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西沙石珊瑚共附生放线菌的分离培养及抗菌活性评价

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微生物学通报 2023年第5期50卷 1756-1771页

作者：李依霖熊子君张世清王蓉郭志凯海南热带海洋学院生态环境学院海南三亚572000 海南省海洋与渔业科学院海南省热带海水养殖技术重点实验室海南海口571126 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南省热带微生物资源重点实验室海南热带农业资源研究院海南省热带农业生物资源保护与利用重点实验室海南海口571101

【背景】珊瑚礁生态系统是海洋中一类极其重要的生态系统,健康珊瑚礁中丰富的共附生放线菌群体是珊瑚抵御各种致病菌的重要防线,因此,这类放线菌是寻找抗菌活性分子的重要资源,其药用潜力巨大。【目的】从西沙石珊瑚样品中分离共附生放... 详细信息

【背景】珊瑚礁生态系统是海洋中一类极其重要的生态系统,健康珊瑚礁中丰富的共附生放线菌群体是珊瑚抵御各种致病菌的重要防线,因此,这类放线菌是寻找抗菌活性分子的重要资源,其药用潜力巨大。【目的】从西沙石珊瑚样品中分离共附生放线菌,并从中筛选具有良好抗菌活性的菌株。【方法】通过稀释涂布法分离珊瑚共附生放线菌,并根据16S rRNA基因序列构建系统发育树进行菌种鉴定;通过平板对峙法对放线菌进行抗菌活性筛选并确定目标菌株;将目标菌株涂布于不同氯化钠浓度的ISP2固体培养基上培养,测试其盐度耐受能力;通过平板对峙法对该菌株发酵产物的热稳定性和光稳定性进行测试;采用NanoPore和Illumina方法完成目标活性放线菌全基因组测序,并通过antiSMASH在线分析预测其次级代谢产物生物合成基因簇及其结构类型。【结果】从6份西沙石珊瑚样品中分离得到104株可培养放线菌,根据菌落形态和分离来源去重后对其中27株放线菌进行16S rRNA基因序列测序,通过序列比对和系统发育树分析将菌株初步鉴定为盐孢菌属(Salinispora)(25株)、链霉菌属(Streptomyces)(1株)和戈登菌属(Gordonia)(1株)。活性筛选结果表明,盐孢菌株SH098抑菌活性最好,该菌株在无盐的培养基中不生长,盐耐受范围为2%−5%,其发酵产物的抗菌活性具有良好的热稳定性和光稳定性。全基因组序列分析显示,盐孢菌株SH098基因组中21.93%的基因序列与次级代谢产物合成相关,预测的次级代谢产物结构类型多样,有待深入发掘。【结论】首次从我国西沙石珊瑚中分离得到具有嗜盐特性和抗农业病原细菌活性的盐孢菌,丰富了我国西沙海域来源的专性海洋放线菌资源,为海水养殖业的新型微生态制剂的研发提供新菌种资源,也为后期挖掘新型抗菌活性物质奠定了研究基础。

关键词：石珊瑚共附生放线菌分离培养沙栖盐孢菌抗菌活性

海南白蚁共附生放线菌的分离鉴定及抗热带作物病原真菌活性研究

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热带作物学报 2022年

作者：吴炜城陈必婷张世清郭志凯李吉涛湖北民族大学林学园艺学院海南省热带微生物资源重点实验室中国热带农业科学院热带生物技术研究所

白蚁(Isoptera)的筑巢和觅食活动主要在土壤及腐烂的木材上进行，所以白蚁极易受到来自环境病原微生物的侵害。因此，白蚁需要依赖共附生微生物菌群形成防御体系，放线菌是其中一个重要的类群，且放线菌能产生具有抗菌活性的次级代谢产... 详细信息

白蚁(Isoptera)的筑巢和觅食活动主要在土壤及腐烂的木材上进行，所以白蚁极易受到来自环境病原微生物的侵害。因此，白蚁需要依赖共附生微生物菌群形成防御体系，放线菌是其中一个重要的类群，且放线菌能产生具有抗菌活性的次级代谢产物。但是白蚁共附生放线菌能否对热带作物的病原真菌有抑制活性有待研究。为了挖掘在热带农业绿色健康发展中具有应用潜力的海南特色农用放线菌资源，以海南白蚁共生放线菌为研究对象，利用平板分离法从采集的健康白蚁体内分离纯化放线菌，平板对峙法筛选生防菌株；通过分子生物学确定分类地位；平板对峙法研究拮抗菌株的抗菌稳定性、持效性、广谱性；滤纸片法研究抑菌物质的热稳定性。结果从海南白蚁体内分离得到1株拮抗活性较好的放线菌菌株W7，系统发育树分析结果表明该放线菌与链霉菌属(Streptomyces)亲缘关系接近。菌株W7的抗菌活性持久性强，平板接种30 d后仍对植物病菌真菌有抑菌活性，抗菌稳定性好；菌株W7抑菌谱广，它对16株植物病原真菌有不同程度的抑菌活性，其中对芒果胶孢霉(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)、香蕉炭疽霉(Colletotrichum musae)、辣椒棒孢霉(Corynespora cassiicola)、豇豆瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp)抑制作用较强，对芦笋拟茎点霉(Phomopsis asparagi)、荔枝疫霉(Peronophythora litchi)抑制作用较弱；菌株W7发酵粗提物有较好的热稳定性，但是抑菌率会随着水浴温度增高而降低。本文首次对海南白蚁共附生放线菌进行了分离鉴定，并从中筛选得到1株具有抑制多种热带作物病原真菌活性的生防菌株，为高效生防菌剂研发提供新资源。

关键词：白蚁共附生放线菌植物病原真菌生防菌剂

海南白蚁共附生放线菌的分离鉴定及其抗热带作物病原真菌活性研究

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热带作物学报 2022年第6期43卷 1240-1247页

作者：吴炜城陈必婷张世清郭志凯李吉涛生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族大学) 湖北恩施445000 海南省热带微生物资源重点实验室/中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口571101 海南省热带农业生物资源保护与利用重点实验室/中国热带农业科学院海南热带农业资源研究院海南海口571101

白蚁(Isoptera)的筑巢和觅食活动主要在土壤及腐烂的木材上进行,所以白蚁极易受到来自环境病原微生物的侵害。因此,白蚁需要依赖共附生微生物菌群形成防御体系,放线菌是其中一个重要的类群,且放线菌能产生具有抗菌活性的次级代谢产物。... 详细信息

白蚁(Isoptera)的筑巢和觅食活动主要在土壤及腐烂的木材上进行,所以白蚁极易受到来自环境病原微生物的侵害。因此,白蚁需要依赖共附生微生物菌群形成防御体系,放线菌是其中一个重要的类群,且放线菌能产生具有抗菌活性的次级代谢产物。但是白蚁共附生放线菌能否对热带作物的病原真菌有抑制活性有待研究。为了挖掘在热带农业绿色健康发展中具有应用潜力的海南特色农用放线菌资源,以海南白蚁共生放线菌为研究对象,利用平板分离法从采集的健康白蚁体内分离纯化放线菌,利用平板对峙法筛选生防菌株;通过分子生物学确定其分类地位;平板对峙法研究拮抗菌株的抗菌稳定性、持效性和广谱性;滤纸片法研究抑菌物质的热稳定性。结果从海南白蚁体内分离得到1株拮抗活性较好的放线菌菌株W7,系统发育树分析结果表明该放线菌与链霉菌属(Streptomyces)亲缘关系接近。菌株W7的抗菌活性持久性强,平板接种30 d后仍对植物病原真菌具有抑菌活性,抗菌稳定性好;菌株W7抑菌谱广,对16株植物病原真菌有不同程度的抑菌活性,其中对芒果胶孢霉(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)、香蕉炭疽霉(Colletotrichum musae)、辣椒棒孢霉(Corynespora cassiicola)、豇豆瓜果腐霉[Pythium aphanidermatum(Edson)Fitzp]抑制作用较强,对芦笋拟茎点霉(Phomopsis asparagi)、荔枝疫霉(Peronophythora litchi)抑制作用较弱;菌株W7发酵粗提物有较好的热稳定性,但是抑菌率会随着水浴温度的增高而降低。本文首次对海南白蚁共附生放线菌进行了分离鉴定,并从中筛选得到1株具有抑制多种热带作物病原真菌活性的生防菌株,为高效生防菌剂的研发提供新资源。

关键词：白蚁共附生放线菌植物病原真菌生防菌剂

仿刺参共附生放线菌Kytococcus sp.中的环二肽成分

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中国海洋药物 2013年第2期32卷 31-36页

作者：鄂恒超汤华刘宝姝孙鹏李玲李志勇张文第二军医大学药学院海洋药物研究中心上海200433 上海交通大学生命科学技术学院海洋生物技术实验室上海200240

目的对仿刺参共附生放线菌Kytococcus sp.化学成分进行研究。方法用硅胶柱色谱,Sephadex LH-20凝胶柱色谱,反向高效液相柱层析(RP-HPLC)等分离手段对放线菌(Kytococcus sp.)乙酸乙酯提取物进行分离纯化,并利用1 H NMR、13 C NMR、质谱(... 详细信息

目的对仿刺参共附生放线菌Kytococcus sp.化学成分进行研究。方法用硅胶柱色谱,Sephadex LH-20凝胶柱色谱,反向高效液相柱层析(RP-HPLC)等分离手段对放线菌(Kytococcus sp.)乙酸乙酯提取物进行分离纯化,并利用1 H NMR、13 C NMR、质谱(MS)等手段并与文献对照相结合,鉴定化合物的结构。结果分离得到9个已知的环二肽类化合物,其结构分别为:环(L-脯-L-缬)二肽(1),环(L-脯-L-丙)二肽(2),环(L-脯-L-酪)二肽(3),环(L-脯-L-异亮)二肽(4),环(L-脯-L-亮)二肽(5),环(L-脯-L-苯丙)二肽(6),环(L-缬-L-亮)二肽(7),(L-亮-L-异亮)二肽(8),环(L-亮-L-亮)二肽(9)。结论这是首次从仿刺参中分离得到放线菌Kytococ-cus sp.,9个化合物均为首次从该属放线菌中分离得到。

关键词：仿刺参共附生放线菌环二肽

丛生盔形珊瑚共附生放线菌NLG-3的抑菌活性及鉴定

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2019年第10期47卷 97-105页

作者：张斯颖陈宇丰骆焱平王兰英海南大学植物保护学院海南海口570228 中国科学院上海高等研究院上海201210

[目的]探究丛生盔形珊瑚共附生放线菌NLG-3对植物病原菌的抑菌活性,对其分类地位进行鉴定,为丛生盔形珊瑚共附生放线菌的开发利用提供依据.[方法]采用平板对峙法测定NLLG-3对12种植物病原真菌的抑菌活性;采用滤纸片法测定NLG-3发酵液乙... 详细信息

[目的]探究丛生盔形珊瑚共附生放线菌NLG-3对植物病原菌的抑菌活性,对其分类地位进行鉴定,为丛生盔形珊瑚共附生放线菌的开发利用提供依据.[方法]采用平板对峙法测定NLLG-3对12种植物病原真菌的抑菌活性;采用滤纸片法测定NLG-3发酵液乙酸乙酯粗提物对5种病原细菌的抑菌活性;通过改变pH、温度及光照条件,测定该菌株发酵液的稳定性;采用几丁质平板培养法测定该菌株产几丁质酶的能力;通过基因扩增检测该菌株是否含有非核糖体多肽合成酶(NRPS)和聚酮合成酶(PKS)基因;结合菌株形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析对该菌株进行分类鉴定.[结果]菌株NLG-3具有广谱抑菌活性,对供试病原真菌均有不同程度的抑制作用,其中对香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)和胶孢炭疽病菌(C.gloeosporioides)的抑菌率均在85%以上.NLG-3发酵液乙酸乙酯粗提物可以明显抑制蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的生长,1 mg/mLNLG-3发酵液乙酸乙酯粗提物对蜡样芽孢杆菌的抑菌圈直径达(2.20±0.11) cm.NLG-3发酵液在中性(pH=7)条件下抑菌活性突出,经40℃及以上高温处理其活性丧失,光照对其抑菌活性无影响.NLG-3能产生几丁质酶,分解培养基中的几丁质.该菌株具有合成酶基因PKS-Ⅱ和NRPS,经初步鉴定该菌株为白刺链霉菌(Streptomyces albospinus).[结论]NLG-3抑菌活性较好,具有潜在防治热带植物病害的应用价值.

关键词：丛生盔形珊瑚共附生放线菌抑菌活性植物病原菌

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琼东海域珊瑚共附生放线菌的多样性

应用海洋学学报 2018年第2期37卷 218-228页

作者：周渊谢富全牛文涛郑新庆李登峰张改云宁波大学浙江宁波315000 国家海洋局第三海洋研究所福建厦门361005

应用免培养方法与可培养方法相结合的方式对琼东海域6种珊瑚样品中的共附生放线菌进行研究,具体为滨珊瑚(Porite)、扁脑珊瑚(Platygyra)、角蜂巢珊瑚(Favites)、盔形珊瑚(Galaxea)和鹿角珊瑚(Acropora).免培养方法中,利用放线菌特异性... 详细信息

应用免培养方法与可培养方法相结合的方式对琼东海域6种珊瑚样品中的共附生放线菌进行研究,具体为滨珊瑚(Porite)、扁脑珊瑚(Platygyra)、角蜂巢珊瑚(Favites)、盔形珊瑚(Galaxea)和鹿角珊瑚(Acropora).免培养方法中,利用放线菌特异性引物对样品总DNA进行16S rRNA基因序列扩增,并将扩增产物进行Miseq高通量测序,测序结果分析表明,6种珊瑚样品中的放线菌序列属于37个分类单元,主要分布在酸微菌目、棒杆菌目、微球菌目、丙酸杆菌目和假诺卡式菌目,其中37.8%的分类单元与已有效发表菌株的序列相似性小于97%,可能代表着放线菌新的类群.可培养方法中,通过6种培养基分得137株放线菌,分属于放线菌门放线菌纲5个目11个科下的20个属,优势类群为分枝杆菌属(Mycobacterium)、考克氏菌属(Kocuria)和微球菌属(Micrococcus),其中放线孢菌属(Actinomycetospora)、柠檬球菌属(Citricoccus)和涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)是第一次从珊瑚样品中发现;琼东海域珊瑚共附生放线菌多样性丰富,新类型的放线菌资源挖掘潜力比较大.

关键词：海洋生物学珊瑚共附生放线菌多样性

南极普里兹湾海绵共附生放线菌的分离及其次级代谢潜力评估

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中国海洋药物 2017年第5期36卷 1-8页

作者：官颖颖于雪张海雷张宁李静中国海洋大学海洋生命学院山东青岛266003

目的通过研究了解南极海域海绵共附生放线菌的多样性以及活性次级代谢产物的合成潜力。方法采用4种分离培养基对南极海绵进行放线菌的分离培养,对分离到的菌株进行抗菌及微藻克生活性的筛选,对活性菌株的进行基于聚酮合酶、非核糖体肽... 详细信息

目的通过研究了解南极海域海绵共附生放线菌的多样性以及活性次级代谢产物的合成潜力。方法采用4种分离培养基对南极海绵进行放线菌的分离培养,对分离到的菌株进行抗菌及微藻克生活性的筛选,对活性菌株的进行基于聚酮合酶、非核糖体肽合成酶和卤化酶的基因筛选。结果共分离得到59株海绵共附生放线菌,分布于9个属中,以链霉菌最多。21株具有较好的抗菌活性;6株菌表现出明显的赤潮微藻克生活性;有7株活性菌株至少含2种关键的功能基因,菌株OAct311和OAct408同时含有4种功能基因。结论研究结果揭示了南极海绵共附生放线菌物蕴含丰富的放线菌资源并且有较高的合成活性次级代谢物的潜力,具有深一步研究的价值。

关键词：南极海绵共附生放线菌功能基因

蜚蠊共附生放线菌的分离、活性筛选和次级代谢产物研究

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蜚蠊共附生放线菌的分离、活性筛选和次级代谢产物研究

作者：安然厦门大学

学位级别：硕士

天然产物是药物的重要来源。许多常用的临床药物均来自于微生物次级代谢产物。其中放线菌(Actinomycetes)在产生抗生素方面具有独特的优势,大约75%的抗生素都是由放线菌产生。从动物共附生微生物可以分离到许多结构新颖,生物活性多样的... 详细信息

天然产物是药物的重要来源。许多常用的临床药物均来自于微生物次级代谢产物。其中放线菌(Actinomycetes)在产生抗生素方面具有独特的优势,大约75%的抗生素都是由放线菌产生。从动物共附生微生物可以分离到许多结构新颖,生物活性多样的化合物。而昆虫共附生放线菌及其次级代谢产物的研究是一个新的领域。有可能对新药的研究及解决抗药性问题起到巨大的推动作用。本论文对采集自厦门大学学生宿舍的蜚蠊进行体内(分为肠道和其他内脏)共附生放线菌的分离,共分离到50株放线菌。并对分离到的菌株进行了分子鉴定,通过16SrDNA的序列分析,结果表明所有菌株均属于链霉菌属。以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、白色假丝酵母(Candida albicans)和黑曲霉(Aspergillus niger)为指示菌,采用牛津杯法对这些菌株进行抗菌活性检测,共筛选得到活性菌株15株,占总菌株数的30%,其中主要是抗革兰氏阳性细菌的活性,但活性都较弱;采用MTT法对其体外抗肿瘤活性进行检测,发现有39株放线菌对HeLa(人子宫癌细胞)具有抑制作用,占总菌株数的78%,其中有15株放线菌对HeLa(人子宫癌细胞)有很强的抑制作用,占总菌株数的30%。本论文对两株具有较强抗肿瘤活性的链霉菌菌株A2-7和A0-1的次级代谢产物进行了初步研究。从菌株A2-7的液体发酵产物中分离并鉴定了9个化合物,其中4个为新化合物,Q7、Q19和Q27为杂合萜类,Q10为呋喃酸类。5个为已知化合物,Q1B和Q26为呋喃酮类物质,Q11为苯乙酸苯酯类物质,Q16为饱和脂肪酸类物质,Q17为吲哚类物质;另外,从菌株A2-7的固体发酵产物中分离到并鉴定了1个已知化合物Q31,为苯乙酰氨类物质。从菌株A0-1的固体发酵产物中分离并鉴定了4个已知化合物,其中Q42为氨基酸类物质,Q43和Q44为葸醌类物质—Q47为羟基苯乙酮类物质。对新化合物Q7、Q10、Q19和Q27的抗菌活性及抗肿瘤活性进行了研究,在样品浓度为100μg/ml时,用MIC法测定抗菌活性,对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、白色假丝酵母(Candida albicans)和黑曲霉5种指示菌,4个化合物均没有显示出明显的抗菌活性。抗肿瘤实验结果显示,在样品浓度为10μg/ml样品没有显示出抗肿瘤活性。本文结果表明,蜚蠊共附生放线菌中包含有抗菌和抗肿瘤活性的菌株,而这些菌株的次级代谢产物类型丰富,其中有抗菌和抗肿瘤活性物质,同时也蕴藏着较丰富的结构新颖的活性物质,研究昆虫共附生放线菌可能为开发新的抗菌、抗肿瘤药物奠定基础。

关键词：蜚蠊共附生放线菌活性筛选次级代谢产物结构

海洋动植物共附生放线菌农抗活性物质的初步研究

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海洋动植物共附生放线菌农抗活性物质的初步研究

作者：胡志钰厦门大学

学位级别：硕士

本文以卤虫为指示虫，构建了双层琼脂扩散法的杀虫抗生素初筛模型。并对分离于台湾海峡厦门海区鹧鸪菜、海仙人掌等8种海洋动植物的149株海洋动植物共附生放线菌进行杀虫活性菌株的筛选;以镰刀菌、弯孢霉等为指示菌，以双层琼脂扩散法... 详细信息

本文以卤虫为指示虫，构建了双层琼脂扩散法的杀虫抗生素初筛模型。并对分离于台湾海峡厦门海区鹧鸪菜、海仙人掌等8种海洋动植物的149株海洋动植物共附生放线菌进行杀虫活性菌株的筛选;以镰刀菌、弯孢霉等为指示菌，以双层琼脂扩散法进行抗真菌活性菌株的筛选。试图阐明海洋动植物对其共附生放线菌杀虫抗菌资源生态分布的影响程度，同时对筛选获得的高活性菌株，进行初步的理化性质研究。研究结果表明：海洋动植物共附生放线菌中存在着丰富的杀虫抗真菌资源。149株菌株中22.1％的菌株具有杀虫活性;12.8％的菌株具有抗真菌活性。在供测的8种海洋动植物的共附生放线菌中，鹧鸪菜、海仙人掌、沙菜和石莼的共附尘放线菌具杀虫活性菌株比例高于30％，鹧鸪菜的共附生放线菌抗真菌活性菌株比例高达40.90％。杀虫抗菌高活性菌株的分布同样受宿主很大影响，杀虫高活性菌株以海洋动物海仙人掌和海洋植物鹧鸪菜的比例最高，分别为30.0％和27.3％;抗真菌的高活性菌株主要分布于鹧鸪菜、海仙人掌和沙菜上，三者高活性菌株占总供测菌株的8.6％，其中以分离于鹧鸪菜的菌株高抗比例最高，达31.8％，表明了不同宿主上分布着不同的杀虫抗菌农抗资源，宿主对杀虫抗菌高活性菌株的分布有显著的影响。海仙人掌和鹧鸪菜上的共附生放线菌杀虫抗菌资源具有较高的研究意义和开发价值。 2934、449菌株具有较高的杀虫抗菌生物活性，初步鉴定归于链霉菌属(Streptomyces sp．)。2934菌株的发酵液对卤虫的ID高于100信，对小杆线虫和根结线虫高于20倍，对蚜虫和螨类也具有中度的活性。2934菌株杀虫主要组分为脂溶性物质，TLC测定在Rf值0.31的斑点有较强的杀虫活性。449菌株对真菌有很强的杀菌作用，对土传病原镰刀菌等真菌的抗菌活性Di/Dc在4.0以上，同时抗菌谱广。449菌株抗菌主要组分也为脂溶性物质，TLC测定在Rf值0.21和0.31的斑点有较强的抗真菌活性，具有潜在的应用价值。

关键词：海洋动植物共附生放线菌农用抗生素