

中国生物制品学杂志 2006年第1期19卷 21-23,27页

作者：孙亚丽刘友生王长松第三军医大学西南医院病理研究所重庆400038

目的分析亲代人内毒素结合肽一级结构,选择可能影响其生物学活性的氨基酸对应碱基位点进行突变,克隆基因突变体mEBP基因并研究其蛋白表达。方法以亲代EBP基因为基础,结合DNASIS软件理化性质分析确定突变碱基,应用PCR定点诱变技术进行第5... 详细信息

目的分析亲代人内毒素结合肽一级结构,选择可能影响其生物学活性的氨基酸对应碱基位点进行突变,克隆基因突变体mEBP基因并研究其蛋白表达。方法以亲代EBP基因为基础,结合DNASIS软件理化性质分析确定突变碱基,应用PCR定点诱变技术进行第5、18位谷氨酰胺→赖氨酸的定点突变。并将其克隆至原核融合表达载体pinpointXa-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行表达,经Western blot鉴定。结果突变EBP基因13及52位核苷酸由C突变为A,构建的阳性重组子经酶切及测序鉴定证实与设计序列完全一致,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达生物素化的融合蛋白,Western blot鉴定显示能与抗生物素单克隆抗体结合。结论已成功获得EBP基因突变体,并在大肠杆菌以融合蛋白的形式进行表达。

关键词：内毒素结合肽突变蛋白表达