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慢病毒介导BMP2和VEGF165基因共转染对骨髓基质干细胞成骨分化的影响

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上海交通大学学报（医学版） 2011年第6期31卷 753-758页

作者：蒋佳范存义曾炳芳复旦大学运动医学中心华山医院运动医学与关节镜外科上海200040 上海交通大学附属第六人民医院骨科上海200233

目的观察慢病毒介导骨形成蛋白2(BMP2)和血管内皮生长因子165(VEGF165)基因共转染对骨髓基质干细胞(MSCs)成骨分化的影响。方法构建携带BMP2、VEGF165和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组慢病毒表达载体,包装、生产携带BMP2、VEGF165和GFP基... 详细信息

目的观察慢病毒介导骨形成蛋白2(BMP2)和血管内皮生长因子165(VEGF165)基因共转染对骨髓基质干细胞(MSCs)成骨分化的影响。方法构建携带BMP2、VEGF165和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组慢病毒表达载体,包装、生产携带BMP2、VEGF165和GFP基因的重组慢病毒(Lv-BMP、Lv-VEGF、Lv-GFP)。分离、培养W istar大鼠骨髓MSCs,分别以Lv-GFP(GFP组)、Lv-BMP(BMP组)、Lv-VEGF(VEGF组)转染MSCs,Lv-BMP和Lv-VEGF共转染MSCs(BMP+VEGF组),另设未转染MSCs对照组。RT-PCR法检测转染后7 d各组细胞BMP2、VEGF165 mRNA表达以及转染后1、2、4周各组细胞骨钙素(OCN)mRNA表达;ELISA法检测转染后1、4、8周各组细胞培养上清液BMP2、VEGF165蛋白表达以及转染后1、2、4周各组细胞培养上清液OCN蛋白表达;转染后第14天,各组细胞行碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性检测。结果 BMP+VEGF组BMP2、VEGF165 mRNA和蛋白高效共表达,BMP2 mRNA和蛋白表达与BMP组比较差异无统计学意义(P>0.05),VEGF165 mRNA和蛋白表达与VEGF组比较差异无统计学意义(P>0.05);对照组、GFP组和VEGF组无BMP2 mRNA和蛋白表达;对照组、GFP组和BMP组无VEGF165 mRNA和蛋白表达;BMP+VEGF组OCN mRNA和蛋白表达显著高于其他各组(P共转染可促进骨髓MSCs成骨分化。

关键词：骨形成蛋白2 血管内皮生长因子165 共转染慢病毒载体成骨分化

BMP-14联合NogginshRNA共转染对脂肪来源干细胞成骨分化能力的影响

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中国修复重建外科杂志 2016年第10期30卷 1270-1275页

作者：刘浩芮永军孙振中汤峰林丁涛无锡市第九人民医院骨科江苏无锡214000 无锡市人民医院骨科

目的在体外环境下同时下调细胞中Noggin基因和增加BMP-14基因，观察对脂肪来源干细胞（adipose derived stemceHs，ADSCs）成骨分化能力的影响。方法取健康成年sD大鼠5只，体质量250—300g，采用I型胶原酶消化法获取原代ADSCs，体外培... 详细信息

目的在体外环境下同时下调细胞中Noggin基因和增加BMP-14基因，观察对脂肪来源干细胞（adipose derived stemceHs，ADSCs）成骨分化能力的影响。方法取健康成年sD大鼠5只，体质量250—300g，采用I型胶原酶消化法获取原代ADSCs，体外培养、扩增。使用慢病毒载体将目的基因转染大鼠ADSCs，根据目的基因不同将实验分为3组，A组为空载体病毒Lv-增强型绿色荧光蛋白转染对照组，B组为Lv—BMP-14转染组，C组为BMP-14＋NogginshRNA转染组。分别于转染后3、7、14d，采用实时荧光定量PCR检测BMP-14及成骨相关基因[I型胶原、ALP、骨钙素（osteocalcin，OCN）]的表达，转染后14d采用茜素红染色鉴定其成骨分化能力。结果转染后3d，各组BMP．14mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（P〉O．05）；7、14d，C组BMP-14mRNA相对表达量高于A、B组，B组高于A组，比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染后3d，C组各成骨相关基因mRNA相对表达量显著高于A、B组（P〈0．05）；A、B组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。转染后7、14d，C组各成骨相关基因mRNA相对表达量显著高于A、B组，B组高于A组，除转染后7dA、B组间I型胶原mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（P〉0．05）外，其余各组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染后14d茜素红染色示，A、B、C组钙结节量呈递增趋势。结论BMP-14具有增强大鼠ADSCs向成骨细胞分化的能力；沉默细胞中的Noggin基因、联合BMP-14基因共同作用于大鼠ADSCs，其体外成骨分化能力明显强于BMP-14单基因转染，两者有显著的协同作用。

关键词： BMP-14 Noggin 慢病毒共转染脂肪来源干细胞大鼠

sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达

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中国组织工程研究 2014年第50期18卷 8054-8060页

作者：刘伟王杰幸永明李纯志陈昌伟赵宏龚德军解放军第113医院骨科浙江省宁波市315040 解放军第二军医大学附属长海医院胸心外科实验室上海市200433

背景:与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比,将基因通过慢病毒转染入宿主细胞,可以得到长期高效的持续表达,采取双/多基因共修饰治疗的策略,较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。目的:构建sox... 详细信息

背景:与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比,将基因通过慢病毒转染入宿主细胞,可以得到长期高效的持续表达,采取双/多基因共修饰治疗的策略,较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。目的:构建sox9基因慢病毒载体以及LMP1基因慢病毒载体,并共转染兔骨髓间充质干细胞,观察SOX9和LMP1基因的表达情况。方法:双酶切从Gene Art提供的含sox9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体,获得含sox9基因的质粒p LMIG-13GS0345-1。通过单链oligo设计及合成LMP1基因序列,并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-Ds Red-Monomer载体,获得含LMP1基因的质粒13GS0318-1。再通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的sox9基因慢病毒载体(Lenti-SOX9-GFP),以及红色荧光蛋白的LMP1基因慢病毒载体(Lenti-LMP1-RFP)。将Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞,观察sox9基因及LMP1基因的表达情况。结果与结论:测序结果显示质粒p LMIG-13GS0345-1和13GS0318-1中的插入序列与基因库中sox9(NM_000346)及LMP1(AF345904.1)基因序列完全一致,成功构建Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞后同一视野下可观察到绿色和红色荧光蛋白的共表达,RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP可成功高效共转染目的细胞并可在m RNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1。结果说明实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带sox9基因的Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体,以及红色荧光蛋白的携带LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体,为sox9和LMP1基因共修饰组织工程髓核的研究提供前期实验基础。

关键词：干细胞间质干细胞慢病毒感染 sox9转录因子骨髓干细胞慢病毒 sox9基因 LMP1基因椎间盘髓核细胞共转染组织工程

骨形态发生蛋白2和7共转染骨髓间充质干细胞的成骨分化

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中国组织工程研究 2012年第49期16卷 9139-9145页

作者：陈剑袁文宋滇文胡凯猛范立星刘厚奇浙江大学医学院附属邵逸夫医院骨科浙江大学医学院附属邵逸夫医院临床研究所浙江省杭州市310016 解放军第二军医大学附属长征医院骨科上海市200003 解放军第二军医大学组织胚胎学教研室上海市200433

背景:骨形态发生蛋白最主要的作用是诱导骨形成,但因提取困难、代谢速度快、难以准确控制其使用浓度、价格昂贵等限制了其在体外和体内相关研究中的应用。目的:构建含特异细胞生长因子基因骨形态发生蛋白2,7的腺病毒载体,观察骨形态发... 详细信息

背景:骨形态发生蛋白最主要的作用是诱导骨形成,但因提取困难、代谢速度快、难以准确控制其使用浓度、价格昂贵等限制了其在体外和体内相关研究中的应用。目的:构建含特异细胞生长因子基因骨形态发生蛋白2,7的腺病毒载体,观察骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7基因共转染对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用。方法:将全骨髓贴壁法分离得到兔骨髓间充质干细胞传至第3代,分为5组,空白组和常规诱导组分别以常规培养基和成骨诱导分化培养基培养;骨形态发生蛋白2,7腺病毒转染组:分别单独以骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7腺病毒进行转染;联合转染组:以2种骨形态发生蛋白腺病毒联合转染。结果与结论:转染第7天,联合转染组成骨相关基因Runx-2、Osx、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶mRNA表达均较其他各组增高(P转染组上述指标较空白组和常规诱导组增高(P转染第14天,联合转染组4个指标均较其他各组明显增高(P转染后第7天,联合转染组Ⅰ型胶原和骨钙素蛋白表达均较其他组明显增高(P共转染后,较单基因转染和成骨诱导液诱导更能促进成骨相关基因和蛋白的表达。

关键词：骨髓间充质干细胞干细胞腺病毒骨形态发生蛋白2 骨形态发生蛋白7 Ⅰ型胶原共转染成骨诱导成骨活性成骨蛋白组织工程

3种血小板生成的关键因子共转染人骨髓基质细胞的研究

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中国输血杂志 2012年第3期25卷 207-212页

作者：林放王甜甜王世春孟强尹智平陆华蒋天伦赵树铭第三军医大学西南医院输血科重庆400038

目的构建TPO-pEGFP-N1、IL-6-pcDNA3.1(+)、IL-11-pcDNA3.1(-)3个真核表达载体,并观察其在共转染的人骨髓基质细胞中的表达情况。方法应用基因重组技术,构建TPO-pEGFP-N1、IL-6-pcDNA3.1(+)、IL-11-pcDNA3.1(-)3个真核表达载体,在脂质体介导下将其导入体外培养的人骨髓基质细胞内,24 h后观察TPO、IL-6、IL-11瞬时表达情况、蛋白含量及表达,并与未转染组、空载体转染组做对比。结果 1)酶切及测序结果均可证实TPO-pEGFP-N1、IL-6-pcDNA3.1(+)、IL-11-pcDNA3.1(-)3个真核表达载体的正确性。2)细胞转染24 h后,荧光显微镜下可观察到pEGFP-N1的表达,25%细胞发出绿色荧光;免疫细胞化学染色检测出IL-6及IL-11转染后能在细胞内表达。3)转染48 h后,Western blot检测出骨髓基质细胞内TPO、IL-6及IL-11的蛋白表达量。结论 TPO、IL-6、IL-11这3个基因可共转染人骨髓基质细胞,并在细胞内有效表达。

关键词：真核表达载体血小板相关因子 TPO IL-6 IL-11 骨髓基质细胞共转染

猪FcγRⅢ和γ链共转染Marc-145细胞系的建立

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华北农学报 2011年第1期26卷 6-10页

作者：邬成业史平玲乔松林王爱萍郝慧芳杜晓明王林林张改平河南省农业科学院农业部动物免疫学重点开放实验室河南省动物免疫学重点实验室河南郑州450002 郑州大学生物工程系河南郑州450001

为了建立稳定表达猪FcγRⅢ(Porcine Fc gamma receptorⅢ,poFcγRⅢ)的Marc-145细胞系,从PAM细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术获得猪FcγRⅢ和γ链的cDNA,并构建PIREShyg3-γ和pcDNA3.1-FcγRⅢ真核表达质粒;用脂质体共转染Marc-145细胞,经潮霉素B(300 mg/L)和G418(400 mg/L)共筛选获得稳定表达猪FcγRⅢ的细胞系;运用RT-PCR、玫瑰花环试验和流式细胞术对细胞系进行了鉴定。结果表明,成功构建了猪FcγRⅢ和γ链真核表达载体,建立了稳定表达猪FcγRⅢ的细胞系,表达于转染细胞表面的猪FcγRⅢ受体分子能与猪IgG特异结合。

关键词：猪FcγRⅢ受体 γ链共转染 Marc145细胞

共转染p53和反义p21^(WAF_1/CIP_1)基因对肾癌细胞凋亡调控作用的实验研究

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陕西医学杂志 2003年第4期32卷 351-353页

作者：刘贺亮温伟红崔大祥秦卫军王禾秦荣良袁建林第四军医大学西京医院泌尿外科西安710032 第四军医大学生化教研室

目的 :探讨 p5 3基因在 GRC- 1肾癌细胞系中的作用途径和 p2 1 WAF1 /CIP1 在 wt-p5 3介导的细胞凋亡中的作用。方法 :使用脂质体共转染方法将 wt- p5 3与反义 p2 1 WAF1 /CIP1基因导入 GRC- 1肾癌细胞系中 ,对所获转染细胞进行细胞周... 详细信息

目的 :探讨 p5 3基因在 GRC- 1肾癌细胞系中的作用途径和 p2 1 WAF1 /CIP1 在 wt-p5 3介导的细胞凋亡中的作用。方法 :使用脂质体共转染方法将 wt- p5 3与反义 p2 1 WAF1 /CIP1基因导入 GRC- 1肾癌细胞系中 ,对所获转染细胞进行细胞周期分析和阿霉素诱导细胞凋亡试验。结果 :在 wt- p5 3基因与反义 p2 1 WAF1 /CIP1 基因共转染后 GRC- 1肾癌细胞中 ,wt- p5 3基因的自发凋亡现象消失、亚致死量的阿霉素诱导下存活细胞数的增加。结论 :在 GRC- 1肾癌细胞中 ,wt- p5 3基因介导的细胞凋亡至少部分是通过 p2 1 WAF1 /CIP1 基因发挥作用。p2 1 WAF1

关键词：肾癌细胞凋亡共转染 p53基因反义p21^WAF1/CIP1基因实验研究

piggyBac共转染系统的构建以及转座活性的验证

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四川大学学报（自然科学版） 2011年第4期48卷 943-948页

作者：缪辉刘华华吴传芳四川大学生命科学学院功能基因组实验室成都610064

piggyBac(PB)转座子的末端反向重复序列(ITR)和转座酶编码序列(PBase)分别克隆于质粒PB1156、atub-pBac-K10.1TR与包含红色荧光蛋白表达序列(RFP)的质粒pmClherry-N1重组构成供体质粒(Donor);PBase与真核表达载体pEFrF-PGK重组构成辅助质粒(Helper).使用由供体质粒与辅助质粒组成的PB二元共转染系统转染HEK293细胞,结果表明该二元共转染系统具有较好的转座活性,并且在分子水平验证了转座的发生以及使用反向PCR(IPCR)定位了其中一个转座插入位点在HEK293基因组DNA上的位置.

关键词：转座子 piggyBac(PB) 共转染 IPCR

重组质粒pcDNA3.1his-hTH与pEGFP-C2共转染骨髓基质细胞源神经干细胞的实验研究

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中华神经外科杂志 2005年第2期21卷 118-122页

作者：徐强徐如祥姜晓丹潘力张世忠郭再玉南方医科大学珠江医院神经外科广州上海华山医院510282 复旦大学华山医院神经外科

目的　构建携带人酪氨酸羟化酶 (tyrosinehydroxylase, TH)目的基因片段的真核表达重组质粒—pcDNA3. 1his hTH,与pEGFP- C2共转染恒河猴骨髓源神经干细胞,观察hTH基因在骨髓源神经干细胞中的表达情况。方法　应用基因重组技术,将pWAV2... 详细信息

目的　构建携带人酪氨酸羟化酶 (tyrosinehydroxylase, TH)目的基因片段的真核表达重组质粒—pcDNA3. 1his hTH,与pEGFP- C2共转染恒河猴骨髓源神经干细胞,观察hTH基因在骨髓源神经干细胞中的表达情况。方法　应用基因重组技术,将pWAV2-TH中TH基因亚克隆到pcDNA3 .1his真核表达载体,以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcDNA3 .1his- hTH的正确性;将pcDNA3. 1his hTH和pEGFP- C2经电击穿孔法共转染恒河猴骨髓源神经干细胞, 24h后观察EGFP瞬时表达情况, 10d后进行hTH基因RT PCR,以及hTH和 6His单克隆抗体的免疫组化检测。结果⑴酶切和测序结果均证实pcDNA3 .1his hTH的正确性;⑵细胞转染 24h后,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达, 80%以上细胞发出绿色荧光; 10d后RT PCR检测到细胞内有hTH基因的表达,免疫组化结果显示细胞有hTH和 6His抗原表达。结论　成功构建的pcDNA3 .1his -hTH和pEGFP- C2能够共转染恒河猴骨髓源神经干细胞,hTH、EGFP和 6His基因在细胞内有效表达。该系统可以作为体外检测转染率、细胞移植治疗帕金森病活体跟踪移植细胞的技术平台。

关键词： pcDNA3 共转染 EGFP 神经干细胞 TH基因骨髓表达构建结论情况