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作者：周逸飞四川大学

学位级别：硕士

内吞体(endosome)是一种重要的细胞器,膜蛋白及其结合蛋白与磷脂通过内吞作用进入细胞后,内吞体可对其进行进一步分选,将其分选至质膜(Plasma membrane,PM)、反式高尔基体(Trans-Golgi network,TGN)发挥功能,或者运往溶酶体中进行降解,... 详细信息

内吞体(endosome)是一种重要的细胞器,膜蛋白及其结合蛋白与磷脂通过内吞作用进入细胞后,内吞体可对其进行进一步分选,将其分选至质膜(Plasma membrane,PM)、反式高尔基体(Trans-Golgi network,TGN)发挥功能,或者运往溶酶体中进行降解,这个过程叫做内吞体分选(endosome sorting)。在这个途径中,靶向运输至TGN或PM进行循环的过程叫做内吞循环(endosome recycling)。内吞循环对维持细胞内稳态有重要作用,也有证据表明,内吞循环在早期神经发育中发挥着重要功能。分选连接蛋白家族(Sorting Nexins,SNXs)是一类与内吞体分选相关的蛋白,其含有高度保守的PX结构域(phox-homology domain,PX domain),可与磷脂酰肌醇-3-磷酸(Ptd Ins-3P,PI3P)结合。SNXs在细胞信号转导过程中发挥着重要的功能,与多种疾病密切相关,如唐氏综合征。已经有文献表明,SNX27下调会导致β-淀粉样蛋白的异常沉积,从而导致线粒体功能异常。SNX27是SNX-FERM亚家族的一员,该亚家族有SNX17、SNX27和SNX31,都拥有FERM(Protein 4.1/ezrin/radixin/moesin)结构域。其中SNX27除了PX结构域和FERM结构域以外,还有一个PDZ结构域。SNX27可以通过PDZ结构域结合VPS26,并且能够识别含有PDZ结合基序(PDZbinding-motifs,PDZbm)的货物,包括葡萄糖转运体1(GLUT1)、腺素受体、生长激素抑制素受体等等。在本课题组前期的研究中,发现SNX27在饥饿刺激的条件下,S51位会发生磷酸化,从而影响其蛋白质转运功能。而SNX27的FERM结构域与另外两个含有FERM结构域的SNX17和SNX31的功能有所不同,后两者的FERM结构域都能够介导含有NPx Y(天冬酰胺-脯氨酸-X-酪氨酸)/Nxx Y(天冬酰胺-X-X-酪氨酸)基序的货物蛋白的内吞运输。有文献表明,SNX27的FERM结构域可以与SNX1相互作用,从而调节SNX27蛋白质转运功能。本课题组已经验证了FERM结构域与SNX1结合的关键位点。但以上研究只有生化及细胞层面的结果,在神经发育中的意义尚未可知,为了探索其生理意义,我们选择了斑马鱼作为模式动物。首先我们通过显微注射技术,使用MO敲降SNX27的表达,并通过回补全长m RNA和突变体m RNA来探索其关键位点的功能。为了探索其在早期神经发育中的意义,我们分别使用了运动神经元和成熟神经元荧光标记的转基因斑马鱼,发现当SNX27被敲降后,出现运动神经元轴突变短以及中脑变小的表型,进行切片及免疫荧光共染后,发现GLUT1与细胞膜的共定位降低,以上三个表型可以被全长m RNA回补,PDZ结构域及FERM结构域的关键位点突变以后无法回补这一表型。综上所述,我们的研究证明了:1.SNX27的敲降会导致斑马鱼运动神经元轴突变短以及中脑变小的表型,与病人表型接近。2.SNX27 PDZ结构域S51位磷酸化动态调节货物的运输,并影响早期神经的发育。3.SNX27 FERM结构域与SNX1结合,调节SNX27的运输功能,并在早期神经发育中发挥作用。

关键词：神经疾病 SNXs 内吞分选斑马鱼

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肺癌中TSG101蛋白与Notch3受体表达的相关性

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中国肺癌杂志 2009年第2期12卷 111-116页

作者：常家辉陆平蔡存伟李菲钟志永张道荣中国医科大学基础医学院病理学教研室沈阳110001 齐齐哈尔医学院附属五院大庆市龙南医院病理科大庆163453 辽宁省肿瘤医院病理科沈阳110042

背景与目的TSG101蛋白是内吞分选通路的重要因子,该通路的异常会减少果蝇中Notch受体的降解,导致此受体信号对细胞分化、发育调节的紊乱。在哺乳动物中,Notch受体家族中的3亚型与肺组织发育及肺癌发生密切相关。本实验的目的是初步探讨... 详细信息

背景与目的TSG101蛋白是内吞分选通路的重要因子,该通路的异常会减少果蝇中Notch受体的降解,导致此受体信号对细胞分化、发育调节的紊乱。在哺乳动物中,Notch受体家族中的3亚型与肺组织发育及肺癌发生密切相关。本实验的目的是初步探讨在人类肺癌中,TSG101蛋白与Notch3受体之间的表达是否也存在关联。方法分别采用Western blot和免疫组化SP法检测TSG101蛋白与Notch3受体在肺癌组织、细胞系中的表达,并应用抗体封闭TSG101蛋白功能后观察Notch3受体的表达变化。结果TSG101蛋白在肺癌中比正常肺组织表达减少,而Notch3受体在肺癌中比正常肺组织表达则增多,此变化均与肺癌的分化及淋巴结转移相关。当用抗体封闭肺癌细胞系中TSG101蛋白功能时,Notch3受体检测水平呈上升变化。结论肺癌中TSG101蛋白表达下调,与Notch3受体检测水平上升有相关性。

关键词：肺肿瘤 TSG101蛋白 Notch3受体内吞分选

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肺癌中TSG101蛋白与Notch3受体表达的相关性

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作者：常家辉中国医科大学

学位级别：硕士

前言 TSG101（Tumor Susceptibility Gene101）蛋白近年被发现与多种肿瘤均有关,且常被检测出有异常剪切子存在,但其在肿瘤发生、发展中的作用尚未完全明确。可是此蛋白作为内吞分选通路的重要因子,可以影响多种蛋白的内吞降解。... 详细信息

前言 TSG101（Tumor Susceptibility Gene101）蛋白近年被发现与多种肿瘤均有关,且常被检测出有异常剪切子存在,但其在肿瘤发生、发展中的作用尚未完全明确。可是此蛋白作为内吞分选通路的重要因子,可以影响多种蛋白的内吞降解。一旦此通路异常,便会使内吞的囊泡受阻于运往溶酶体降解的途中,进而增加蛋白被异常激活或循环再利用的几率,造成细胞生长中的信号紊乱。而Notch受体信号家族成员是利用此通路调节信号平衡的典型代表,正常情况下内吞分选过程参与调节他们在不同时间、不同空间下的信号平衡,确保细胞分化、增殖的正常进行。有文献报道果蝇中TSG101蛋白同源物的异常阻碍了Notch受体的降解,进而信号表达增多,出现果蝇胚基的异常增殖。而在哺乳动物组织中Notch受体有4种亚型,在人类许多肿瘤中均发现有不同亚型的异常表达,且常是在信号数量上的变化。而在肺组织中Notch3亚型受体被证实是对肺组织分化、发育和损伤修复起突出作用的亚型。那么本研究旨在初步探讨肺癌中TSG101蛋白和Notch3受体的表达情况,及两者表达的可能相关性。材料与方法 1、材料收集65例肺癌组织（鳞癌38例,腺癌27例）,另外24例新鲜肺癌组织及26例新鲜癌旁正常肺组织取自中国医科大学附属第一临床医院。 6株肺癌细胞系（SK为肺鳞癌细胞系;BE1为肺巨细胞癌细胞系;460为肺大细胞癌细胞系;LTE和SPC为肺腺癌细胞系;446为肺小细胞癌细胞系）。 2、主要试剂和来源浓缩型鼠抗人T SG101蛋白单克隆抗体（sc-7964）,兔抗人Notch3受体多克隆抗体（sc-5593）均购自Santa Cruz公司。 3、方法（1）免疫组织化学技术蜡块标本切片后按照链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（SP法）检测TSG101蛋白（1:200）和Notch3受体（1:200）表达。孔板爬片细胞固定、打孔后,按照SP法检测Notch3受体（1:200）表达。以磷酸缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照。（2）Western blot技术总蛋白从生长到对数期收集的细胞及组织中提取。SDS-PAGE电泳,TSG101蛋白80 v恒压4℃湿转2 h,Notch3受体200 mA恒流4℃湿转500 min。TBS/0.3%Tween-20/5%小牛血清室温封闭2hrs,一抗（1:400）4℃孵育过夜,二抗37℃孵育2 h。Notch3受体内参β-actin在电泳后以切胶方式与Notch3受体所在部位分开转印。ECL显色,X线胶片曝光成像。（3）抗体封闭技术癌细胞状态良好时,传代3批次。无血清培养基1640饥饿8h后,分别不加抗体、加入与TSG101蛋白抗体同源的无关IgG作为对照,加入TSG101蛋白抗体,均孵育48 h。以Western Blot和免疫细胞化学方法检测抗体封闭TSG101蛋白功能后,Notch3受体表达情况。 4、统计学分析应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理,采用x 2检验分析各组计数资料,采用Spearman等级相关分析TSG101蛋白与Notch3受体表达的关系,采用t检验分析Western blot图像灰度值,细胞组化积分光密度值,P＜0.05为差异有统计学意义。结果 1、免疫组织化学结果 TSG101蛋白表达主要定位于细胞浆,少量定位于细胞核。在正常肺组织中染色强于肺鳞癌和肺腺癌。Notch3受体主要定位于细胞膜、细胞浆、细胞核。在正常肺组织染色弱于肺鳞癌和肺腺癌。两者表达水平均与肺癌组织分化（P＜0.05）、淋巴结转移（P＜0.05）明显相关。TSG101蛋白表达与Notch3受体表达呈负相关（P＜0.05）。用TSG101蛋白抗体封闭SPC细胞中TSG101蛋白功能后Notch3受体的免疫细胞化学结果显示胞浆中Notch3受体染色有增强。 2、Western Blot结果 TSG101蛋白在癌组织及细胞系中的表达明显低于正常肺组织及细胞系,Notch3受体在癌组织及细胞系中的表达则明显高于正常。用TSG101蛋白抗体封闭腺癌细胞系SPC中TSG101蛋白功能后Notch3受体检测水平较对照组有增高。结论肺癌中TSG101蛋白表达下调,与Notch3受体检测水平的上升有相关性。

关键词：肺肿瘤 TSG101蛋白 Notch3受体内吞分选

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