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共聚焦内窥显微成像技术及其应用

中国激光 2022年第19期49卷 211-225页

作者：杨雪芳刘哲晰王璞北京航空航天大学生物与医学工程学院北京市生物医学工程高精尖创新中心北京100083

在过去的几十年中,内窥镜已被用于以微创或无创的方式观察人体内空腔内部或人体内部器官表面,以进行诊断或治疗。然而,临床上常用的普通白光内窥镜和放大内窥镜的分辨率低、对比度差,需要通过病理活检来确诊。近年来,新应用于临床的窄... 详细信息

在过去的几十年中,内窥镜已被用于以微创或无创的方式观察人体内空腔内部或人体内部器官表面,以进行诊断或治疗。然而,临床上常用的普通白光内窥镜和放大内窥镜的分辨率低、对比度差,需要通过病理活检来确诊。近年来,新应用于临床的窄谱技术通过光学或数字滤波的方式利用蓝光照射组织,以强化黏膜表面的细微结构和微血管形态,提高成像对比度,但仍未解决成像分辨率低的问题。因此,白光和窄带光内窥镜无法实现真正的光学活检,严重降低了诊断的准确性。共聚焦内窥镜由于分辨率可达亚微米量级并且具有光学切片的能力,可以呈现出与病理活检高度一致的细胞形态。共聚焦内窥显微成像技术在消化道、皮肤、眼部等疾病的诊断方面具有重要作用。本文对共聚焦内窥显微成像技术进行了简述,主要对荧光共聚焦显微成像和反射式共聚焦显微成像、探头式共聚焦内窥成像技术和整合式共聚焦内窥成像技术进行介绍,讨论了共聚焦内窥显微成像技术在生物医学领域的应用。

关键词：显微内窥镜共聚焦显微成像分辨率光学活检

基于DE-3D U-Net的斑马鱼后脑血管共聚焦显微图像分割和量化测量

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激光生物学报 2024年第3期33卷 209-216页

作者：郑文虎李辉陈冲王林波中国科学技术大学生命科学与医学部生物医学工程学院合肥230026 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所苏州215163

斑马鱼后脑部位的脉络丛控制着大脑和血管之间的物质交换,脉络丛周围的血管异常可引发相关的脑血管疾病。本文首先对斑马鱼后脑部位的主要血管进行了连续成像,使用共聚焦显微镜拍摄正常情况和柱孢藻毒素处理后的斑马鱼胚胎,获得了斑马... 详细信息

斑马鱼后脑部位的脉络丛控制着大脑和血管之间的物质交换,脉络丛周围的血管异常可引发相关的脑血管疾病。本文首先对斑马鱼后脑部位的主要血管进行了连续成像,使用共聚焦显微镜拍摄正常情况和柱孢藻毒素处理后的斑马鱼胚胎,获得了斑马鱼在受精后43~63 h的系列三维图像。然后,进一步开发了图像分割的神经网络DE-3D U-Net用于主要后脑血管的分割。网络分割结果显示,3根主要血管的类别像素准确率分别为86.67%、93.18%和83.74%。最后,绘制了斑马鱼后脑血管发育曲线图。结果表明,3根主要的血管半径在高浓度的柱孢藻毒素处理后出现了18%左右的缩减,中脑静脉夹角出现了30°~50°的缩减。此研究提出了一个可用于斑马鱼后脑血管分割的神经网络模型,得出的数据可为斑马鱼脉络丛发育研究提供基础。

关键词：斑马鱼后脑血管共聚焦显微成像 3D U-Net神经网络柱孢藻毒素

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光学相干层析显微成像的技术与应用

中国激光 2020年第2期47卷 56-72页

作者：韩涛邱建榕王迪孟佳刘智毅丁志华浙江大学光电科学与工程学院现代光学仪器国家重点实验室浙江杭州310027

光学相干层析显微成像(OCM)技术是一种使用相干探测的光学显微成像技术。OCM不仅具有光学相干层析成像技术(OCT)高轴向分辨、高信噪比、无需标记的优势,而且能通过高倍物镜获得高横向分辨能力,能实现微米量级的空间分辨率。首先介绍OCM... 详细信息

光学相干层析显微成像(OCM)技术是一种使用相干探测的光学显微成像技术。OCM不仅具有光学相干层析成像技术(OCT)高轴向分辨、高信噪比、无需标记的优势,而且能通过高倍物镜获得高横向分辨能力,能实现微米量级的空间分辨率。首先介绍OCM技术的基本原理和实现方案,然后详细阐述OCM技术的原理以及在国际上的研究进展。针对OCM技术中如何实现超高分辨成像、焦深限制成像深度等问题,对目前该研究领域一些先进的OCM技术进行总结。OCM技术在生物医学、材料检测等领域具有广泛的应用前景。

关键词：医用光学光学相干层析显微成像生物医学成像共聚焦显微成像超高分辨率深层组织成像

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光谱共焦显微成像技术与应用

激光与光电子学进展 2023年第12期60卷 1-19页

作者：邵谭彬杨克成夏珉郭文平华中科技大学光学与电子信息学院湖北武汉430074

光谱共焦显微成像(CCM)技术基于色差共焦原理,利用不同波长的焦点位置不同实现深度测量,并使用共聚焦设置滤除离焦光以及杂散光从而提高信噪比。首先,介绍CCM的基本原理以及不同扫描方案。然后,对CCM的发展历程进行梳理,并阐述CCM的国... 详细信息

光谱共焦显微成像(CCM)技术基于色差共焦原理,利用不同波长的焦点位置不同实现深度测量,并使用共聚焦设置滤除离焦光以及杂散光从而提高信噪比。首先,介绍CCM的基本原理以及不同扫描方案。然后,对CCM的发展历程进行梳理,并阐述CCM的国内外研究进展。针对光学设计、信号产生模型、光谱数据处理、减小串扰等关键问题,对相关的研究方案进行了总结。凭借无损检测、高分辨率、高信噪比、层析成像等诸多优势,CCM技术在生物医学、工业检测等领域得到广泛应用。

关键词：三维成像光谱共焦显微成像共聚焦显微成像超高分辨率层析成像

两个α,β-不饱和酮药物的合成及抗肿瘤活性研究

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分析测试学报 2015年第8期34卷 900-904页

作者：刘文帅陈琴孙居锋王春华赵峰侯桂革滨州医学院药学院山东烟台264003

以3-吡啶甲醛与环己酮或N-甲基-4-哌啶酮进行Claisen-Schmidt缩合反应,经柱层析纯化得到2,6-二(3-吡啶亚甲基)-1-环己酮(L1)和3,5-二(3-吡啶亚甲基)-4-哌啶酮(L2),并通过核磁共振(1H NMR)、傅立叶变换红外光谱(FTIR)、元素分析等进行结... 详细信息

以3-吡啶甲醛与环己酮或N-甲基-4-哌啶酮进行Claisen-Schmidt缩合反应,经柱层析纯化得到2,6-二(3-吡啶亚甲基)-1-环己酮(L1)和3,5-二(3-吡啶亚甲基)-4-哌啶酮(L2),并通过核磁共振(1H NMR)、傅立叶变换红外光谱(FTIR)、元素分析等进行结构表征。采用CCK-8法评价其对A549(肺癌细胞)、He PG2(肝癌细胞)、MCF-7(乳腺癌细胞)、SGC-7901(胃癌细胞)、OVCA-433(卵巢癌细胞)等细胞系的抗肿瘤活性以及对HUVEC(脐静脉内皮细胞)的细胞毒性。结果显示,L1对SGC-7901和He PG2,L2对A549,SGC-7901,OVCA-433和He PG2均有较好的抑制活性,其半抑制率IC50均小于10μmol/L,但对正常细胞HUVEC的毒性较小。另外,通过共聚焦显微成像技术,实时检测了He PG2肿瘤细胞和正常细胞HUVEC对L2的体外摄取情况,随着药物浓度的增大和作用时间的延长,肿瘤细胞中的荧光强度不断增强,说明肿瘤细胞对药物的摄取量明显增加;但在正常细胞中,细胞的药物量变化不明显,说明药物对正常细胞具有一定的选择性。

关键词： α,β-不饱和酮哌啶酮抗肿瘤细胞毒性共聚焦显微成像细胞摄取

双吡啶α,β-不饱和酮抗肿瘤药物的细胞摄取研究

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化学试剂 2015年第11期37卷 985-988页

作者：刘文帅孙居锋王春华侯桂革滨州医学院药学院山东烟台264003

以4-吡啶甲醛与环己酮或N-甲基-4-哌啶酮通过Claisen-Schmidt缩合得到两个吡啶取代的α,β-不饱和酮药物,并通过1HNMR、FT-IR、元素分析等表征其结构。CCK-8法评价其对A549、MCF-7、He PG2、SGC-7901、OVCA-433等肿瘤细胞系的抗肿瘤活... 详细信息

以4-吡啶甲醛与环己酮或N-甲基-4-哌啶酮通过Claisen-Schmidt缩合得到两个吡啶取代的α,β-不饱和酮药物,并通过1HNMR、FT-IR、元素分析等表征其结构。CCK-8法评价其对A549、MCF-7、He PG2、SGC-7901、OVCA-433等肿瘤细胞系的抗肿瘤活性及对正常细胞HUVEC的细胞毒性。研究显示,2,6-二(4-吡啶亚甲基)-1-环己酮对胃癌SGC7901和肝癌He PG2,药物3,5-二(4-吡啶亚甲基)-4-哌啶酮对A549、SGC7901、He PG2均有较好的抑制活性,其中IC50共聚焦显微成像技术,实时检测了He PG2细胞对两种药物体外的摄取情况,随着药物浓度的升高和作用时间的不断延长,荧光强度也不断增强,说明细胞对药物的摄取量与时间和浓度呈正相关关系。

关键词： α,β-不饱和酮抗肿瘤细胞毒性共聚焦显微成像细胞摄取

细胞内自由基检测的新型荧光探针的设计合成及应用

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细胞内自由基检测的新型荧光探针的设计合成及应用

作者：夏雁青山东师范大学

学位级别：硕士

在生命有机体的新陈代谢活动中，各种活性物质如活性氧、活性氮、活性氯分子以及各种小分子代谢物等参与能量传递和信号转导，对细胞的生理病理过程起着重要调节作用。有机体通过调节硫醇类物质和活性氧自由基的含量，维持内部氧化还原... 详细信息

在生命有机体的新陈代谢活动中，各种活性物质如活性氧、活性氮、活性氯分子以及各种小分子代谢物等参与能量传递和信号转导，对细胞的生理病理过程起着重要调节作用。有机体通过调节硫醇类物质和活性氧自由基的含量，维持内部氧化还原状态的相对稳定，避免氧化损伤、氧化应激和还原应激的发生。因此，对细胞内各种氧化性物质(如活性氧)所介导的氧化还原循环的研究具有重要的生物学意义。次氯酸(HOCl)是生物体内一种重要的活性分子。通常在髓过氧化物酶(MPO)的催化作用下，H2O2与Cl-发生反应而产生HOCl。HOCl被认为是一种具有自然抗菌能力的亲核性非自由基氧化剂，对细胞的生理功能有着重要影响。虽然基于荧光探针的荧光分析法已经用于细胞内HOCl的检测研究，但是目前尚无可以对HOCl进行可逆响应的荧光探针，由此从一定程度上限制了对HOCl参与的细胞内氧化还原循环的深入研究。过氧亚硝基阴离子(ONOO)是生物有机体内一种极其重要的活性氧自由基。细胞内ONOO是由O·和NO反应产生。ONOO是一把双刃剑，它对有机体生物功能的影响既有有益的一面，也有不利的一面。利用荧光探针对ONOO进行检测和识别已取得了较大进展。现已报道的对ONOO有选择性响应的荧光探针中，能够实现专一可逆应答的还很少。所以设计一种对ONOO具有专一可逆荧光响应的有机小分子荧光探针，对于研究细胞内ONOO的生成、代谢及其相关的生理、病理机制具有重要意义。本论文基于可逆小分子荧光探针的设计合成及其细胞成像分析，开展了以下两部分研究： (一)用于可逆检测HOCl的新型荧光探针的设计合成及细胞成像研究氟硼二吡咯(BODIPY)是一种常见的荧光染料，在荧光探针研究中一般被作为探针母体，通过偶联识别基团构建探针。实验中我们发现其分子结构中的C=N双键可被NaS2O还原生成C-N单键，得到氢化产物。这种氢化产物能够选择性地被HOCl氧化，伴随荧光恢复，而此过程可以反复进行。在模拟生理条件下，我们以Br-BODIPY母体为荧光探针，实现了对NaS2O和HOCl的可逆荧光应答。探针选择性和光稳定性均令人满意。以小鼠巨噬细胞(Raw 264.7)和HL-60细胞为生物模型，利用探针对HOCl的选择性可逆响应，实现了细胞内多个氧化还原循环的荧光成像。 (二)用于检测ONOO的新型近红外荧光探针的设计合成及细胞成像研究以近红外荧光染料***为母体，利用和硒同族的硫(S)的抗氧化性设计合成了一种新型近红外可逆有机小分子荧光探针。该探针对ONOO具有高效专一识别特性。在模拟生理条件下实现了探针对ONOO /GSH的可逆荧光应答。以小鼠巨噬细胞(Raw 264.7)为生物模型，实现了细胞内ONOO的可逆氧化还原循环荧光成像检测。

关键词：荧光探针次氯酸过氧亚硝基阴离子氧化还原循环可逆检测共聚焦显微成像

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基于共聚焦成像的表面形貌测量技术研究

基于共聚焦成像的表面形貌测量技术研究

作者：翁祖昕南昌大学

学位级别：硕士

表面形貌是评价物体表面质量的重要因素,表面粗糙度是表现表面形貌的重要参数,表面粗糙度的检测广泛用于工业零部件的加工制造过程中。现有粗糙度测量方法主要有纳米表面粗糙度分析法、触针式测量法和白光干涉法等,但存在测量环境要求... 详细信息

表面形貌是评价物体表面质量的重要因素,表面粗糙度是表现表面形貌的重要参数,表面粗糙度的检测广泛用于工业零部件的加工制造过程中。现有粗糙度测量方法主要有纳米表面粗糙度分析法、触针式测量法和白光干涉法等,但存在测量环境要求高或者易划伤物体表面等缺陷。共聚焦显微成像粗糙度测量法能够测量表面局部斜率较高的零件,且属于非接触式测量法,在高精度零件表面质量评价中有重要应用。本文研究了基于共聚焦成像的表面形貌测量技术,以期为研制国产表面测量共聚焦显微镜提供理论指导。主要内容如下:(1)针对共聚焦显微成像技术,分析其成像原理和扫描方式,并对其三维层析能力进行深入探究,用Ra=1.6μm的刨床样本进行共聚焦成像,验证了共聚焦三维层析能力。在此基础上提出了三维重建算法,将共聚焦成像系统拍摄得到的序列图片进行三维重建,恢复了物体的轮廓;并对Mitutoyo 178-601高精度粗糙度样本和标定高度差的透明样本进行实验,对三维重建算法进行定性和定量验证,实验中重建出的透明样本高度差与标称值平均相对误差为3.11%,验证了三维重建算法的可行性,为下一步绘制粗糙度轮廓做了准备。(2)物体的表面形貌含有多种轮廓成分,包括粗糙度轮廓、波纹度轮廓和形状轮廓。为了从原始轮廓中提取出粗糙度轮廓,对滤波器的种类和功能进行分析,建立了高斯滤波提取粗糙度轮廓的数学模型,探究了数学模型中截止波长的选取方法。计算仿真表明,该粗糙度轮廓提取模型可以成功提取出物体的粗糙度轮廓。(3)由于高斯滤波器的边界效应,得到的粗糙度轮廓左右两端各丢失了一段数据,需要采用修正边界区域算法对边界区域进行修正。为适应整体轮廓陡峭程度不同的表面,提出了一种普适修正边界区域算法。仿真表明普适修正边界区域算法对陡峭轮廓有较好修正效果。对于整体轮廓较为平缓的物体,实验表明常规的边界轮廓延伸法与边界区域修正法的效果相近。而对于整体较为陡峭的物体,常规的边界轮廓延伸法与边界区域修正算法的相对误差分别为0.31%和3.48%,表明本文的边界区域算法对各种轮廓有较好的适应性。(4)为了验证本文提出的基于共聚焦成像的表面测量技术,对16个实验样本用共聚焦成像系统进行成像,计算出各样本的粗糙度参数Ra值,并与基恩士公司VHX-6000超景深显微测量系统测得的值进行了比较,两者的平均相对误差值均在5%以内,表明本文基于共聚焦成像的表面测量技术具有较高的准确度。(5)编写了表面粗糙度测量软件,成功实现了导入共聚焦序列图片,可得到样本的全焦图和三维轮廓图,以及指定直线区域的二维轮廓和粗糙度参数Ra值,可用于指导表面测量共聚焦显微镜的研制。

关键词：表面形貌测量共聚焦显微成像三维图像重建修正边界区域

基于NBD母体荧光探针的设计合成及其在细胞和活体内的应用研究

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基于NBD母体荧光探针的设计合成及其在细胞和活体内的应用研究

作者：付强青海师范大学

学位级别：硕士

生物体内存在各种各样的内源性活性物种以及潜在的肿瘤标志物。这些物质的种类及含量在正常细胞与非正常细胞内是存在差异的。近年来,学术界开发了诸多生物检测技术。然而,鉴于生物体内环境存在多样性与复杂性,导致检测结果准确性低、... 详细信息

生物体内存在各种各样的内源性活性物种以及潜在的肿瘤标志物。这些物质的种类及含量在正常细胞与非正常细胞内是存在差异的。近年来,学术界开发了诸多生物检测技术。然而,鉴于生物体内环境存在多样性与复杂性,导致检测结果准确性低、选择性差。因此,我们发现仍有必要去开发选择性好、灵敏度高准确性高的分析方法。荧光探针可以选择性地将分析对象的化学信息连续地转变为分析仪器易测量的荧光信号。当周围环境变化时,荧光分子探针的发射波长及强度会发生改变,从而将反映出环境的特征或环境中存在的某种特定信息。借助这些光学信息,可实现对生物体内待测物的高灵敏、选择性可视化分析。作为荧光探针中重要组成部分,有机小分子荧光探针具有设计性强、选择性高、准确性好、响应迅速等优点,在细胞及动物活体检测中发挥着越来越重要的作用。本论文从小分子荧光探针的设计合成及生物应用两个方面出发,以NBD-Cl作为母体荧光基团,设计合成了多个探针,并分别用于检测和监控细胞内的信号分子和肿瘤标志物等。具体工作如下:第一章:绪论简单介绍了一下荧光探针的应用进展、选题意义与主要研究内容第二章:讲述用于检测酮戊二酸的小分子探针的设计合成及其生物体内的实际应用。α-酮戊二酸(α-KA)的检测通常存在低的灵敏度,不可见的颜色变化和易与表面活性剂发生复合的缺点,这就限制了对于生物样品中α-KA的准确性,高灵敏的定性和定量检测。与常规的传感机制不同,我们设计出一种结合吸收红移(不是发射)的光诱导电子转移(PET)的特殊机制,并设计了同时用于生物样品中α-KA荧光检测,吸收比率和比色检测的简单而多功能的探针。无需任何表面活性剂,PET的有效抑制确保了探针强的荧光开启(60倍)和低的检出限(0.9mM)。紫外区域大的吸收红移(100 nm)所引起的明显颜色变化使得能够通过肉眼进行α-KA的比色分析。同时,这种大的吸收红移也有助于比率检测,从而准确定量复杂生物样品中的α-KA。用这种探针,我们首次实现了血清,活细胞和组织样品中α-KA的比率检测,肉眼监测以及成像。第三章:讲述用于检测氧化应激(ClO-和HS)的小分子探针的设计合成及其生物体内的实际应用。ClO-/HS稳态在胃组织的损伤和修复中起着关键的作用,但是由于在高酸性胃环境中进行原位分析的挑战,对于这种稳态的研究很少。这里,我们设计了一种新的包括可控的光诱导电荷转移(PET)和电荷推挽开关的H+激活光学机制,开发了简单而多功能的探针(Z)-4-(2-亚苄基肼基)-7-硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑(BNBD)。首先,探针BNBD(关)被高酸性介质质子化以触发强的荧光(开)。然后,ClO-或者HS分析物与质子化的BNBD反应,导致分别由C=N的快速氧化(50 S)和硝基还原而产生的超灵敏(ClO-:2.7 n M;HS:6.9 nM)的荧光猝灭。通过吸光度/颜色的逻辑鉴别(ClO-:300nm/无色;HS:400 nm/橙色)开发了用于原位定量检测胃粘膜与中ClO-/HS的方法。首次实现了内源性HS,ClO-/HS稳态及胃粘膜病理学的原位定量检测,克服了高酸性条件下ClO-/HS分析的挑战并实现了ClO-/HS的原位组织定量分析。与粘膜损伤评估相结合,这项工作证实了ClO-/HS对胃粘膜(50-90mm深处)的损伤/修复作用,这可能有助于辅助诊断由氧化应激引起的胃病。第四章:讲述了用于检测pH的小分子探针的设计合成及其生物体内的实际应用。细胞可以在非常精确的范围内控制其pH变化。pH在细胞自噬和凋亡中起重要作用。有证据表明肿瘤的内部环境是被酸化了的。虽然细胞中的酸化已被研究,但复杂细胞内环境下多种刺激因子的生物学效应尚未被完全阐明。到目前为止,只有很少的pH探针有宽的检测范围,这就迫切需要开发一种宽范围pH探针。在这里,我们设计了一种新的荧光探针(CM-BHNBD)用于线粒体和粘膜内酸化的实时检测。探针通过H+驱动的PET-TICT(光诱导的电子转移-扭转分子内电荷转移)机制对pH进行响应,并且可以线性地响应pH在宽的酸度单位中的变化:7.00-2.00伴随有140倍的荧光增强。该探针还具有优异的膜通透性,良好的光稳定性和可忽略的细胞毒性。探针成功应用于量化HeLa细胞中营养物质剥夺和氧化应激同时刺激下的酸化。我们的研究结果表明线粒体pH在酸化过程中处于动态波动状态,这表明了细胞自噬和凋亡之间存在潜在的串扰效应。我们还使用该探针通过操纵细胞质子泵来量化胃和食道的粘膜内pH变化。我们的探针有望被用于监测生物医学研究的细胞内/粘膜内的酸化。第五章:总结与展望

关键词：荧光探针共聚焦显微成像肿瘤标志物氧化应激氢离子