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单增李斯特菌内化素基因inlA多态性分析

中国人兽共患病学报 2023年第3期39卷 240-248页

作者：李玲玲纪顺师王艳毛盼陈晋妮刘凌云叶长芸中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206 贵州医科大学基础医学院病原生物学重点实验室贵阳550004

目的分析全球不同地区单增李斯特菌内化素A编码基因inlA的多态性,及其与菌株家系、血清群和序列型(sequence types,ST)之间的相关性。方法收集不同国家的4115株单增李斯特菌基因组信息,分析inlA基因的序列多态性,确定其等位基因型,构建... 详细信息

目的分析全球不同地区单增李斯特菌内化素A编码基因inlA的多态性,及其与菌株家系、血清群和序列型(sequence types,ST)之间的相关性。方法收集不同国家的4115株单增李斯特菌基因组信息,分析inlA基因的序列多态性,确定其等位基因型,构建基于inlA基因的系统进化树。结果4115株单增李斯特菌基因组中,除3株菌外均携带inlA基因,根据基因序列分为370个inlA等位基因型。编码完整InlA的等位基因型有292种(3164株菌),因点突变出现提前终止密码子(premature stop codon,PMSC)的截短型InlA等位基因型有78种(948株菌),其中84种新的编码完整InlA的等位基因型和16种PMSC类型为首次报道。系统发育分析显示,单增李斯特菌inlA基因与菌株家系、CC克隆群及ST型具有相关性。发生PMSC突变的inlA序列型也呈现多态性,尤其家系II菌株截短的InlA编码基因多样性更高。截短的InlA多见于血清群IIa和IIc菌株中,较少见于临床菌株常见的IVb血清群菌株中。结论inlA基因在单增李斯特菌中普遍存在且序列型呈现多态性,部分inlA的等位基因型与单增李斯特菌ST型具有较强的相关性,可作为特定型别菌株快速筛查的靶标。单增李斯特菌家系I和家系II菌株中截短的InlA编码基因的提前终止位点具有多样性,截短的InlA常见于IIa和IIc血清群菌株中。

关键词：单增李斯特菌内化素 inlA 等位基因型 PMSC

4b型单核细胞增生李斯特菌内化素基因NTSN_0462的功能初探

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中国人兽共患病学报 2017年第2期33卷 115-119,135页

作者：赵丹姚浩蔡雪薛孔苏伟恽茜谈卫军潘志明殷月兰焦新安扬州大学/江苏省人兽共患病重点实验室/江苏省动物重要疫病和人兽共患病防控协同创新中心/农业与农产品安全国际合作联合实验室扬州225009

目的单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对宿主的粘附、侵袭作用与其多种内化素蛋白密切相关。本研究以4b型菌株LmNTSN的內化素基因NTSN_0462为研究对象,初步探究其致病作用。方法利用同源重组技术构建该基因缺失的突变... 详细信息

目的单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对宿主的粘附、侵袭作用与其多种内化素蛋白密切相关。本研究以4b型菌株LmNTSN的內化素基因NTSN_0462为研究对象,初步探究其致病作用。方法利用同源重组技术构建该基因缺失的突变株,研究0462基因对NTSN在生长、细胞侵袭和体内定植中的作用。人结肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2的侵袭率,以及BALB/c小鼠体内肝、脾脏中定植能力的差异。结果缺失株的生长曲线结果显示,NTSN_0462基因对Lm在BHI培养基中的生长及代谢未造成明显影响。以人结肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2进行的体外试验表明,缺失株的侵袭能力低于野生株(P<0.001)。以BALB/c小鼠进行的体内试验显示,缺失株在肝脏中定殖的能力显著低于野生株(P<0.001),在脾脏中无统计学差异。结论 NTSN_0462基因在LmNTSN入侵肝脏和定植中发挥重要作用,是侵袭相关的重要毒力因子。

关键词：单核细胞增生李斯特菌 NTSN0462 血清型4b 内化素

无乳链球菌内化素(Internalin)基因克隆和原核表达优化

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基因组学与应用生物学 2021年第5期40卷 2155-2163页

作者：王得原陈泓霖陈晗雪李明汝欧阳媚罗彩妹彭银辉胥鹏蔡小辉北部湾大学海洋学院广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室钦州536011 广西大学生命科学与技术学院南宁530004

内化素(Internalin)作为细菌表面蛋白是细菌侵入上皮细胞、肝细胞等非吞噬细胞并被宿主细胞内化的重要因子。本研究克隆了无乳链球菌Internalin基因(GenBank登录号:MN265365),该基因全长2160 bp,编码719个氨基酸,理论分子量为80.38 kDa... 详细信息

内化素(Internalin)作为细菌表面蛋白是细菌侵入上皮细胞、肝细胞等非吞噬细胞并被宿主细胞内化的重要因子。本研究克隆了无乳链球菌Internalin基因(GenBank登录号:MN265365),该基因全长2160 bp,编码719个氨基酸,理论分子量为80.38 kDa,等电点为6.73,没有信号肽和跨膜结构域,定位在细胞膜上。序列分析发现,该蛋白存在1个组氨酸三聚体超家族、1个LRR超家族结构和1个未知功能的DUF超家族。系统进化树分析显示,鱼源无乳链球菌internalin与链球菌属关系最近,聚为一支。SDS-PAGE电泳结果显示,pET-internalin重组蛋白经IPTG诱导后成功表达,分子量约为100 kDa。对影响表达的诱导时间、IPTG浓度、诱导温度进行了优化,表明在28℃、0.4 mmol/L IPTG诱导6 h时,可大量表达pET-internalin可溶性蛋白。经纯化后重组蛋白条带单一,表明纯化效果较佳。该结果可为进一步制备无乳链球菌internalin多克隆抗体和功能研究奠定基础。

关键词：无乳链球菌内化素基因克隆原核表达

食源性单核增生性李斯特氏菌分布及其内化素基因分布研究

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食源性单核增生性李斯特氏菌分布及其内化素基因分布研究

作者：胡杨峰河北农业大学

学位级别：硕士

单核细胞增生性李斯特菌(***,以下简称单增李斯特菌)是一种人畜共患病的病原菌,自20世纪40年代,单增李斯特菌在病原学上作为一种人畜共患的致病菌已得到世界范围普遍的关注和公认。从公共卫生学角度,单增李斯特菌作为一种重要的食源性... 详细信息

单核细胞增生性李斯特菌(***,以下简称单增李斯特菌)是一种人畜共患病的病原菌,自20世纪40年代,单增李斯特菌在病原学上作为一种人畜共患的致病菌已得到世界范围普遍的关注和公认。从公共卫生学角度,单增李斯特菌作为一种重要的食源性传染病的致病菌,自20世纪90年代以来,更加倍受人们的关注,国内外许多专家学者针对单增李斯特菌的生物学特性、检测技术、致病基因及其毒力因子、流行病学进行了研究。本文对采自速冻食品、水产品、生肉、熟肉制品、水果、蔬菜、豆制品、奶及奶制品、腌制品等9类食品及动物粪便和人源粪便共1627份样品进行了单增李斯特菌的分离与鉴定,单增李斯特菌的总检出率为14.5%,表明单增李斯特菌的检出率偏高,在9类食品样品中,生肉中单增李斯特菌的检出率最高,高达27.4%,其次是水产品,检出率为24.7%,应引起高度重视,以免引起食源性疾病的暴发。目前,单增李斯特菌内化素基因分为9个型(inlA,inlB,inlC,inlC2D,inlD,inlE,inlF,inlG,inlH)。根据现有的报道资料,几乎所有致病性的单增李斯特菌都含有inlA和inlB,而inlC,inlC2D,inlD,inlE,inlF,inlG和inlH则在不同的菌株中有特定的分布。本研究按照本实验室设计合成的9种单增李斯特菌内化素基因引物,进行PCR鉴定,进而研究单增李斯特菌内化素基因的分布状况。对已分离获得的236株待鉴定菌株进行内化素基因定型,鉴定为Ⅰ型的菌株有2株,鉴定为Ⅱ型的有43株,鉴定为Ⅲ型的菌株较多,共87株;另有104株既未鉴定出inlA,inlB基因族,又无完整的(inlG,inlC2,inlD,inlE)基因族或(inlG,inlH,inlE)基因族。鉴于目前状况,有待于进一步调查我国人群、家畜及食品中单增李斯特菌的污染状况及该病原菌的流行情况,为单增李斯特菌病的监控、暴发流行的检测以及追踪污染源提供依据。

关键词：单增李斯特菌致病基因内化素 PCR

食源性单核增生性李斯特氏菌分布及其内化素基因亚型分类研究

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食源性单核增生性李斯特氏菌分布及其内化素基因亚型分类研究

作者：靳晓燕河北农业大学

学位级别：硕士

单核细胞增生性李斯特菌(***,以下简称单增李斯特菌)是一种人畜共患病的病原菌,自20世纪40年代,单增李斯特菌在病原学上作为一种人畜共患的致病菌已得到世界范围普遍的关注和公认。从公共卫生学角度,单增李斯特菌作为一种重要的食源性传染病的致病菌,自20世纪90年代以来,更加倍受人们的关注,国内外许多专家学者针对单增李斯特菌的生物学特性、检测技术、致病基因及其毒力因子、流行病学进行了研究。本文对采自速冻食品、海产品、生肉、熟肉制品、水果、蔬菜、豆制品、奶及奶制品、腌制品等9类食品568份样品进行了单增李斯特菌的分离与鉴定,单增李斯特菌的总检出率为19.0%,表明该地区单增李斯特菌的检出率偏高,在9类食品样品中,生肉中单增李斯特菌的检出率最高,高达34.5%,其次是海产品,检出率为30.7%,应引起高度重视,以免引起食源性疾病的暴发。目前,单增李斯特菌内化素基因分为9个型(inlA、inlB、inlC、inlC2D、inlD、inlE、inlF、inlG、inlH)。根据现有的报道资料,几乎所有致病性的单增李斯特菌都含有inlA和inlB,而inlC、inlC2D、inlD、inlE、inlF、inlG和inlH则在不同的菌株中有特定的分布。本研究按照本实验室设计合成的9种单增李斯特菌内化素基因引物,进行PCR鉴定,进而研究单增李斯特菌内化素基因的分布状况。在分离得到的108株单增李斯特菌中,携带两种及以上内化素基因的菌株有80株,占74.1%,含inlA基因的有74株,占68.5%,含inlB基因的有81株,占75.0%,同时含有inlA和#dB的有59株,占54.6%。鉴于目前状况,有待于进一步调查我国人群、家畜及食品中单增李斯特菌的污染状况及该病原菌的流行情况,为单增李斯特菌病的监控、暴发流行的检测以及追踪污染源提供依据。

关键词：单增李斯特菌致病基因内化素 PCR

交互学习内化素养——高中语文“互进式”学习策略研究

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高中生学习（作文素材与时评） 2019年第10期 43-45页

作者：湛海强广东省广州市增城区新塘中学

《普通高中课程方案和语文等学科课程标准》(2017年版)提出的"核心素养"明确了"知识能力须形成素养,须由素养来实现价值"的语文教学目标。如何着力发展核心素养,使学生成为"具有科学文化素养和终身学习能力、具有自主发展能力和沟通合... 详细信息

《普通高中课程方案和语文等学科课程标准》(2017年版)提出的"核心素养"明确了"知识能力须形成素养,须由素养来实现价值"的语文教学目标。如何着力发展核心素养,使学生成为"具有科学文化素养和终身学习能力、具有自主发展能力和沟通合作能力"的时代新人,是高中教育的出发点和归宿。传统课堂学习中,学生被动接受知识,难以产生认知冲突,学习积极性难以调动,课堂成效低,这种学习方式跟核心素养的培养背道而驰。因此,"高中语文课堂学习如何才能有效促进学生核心素养的内化"成为必须研究和解决的问题。

关键词：高中语文核心素养多维度学习者共同体交互学习内化素策略研究

inlA和inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌侵袭HT29结肠癌细胞的影响

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食品科学 2016年第23期37卷 166-172页

作者：刘武康陈国薇吴嫚丁承超谢曼曼刘箐上海理工大学医疗器械与食品学院上海200093

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是人畜共患的食源性致病菌,其可以穿透多个宿主屏障,而内化素蛋白家族被认为是LM穿透宿主屏障过程中起重要作用的毒力因子。本研究利用同源重组的方法构建了LM野生菌株EGDe的inl A和i... 详细信息

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是人畜共患的食源性致病菌,其可以穿透多个宿主屏障,而内化素蛋白家族被认为是LM穿透宿主屏障过程中起重要作用的毒力因子。本研究利用同源重组的方法构建了LM野生菌株EGDe的inl A和inl B基因双缺失菌株,利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测其主要毒力基因表达的变化,并以HT29结肠癌细胞为对象,研究inl A和inl B基因缺失对LM侵袭宿主细胞能力的影响。结果表明基因的缺失对其生长能力没有影响,但多个毒力基因的表达发生了不同程度的变化,同时发现inl A和inl B基因的缺失使LM侵袭HT29结肠癌细胞的能力显著下降(P内化素Inl A和Inl B在LM入侵宿主细胞过程中的具体作用提供了支持。

关键词：单核细胞增生性李斯特菌内化素基因敲除 Realtime-PCR 侵袭细胞

单核细胞增生李斯特菌NTSNΔ0287缺失株的构建及其生物学特性

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中国家禽 2016年第21期38卷 22-28页

作者：姚浩叶舒扬王玉婷孔苏伟蔡雪薛孙昕宇殷月兰焦新安扬州大学江苏省人兽共患病重点实验室江苏省动物重要疫病和人兽共患病防控协同创新中心农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

内化素蛋白家族是一类重要的表面蛋白,其与单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对宿主的黏附侵袭作用密切相关。Lm NTSN_0287基因编码含有信号肽序列和LRR重复结构域的内化素家族蛋白,其作用机制有待于阐明。通过荧光定量... 详细信息

内化素蛋白家族是一类重要的表面蛋白,其与单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对宿主的黏附侵袭作用密切相关。Lm NTSN_0287基因编码含有信号肽序列和LRR重复结构域的内化素家族蛋白,其作用机制有待于阐明。通过荧光定量PCR的方法,发现该基因在Lm侵袭Caco-2细胞时上调表达,达到体外表达量的1 300倍。为明确该基因的生物学特性,研究利用同源重组技术构建了LmNTSNΔ0287缺失株。与野生株相比,NTSNΔ0287缺失株对Caco-2细胞的黏附与侵袭能力均显著降低,对HeLa细胞的黏附能力下降,侵袭能力增加。经口服和尾静脉途径接种BALB/c小鼠,NTSNΔ0287缺失株在脾脏和肝脏中的载菌量均降低,但其LD_(50)与野生株相比无明显差异。因BALB/c小鼠缺乏人所特有的细胞表面内化素受体E-cad,并不是最佳实验动物模型,下一步将选用同时具有内化素受体E-cad和Met的沙鼠做进一步研究。

关键词：单核细胞增生李斯特菌 NTSN_0287 内化素同源重组

单增李斯特菌inlAB天然缺失株的生物学特性及其主要毒力基因结构特征

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单增李斯特菌inlAB天然缺失株的生物学特性及其主要毒力基因结构...

作者：陈巧妙南京农业大学

学位级别：硕士

单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌）是引起人类李斯特菌病（listeriosis）的重要食源性病原菌。目前单增李斯特菌已经受到世界各国卫生部门和食品安全部门的高度重视,被世界卫生组织列为四大食源性致... 详细信息

单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌）是引起人类李斯特菌病（listeriosis）的重要食源性病原菌。目前单增李斯特菌已经受到世界各国卫生部门和食品安全部门的高度重视,被世界卫生组织列为四大食源性致病菌之一。本试验分析了115株不同来源的单增李斯特菌,从中发现了一株天然缺失inlAB基因簇的非典型单增李斯特菌S10,随后对该菌株展开了以下三方面的研究：（1）S10的生物学特性分析及毒力基因的构成：对该菌株及其他7株不同血清型的菌株进行了生化分析、谱系及血清型分析、粘附力试验、小鼠毒力试验、感染相关基因分析和多位点序列分型。结果显示菌株S10为具有典型生化特征的1/2b型单增李斯特菌,其粘附力显著低于其他菌株,却对小鼠具有一定的毒力。S10具有除inlAB外较完整的感染相关基因构成,位于谱系Ⅰ进化支的1/2b型与4b型分支间。（2）S10的inlAB邻近区域生物信息学分析：结果显示,与其他血清型菌株inlAB邻近区域结构相比,在inlAB两翼具有独特的基因结构。S10缺失lmo0431、lmo0432、 Imo0435、lmo0436、lmo0437,仅扩增得到Imo0430,该基因与1/2a型菌株EGD、4b型菌株F2-365与4a型菌株HCC23的同源性分别为99.6%、94.0%与77.4%。（3）实时荧光定量PCR方法分析菌株S10的主要毒力基因表达水平的变化：利用实时荧光定量PCR技术检测了S10中内化素基因（inlA,inlB, inlC, inlC2, inlD,inlE, inlJ）（?）（?）录水平的差异。结果显示,S10在天然缺失inlAB的前提下,inlC2, inlD, inlE的转录水平均极显著高于参考菌株（p＜0.01）,而inlC, inlJ差异不显著（p＞0.05）提示在inlAB缺失条件下,S10可能通过上调其他内化素基因的转录水平,从而有效的代偿其致病能力,进一步丰富了内化素家族对细菌感染作用的认识。综上所述,本试验研究了天然缺失inlAB的非典型单增李斯特菌S10的生物学特性、毒力基因结构及内化素基因转录水平差异,为进一步深入研究细菌的内化机制与致病基因组（Pathogenomics）进化趋势奠定了基础。

关键词：单增李斯特菌内化素生物学特性毒力基因结构转录水平