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关岭牛MEF2C基因克隆与差异表达性分析

中国兽医学报 2023年第4期43卷 794-803页

作者：孙金魁许厚强黄勇李永熊讯贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵州贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025 贵州大学生命科学学院贵州贵阳550025

旨在分析牛肌细胞增强因子MEF2C(myocyte enhancer factor 2C)基因的分子特征和在不同组织中的表达特性。以关岭牛为试验材料,扩增MEF2C基因CDS区,对MEF2C基因序列和蛋白结构进行分析,RT-qPCR检测MEF2C在不同组织中的表达特性。结果显示... 详细信息

旨在分析牛肌细胞增强因子MEF2C(myocyte enhancer factor 2C)基因的分子特征和在不同组织中的表达特性。以关岭牛为试验材料,扩增MEF2C基因CDS区,对MEF2C基因序列和蛋白结构进行分析,RT-qPCR检测MEF2C在不同组织中的表达特性。结果显示:牛MEF2C基因的CDS区全长为1326bp,编码441个氨基酸。MEF2C蛋白相对分子质量约为48kDa,理论等电点为7.71,主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,含有1个MADS结构域,亚细胞定位显示MEF2C主要位于细胞核(60.90%)。牛MEF2C基因与牦牛同源性较近,与火鸡的同源性较远。RT-qPCR结果表明,MEF2C基因在关岭牛和杂交牛的7个组织中皆可表达,在肺脏和脾脏中差异极显著(P牛的脾脏和心脏中表达量极显著高于犊牛(P牛阶段的表达量极显著高于成年牛阶段(P关岭牛生长发育过程中发挥着重要的作用,为进一步探究MEF2C基因对关岭牛组织器官发育的影响,挖掘地方种质资源提供了数据支撑。

关键词：关岭牛 MEF2C基因基因表达

关岭牛MEF2A基因过表达载体构建及其对成肌细胞的影响

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农业生物技术学报 2023年第11期31卷 2294-2303页

作者：孙金魁许厚强阮涌石鹏飞熊讯贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室

肌细胞增强因子2A (myocyte enhancer factor 2A, MEF2A)是肌细胞增强因子家族中的重要成员之一，在肌肉发生和再生过程中具有重要作用。本研究以关岭牛(Bos taurus)为实验材料，扩增MEF2A基因CDS区并构建过表达载体pEGFP-C1-MEF2A，分... 详细信息

肌细胞增强因子2A (myocyte enhancer factor 2A, MEF2A)是肌细胞增强因子家族中的重要成员之一，在肌肉发生和再生过程中具有重要作用。本研究以关岭牛(Bos taurus)为实验材料，扩增MEF2A基因CDS区并构建过表达载体pEGFP-C1-MEF2A，分析MEF2A基因序列和蛋白结构，q RT-PCR检测MEF2A在不同阶段关岭牛多组织中的表达特性。同时将过表达载体转染至关岭牛成肌细胞，利用流式细胞仪与细胞生长分析仪探究过表达载体对成肌细胞增殖生长的影响。结果表明，MEF2A基因在3日龄牛与30月龄关岭牛的多组织中均可表达，表达量差异皆达到极显著水平(P关岭牛成肌细胞后，可有效上调MEF2A基因表达，改变基因表达模式。本研究成功构建pEGFP-C1-MEF2A过表达载体，检测MEF2A基因对关岭牛肉质相关基因的表达影响，为进一步探究MEF2A基因对关岭牛肉质性状调控机制提供基础数据。

关键词：关岭牛肌细胞增强因子2A(MEF2A) 过表达载体细胞增殖

关岭牛MSTN基因3'-UTR与bta-miR-27b的靶向验证

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南方农业学报 2023年第4期54卷 1235-1243页

作者：卢贤君许厚强许家利阮涌贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵州贵阳550025

【目的】明确关岭牛bta-miR-27b与肌肉生长抑制素基因(MSTN)的结合位点及靶向调控关系,为通过调控miRNA改良关岭牛产肉量提供理论依据,也为贵州地方黄牛分子遗传改良工作提供新的切入点。【方法】通过TargetScan预测牛MSTN基因3'端非翻... 详细信息

【目的】明确关岭牛bta-miR-27b与肌肉生长抑制素基因(MSTN)的结合位点及靶向调控关系,为通过调控miRNA改良关岭牛产肉量提供理论依据,也为贵州地方黄牛分子遗传改良工作提供新的切入点。【方法】通过TargetScan预测牛MSTN基因3'端非翻译区(3'-UTR)的潜在miRNA结合区域及互作miRNA,对比关岭牛与不同关岭牛杂交品种的生理表型及MSTN基因和3'-UTR端miRNA表达差异,并分析bta-miR-27b在不同关岭牛杂交群体中的靶位点特异性。将MSTN基因3'-UTR序列野生型(WT)和3'-UTR序列突变型(MUT)分别克隆至pMIR-REPORT Luciferase(H306)载体构建重组双荧光素酶报告基因载体,与bta-miR-27b共转染293T细胞以验证bta-miR-27b与MSTN基因的作用关系,并利用实时荧光定量PCR验证bta-miR-27b对MSTN基因表达的影响。【结果】在牛MSTN基因3'-UTR端发现7个miRNA结合位点;关岭牛各系杂交品种的3个miRNA(bta-miR-27a-3p、bta-miR-27b和bta-miR-128)相对表达量均极显著高于关岭牛(P关岭牛,体质量、体高、体斜长、胸围等生长指标却明显优于关岭牛。关岭牛及其杂交牛MSTN基因3'-UTR端的bta-miR-27b结合区域均无突变、无缺失;MSTN-3'-UTR(WT)与bta-miR-27bmimics共转染293T细胞后其相对荧光值下降53.80%,极显著低于MSTN-3'-UTR(MUT)+bta-miR-27bmimics共转染;转染bta-miR-27b mimics后,bta-miR-27b在关岭牛原代成肌细胞株(N2)中成功超表达,而MSTN基因相对表达量呈极显著下调趋势,表明bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。【结论】bta-miR-27b与MSTN基因的结合区域位于3'-UTR端第62~69位碱基处,且靶位点保守性较高。bta-miR-27b对MSTN基因有很强的靶向调控作用,表现为bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。

关键词：关岭牛 MSTN基因 3'端非翻译区(3'-UTR) bta-miR-27b 双荧光靶向验证

关岭牛MEF2A基因干扰载体构建及其转染对成肌细胞的影响

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畜牧兽医学报 2023年第2期54卷 584-595页

作者：孙金魁许厚强石鹏飞阮涌贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵阳550025

旨在构建肌细胞增强因子MEF2A(myocyte enhancer factor 2A)基因的重组干扰载体,探究MEF2A基因对牛成肌细胞的影响。本研究选择3头健康的3日龄雌性关岭牛,体重约为21 kg,采集背最长肌组织成功培养成肌细胞。设计MEF2A基因的4对shRNA干... 详细信息

旨在构建肌细胞增强因子MEF2A(myocyte enhancer factor 2A)基因的重组干扰载体,探究MEF2A基因对牛成肌细胞的影响。本研究选择3头健康的3日龄雌性关岭牛,体重约为21 kg,采集背最长肌组织成功培养成肌细胞。设计MEF2A基因的4对shRNA干扰序列和1对NC阴性对照序列,将其连接至pGPU6-GFP-Neo载体上,转染重组载体至关岭牛成肌细胞。采用qRT-PCR法筛选干扰效率最佳的载体,并检测干扰MEF2A基因对肌生成因子MEF2B、MEF2C、MEF2D,周期与凋亡因子CDK2、CCNA2、BCL2 mRNA表达水平的影响;随后利用流式细胞仪与酶标仪探究干扰载体对成肌细胞增殖生长的影响,各试验组别设置3个生物学重复。同时运用在线软件预测牛MEF2A蛋白理化性质与网络谱图。结果显示,本研究成功筛选出干扰效率最佳的shRNA-MEF2A-3载体(P牛成肌细胞后,可有效抑制MEF2A基因表达,改变基因表达模式,影响了关岭牛成肌细胞的分裂增殖,为进一步探究MEF2A基因对关岭牛肉质性状调控机制和挖掘地方种质资源提供数据支撑。

关键词：关岭牛 MEF2A基因干扰成肌细胞细胞增殖

关岭牛FABP3和FABP4基因的分子特征及其组织表达分析

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南方农业学报 2022年第8期53卷 2281-2293页

作者：石鹏飞阮涌刘文娇许家利孙金魁熊讯许厚强贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点试验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点试验室贵州贵阳550025

【目的】探究关岭牛心脏型脂肪酸结合蛋白(FABP3)和脂肪型脂肪酸结合蛋白(FABP4)基因的分子特征及其在不同年龄段和不同组织中的表达差异,为揭示牛FABP3和FABP4基因对脂肪酸的调控作用机制提供理论依据。【方法】通过RT-PCR扩增关岭牛FA... 详细信息

【目的】探究关岭牛心脏型脂肪酸结合蛋白(FABP3)和脂肪型脂肪酸结合蛋白(FABP4)基因的分子特征及其在不同年龄段和不同组织中的表达差异,为揭示牛FABP3和FABP4基因对脂肪酸的调控作用机制提供理论依据。【方法】通过RT-PCR扩增关岭牛FABP3和FABP4基因蛋白编码区(CDS)序列,采用ProtScale、ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL、TMHMM-2.0、SignalP-5.0及NetPhos-3.1等在线软件进行生物信息学分析,同时以实时荧光定量PCR检测FABP3和FABP4基因在3日龄关岭犊牛、24月龄关岭牛(成年)及24月龄杂交牛(关岭牛×利木赞牛)各组织中的表达情况。【结果】关岭牛FABP3、FABP4基因CDS序列全长分别为402和399 bp,对应编码133和132个氨基酸残基,其蛋白二、三级结构以无规则卷曲和延伸链为主,均无跨膜结构域和信号肽,且为稳定的亲水性蛋白。关岭牛FABP3、FABP4氨基酸序列分别存在26和21个磷酸化位点,其中又以苏氨酸磷酸化位点为主;关岭牛FABP3和FABP4蛋白与FABP1、FABP6、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂蛋白脂肪酶(LPL)及激素敏感脂肪酶(LIPE)等存在互作关系。基于FABP3和FABP4氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树均显示,关岭牛与牦牛的亲缘关系最近,其次是绵羊,与鸡和斑马鱼的亲缘关系较远。FABP3和FABP4基因在关岭牛和杂交牛各组织中均有不同程度的表达,其中,FABP3基因以在心脏中的相对表达量最高,且在成年牛中的相对表达量极显著高于犊牛和杂交牛(P牛中的相对表达量极显著高于成年牛。【结论】关岭牛FABP3和FABP4基因具有较高的遗传保守性,且以在心脏和脂肪中的表达水平较高,与脂肪酸代谢密切相关。

关键词：关岭牛 FABP3基因 FABP4基因分子特征组织表达脂肪酸代谢

关岭牛TBC1D7基因单核苷酸多态性筛查及生物信息学分析

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浙江农业学报 2022年第7期34卷 1402-1411页

作者：刘鹏程张继邱淦远龚俞李雪松李维张依裕刘若余贵州大学动物科学学院高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室贵州贵阳550025 贵州省畜禽遗传资源管理站贵州贵阳550001

为探究关岭牛TBC1D 7(TBC1 domain family,member 7)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism sites,SNPs)对其生长性状的影响。以贵州关岭牛为试验对象,构建DNA混合池,采用PCR扩增后直接测序法对关岭牛TBC1D 7基因进行SNPs... 详细信息

为探究关岭牛TBC1D 7(TBC1 domain family,member 7)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism sites,SNPs)对其生长性状的影响。以贵州关岭牛为试验对象,构建DNA混合池,采用PCR扩增后直接测序法对关岭牛TBC1D 7基因进行SNPs检测,并对其进行生物信息学分析。结果显示:关岭牛TBC1D 7基因蛋白质编码区(CDS)全长882 bp,编码氨基酸293个,形成了一种不稳定的可溶性蛋白。该蛋白中不存在跨膜区域且不存在信号肽,为非分泌蛋白。蛋白中存在6个潜在的N-糖基化位点,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;在关岭牛TBC1D 7基因CDS区共发现了4个同义突变位点,分别为c.402T>C、c.414A>G、c.609C>T和c.648T>C。4个突变位点均导致关岭牛TBC1D 7基因mRNA二级结构、自由能和基因频率发生变化。本实验筛查到关岭牛TBC1D 7基因4个SNPs位点,表明关岭牛TBC1D 7基因多态性丰富,为进一步研究TBC1D 7基因变异和关岭牛生长发育性状的相关性提供理论基础。

关键词：关岭牛 TBC1D 7基因单核苷酸多态性生物信息学

关岭牛IGF1基因干扰载体构建及其对成肌细胞的影响

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农业生物技术学报 2022年第5期30卷 896-907页

作者：宋林锦许厚强李永孙金魁贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵州大学动物科学学院贵州大学生命科学学院

胰岛素样生长因子1 (insulin like growth factor 1, IGF1)是通过调控骨骼肌蛋白的合成影响肌肉发育的单链多肽类激素，对细胞增殖等多种生理功能具有重要作用，本研究旨在探究IGF1基因对关岭牛(Bos taurus)成肌细胞的影响。选用健康的... 详细信息

胰岛素样生长因子1 (insulin like growth factor 1, IGF1)是通过调控骨骼肌蛋白的合成影响肌肉发育的单链多肽类激素，对细胞增殖等多种生理功能具有重要作用，本研究旨在探究IGF1基因对关岭牛(Bos taurus)成肌细胞的影响。选用健康的成年(2～3岁)关岭牛3头，采集心、肝、脾、肺、肾、前腿肌、后腿肌、背最长肌、斜方肌、臀肌、胃、小肠12个组织样提取RNA，采集背最长肌组织成功培养关岭牛成肌细胞。运用qPCR技术检测IGF1基因在不同组织中的相对表达量；运用在线软件对关岭牛IGF1蛋白质理化性质、二级结构和三级结构、亚细胞定位进行分析；同时通过在线软件设计IGF1基因的3对短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)干扰序列和1对阴性对照序列，与pGPU6-GFP-Neo载体连接后进行测序，将构建成功的IGF1基因干扰载体转染至成肌细胞；运用qPCR技术检测并筛选出干扰效率最高的干扰载体，分析该干扰载体对IGF1基因表达的影响；运用qPCR技术检测干扰IGF1基因对细胞增殖相关基因细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖性激酶2 (cyclin-dependent kinases 2, CDK2)的相对表达量影响；运用CCK8 (Cell Counting Kit-8)法检测成肌细胞增殖情况。结果表明，IGF1基因在关岭牛心、前腿肌、后腿肌、背最长肌、斜方肌、臀肌等12个组织样中均有表达，在肝中相对表达量最高，极显著高于其他组织(P关岭牛成肌细胞的基础上，成功构建关岭牛IGF1基因干扰载体，并筛选出shRNA-IGF1-1干扰效率最高(P关基因cyclin D1和CDK2的表达量均极显著低于shRNA-NC (P关基因表达。本研究为进一步研究IGF1基因对关岭牛肌肉生长发育的作用及调控机制提供了基础数据。

关键词：关岭牛胰岛素样生长因子1 (IGF1) RNA干扰成肌细胞细胞增殖

关岭牛MEF2A和MEF2B基因克隆及其组织表达特征分析

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南方农业学报 2022年第9期53卷 2643-2653页

作者：孙金魁许厚强阮涌宋林锦许家利陈晨石鹏飞贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵州贵阳550025

【目的】探究肌细胞增强因子-2(MEF2A和MEF2B)的生物学信息特征及其在关岭牛不同发育阶段各器官组织中的表达情况,为揭示MEF2A和MEF2B基因在关岭牛生长发育过程中的作用机制及挖掘地方种质资源提供理论参考。【方法】通过RT-PCR克隆MEF2... 详细信息

【目的】探究肌细胞增强因子-2(MEF2A和MEF2B)的生物学信息特征及其在关岭牛不同发育阶段各器官组织中的表达情况,为揭示MEF2A和MEF2B基因在关岭牛生长发育过程中的作用机制及挖掘地方种质资源提供理论参考。【方法】通过RT-PCR克隆MEF2A(NM_001083638.2)和MEF2B(NM_001145793.1)基因编码区(CDS)序列,利用ProtScal、NetPhs 3.1、SOPMA、ProtParam、PSORT II Preadict、SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR检测MEF2A和MEF2B基因在关岭牛不同发育阶段(犊牛、青年牛和成年牛)各器官组织中的表达水平。【结果】关岭牛MEF2A和MEF2B基因CDS序列分别编码492和368个氨基酸残基;MEF2A和MEF2B蛋白相对分子量分别为52和39 k D,对应的理论等电点(p I)为9.07和9.35,均属于碱性不稳定蛋白。关岭牛MEF2A和MEF2B蛋白以无规则卷曲和α-螺旋为主,主要定位于细胞核(分别占60.9%和52.2%)。关岭牛MEF2A基因与与挪威鼠和绵羊的MEF2A基因遗传距离较近,关岭牛MEF2B基因则与牦牛和绵羊的MEF2B基因遗传距离较近。实时荧光定量PCR检测结果显示,MEF2A和MEF2B基因在关岭牛不同发育阶段的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、里脊和脂肪等7个组织中均有表达,且受生长发育阶段的影响。其中,MEF2A基因在犊牛各器官组织中的相对表达量极显著高于在青年牛和成年牛(P关岭牛心脏中的相对表达量极显著高于其他组织;MEF2B基因在青年牛和成年牛的相对表达量极显著高于犊牛,且在关岭牛心脏、肝脏和脾脏中的表达量与年龄呈正相关。【结论】MEF2A基因在关岭牛不同发育阶段心脏中高表达,而MEF2B基因在关岭牛不同发育阶段肺脏和脾脏中高表达,但在里脊中的表达相对较低。可见,MEF2A和MEF2B基因在关岭牛的生长发育过程中发挥重要作用。

关键词：关岭牛 MEF2A基因 MEF2B基因表达特征生长发育

关岭牛IGF1、MSTN对成肌细胞增殖的作用研究

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关岭牛IGF1、MSTN对成肌细胞增殖的作用研究

作者：宋林锦贵州大学

学位级别：硕士

胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1,IGF1)与肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)作为动物机体肌肉生长的调控因子,对成肌细胞的增殖具有重要作用。本研究以关岭牛为研究材料,通过分子克隆、CCK8、qPCR技术、细胞划痕、流式细... 详细信息

胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1,IGF1)与肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)作为动物机体肌肉生长的调控因子,对成肌细胞的增殖具有重要作用。本研究以关岭牛为研究材料,通过分子克隆、CCK8、qPCR技术、细胞划痕、流式细胞术等技术研究IGF1、MSTN基因对关岭牛成肌细胞增殖的影响,进一步了解关岭牛肌肉生长发育规律,为关岭牛肉质改良提供细胞水平基础数据参考。1.关岭牛IGF对成肌细胞增殖的作用研究对关岭牛IGF1基因序列进行氨基酸组成分析、蛋白结构分析等生物信息学分析,探究IGF1基因在关岭牛各组织中的m RNA表达差异;培养关岭牛骨骼肌成肌细胞并进行纯度鉴定;构建pEGFP-C1-IGF1过表达载体与p GPU6-GFP-Neo干扰载体;运用CCK8、qPCR技术、细胞划痕和流式细胞术检测IGF1基因对关岭牛成肌细胞增殖的影响。结果表明,IGF1基因在肝中表达量最高,极显著高于其他组织(P关基因cyclin A2、cyclin B1和PCNA的表达量均极显著高于对照组(P关基因cyclin A2、cyclin B1和PCNA的表达量均极显著降低(P关岭牛MSTN对成肌细胞增殖的作用研究将构建成功的MSTN基因干扰载体转染至成肌细胞筛选鉴定;运用CCK8、qPCR技术、细胞划痕和流式细胞术探究MSTN基因对关岭牛成肌细胞增殖的影响。结果表明在成肌细胞过表达MSTN基因会极显著下调细胞增殖相关基因cyclin A2、cyclin D1表达(P关岭牛IGF1、MSTN对成肌细胞增殖的作用研究通过脂质体分别共转染IGF1、MSTN基因过表达载体与干扰载体,运用CCK8、qPCR技术、细胞划痕和流式细胞术检测IGF1与MSTN基因共同作用对成肌细胞增殖的影响。结果表明IGF1、MSTN基因共表达极显著下调细胞增殖相关基因Cyclin A2、Cyclin B1表达(P关岭牛成肌细胞中MSTN基因调控IGF1基因介导的成肌细胞增殖。综上所述,IGF1基因对成肌细胞增殖具有正向调控作用,与之相反MSTN基因对成肌细胞增殖具有负向调控作用,而IGF1、MSTN相互作用共同调控成肌细胞增殖过程中,MSTN基因调控IGF1基因介导的成肌细胞增殖。

关键词：关岭牛成肌细胞增殖 IGF1 MSTN