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细胞共培养技术的研究进展

中国药理学与毒理学杂志 2011年第3期25卷 330-332页

作者：张茜金若敏上海中医药大学药物安全评价研究中心上海201203

目前,两种细胞之间的共培养方法包括直接共培养和间接共培养,而共培养体系主要用于诱导细胞向另一种细胞分化、诱导细胞自身的分化、维持细胞的功能和活力、对细胞增殖进行调控、促进早期胚胎的发育和提高代谢物的产量。目前细胞共培养... 详细信息

目前,两种细胞之间的共培养方法包括直接共培养和间接共培养,而共培养体系主要用于诱导细胞向另一种细胞分化、诱导细胞自身的分化、维持细胞的功能和活力、对细胞增殖进行调控、促进早期胚胎的发育和提高代谢物的产量。目前细胞共培养体系主要用于药效方面的研究,而用于毒理学方面的研究却很少。但是,由于共培养体系缩短实验次数、减少药物使用量、辨别药物的优先毒性靶器官和研究药物代谢产物的毒性作用等优点,使之成为未来细胞毒理学研究发展的方向之一。本文就细胞共培养技术的方法进行综述,并对共培养体系研究的应用进行了概述。

关键词：细胞共同培养技术药物利用评审

人真皮间充质干细胞对增生性瘢痕成纤维细胞α-SMA和DCN表达的影响

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中华整形外科杂志 2016年第4期32卷 285-292页

作者：张文夺邓呈亮郭常敏聂开瑜唐修俊魏在荣王达利遵义医学院附属医院烧伤整形外科 563003

目的初步探讨人真皮间充质干细胞（human dermis derived mesenchymal stem cells, hDMSCs）对不同时期增生性瘢痕成纤维细胞（HSFB） α-平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin,α-SMA）和核心蛋白多糖（decorin,DCN）表达的影响,... 详细信息

目的初步探讨人真皮间充质干细胞（human dermis derived mesenchymal stem cells, hDMSCs）对不同时期增生性瘢痕成纤维细胞（HSFB） α-平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin,α-SMA）和核心蛋白多糖（decorin,DCN）表达的影响,以探讨间充质干细胞用于增生性瘢痕防治的可行性.方法机械法联合酶消化法分离、培养hDMSCs,取第3代生长良好的细胞,以流式细胞仪检测hDMSCs的CD分子,免疫细胞化学检测角蛋白19和波形蛋白,向成脂、成软骨和成骨细胞诱导分化.根据临床上增生性瘢痕形成的病程将瘢痕标本分为6个月、1年、2年3组,每组3例.将3组HSFB分别与第3代生长良好的贴壁hDMSCs通过非接触式Transwell共培养体系培养21 d,并分别与相对应组HSFB普通6孔板培养21d进行对照,采用RT-PCR和Western Blot技术检测3组共培养后HSFB α-SMA和DCN的mRNA和蛋白的表达情况.结果 hDMSCs高表达CD73、CD105、CD44、CD90等间充质干细胞表面标志,不表达CD14、CD34、CD45等造血干细胞表面标志,波形蛋白阳性表达,不表达角蛋白19.经诱导可以向成脂、成软骨和成骨细胞分化,符合间充质干细胞的最低鉴定标准.普通6孔板培养的6个月、1年、2年3组HSFB的α-SMA mRNA及蛋白的表达量分别为198.20±15.46、0.29±0.070,175.24±17.04、0.38 ±0.110,125.73 ±6.99、0.33±0.085：DCNmRNA及蛋白的表达量分别为61.30 ±9.79、0.015 ±0.003,70.89±11.29、0.020±0.007,77.31±4.80、0.023±0.003.与5＆#215;104 hDMSCs共培养处理后6个月、1年、2年3组HSFB0α-SMA mRNA及蛋白的表达量分别48.40±6.42、0.100±0.020,192.16±11.37、0.110±0.014,73.33 ±6.29、***0±0.016;DCN mRNA及蛋白的表达量分别为156.92±14.91、0.049±0.015,154.42±18.17、0.033±0.008,140.82±7.32、0.030±0.004.与普通6孔板培养相比较,共培养各组HSFB的α-SMA mRNA及蛋白表达下调,DCN mRNA及蛋白表达上调,并以增生性瘢痕形成早期即6个月组变化较明显.结论 hDMSCs在体外培养体系中可下调HSFB α-SMA mRNA和蛋白的表达、上调DCN mRNA和蛋白的表达,并且对增生性瘢痕形成早期的成纤维细胞作用较明显,hDMSCs的抗纤维化作用有望用于提高创面愈合质量和病理性瘢痕的防治.

关键词：真皮间质干细胞瘢痕成纤维细胞共同培养技术

体外间充质干细胞对甲状旁腺细胞原代培养及分泌功能的干预作用研究

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中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2022年第2期57卷 185-190页

作者：张洋高文郭伟黄俊伟钟琦黄志刚首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室北京100730

目的寻找不同比例脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)对甲状旁腺细胞增殖能力及甲状旁腺激素(PTH)分泌功能变化的影响及规律。方法无菌条件下获取10只SD大鼠两侧甲状旁腺及腹股沟脂肪,经过消化分离分别... 详细信息

目的寻找不同比例脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)对甲状旁腺细胞增殖能力及甲状旁腺激素(PTH)分泌功能变化的影响及规律。方法无菌条件下获取10只SD大鼠两侧甲状旁腺及腹股沟脂肪,经过消化分离分别获取甲状旁腺细胞和ADMSCs进行体外培养,采用流式检测方法对P3代ADMSCs表型进行检测。按照甲状旁腺细胞与ADMSCs比例为2∶1、1∶1、1∶2和1∶5进行共培养,观察不同共培养比例下两种细胞的生长状态,并取细胞上清进行PTH含量的测定。测定结果与对应数量单独培养的甲状旁腺细胞上清中PTH进行对比,利用细胞形态学和PTH检测结果综合判断ADMSCs对甲状旁腺细胞PTH分泌功能的影响。采用SPSS 11.0软件进行统计学分析。结果可较稳定地完成体外单独甲状旁腺细胞与ADMSCs原代培养,且两种细胞不同比例的体外共培养显示出对PTH分泌的不同影响,其中甲状旁腺细胞与ADMSCs比例为1∶5时体现出较强的促PTH分泌作用,高于单独甲状旁腺细胞培养,其PTH含量在第2、4、6、8天分别为[(1.3±0.0)比(0.8±0.1)、(1.3±0.0)比(0.9±0.0)、(1.7±0.5)比(0.9±0.0)、(1.7±0.0)比(1.2±0.2)]ng/L,差异有统计学意义(t值分别为25.46、64.30、3.32、7.16,P值均培养具有可行性,且1∶5细胞比例下PTH分泌效果有着更显著的影响。

关键词：间充质干细胞甲状旁腺甲状旁腺激素共同培养技术

非诺贝特对凝胶包埋培养的原代大鼠肝细胞的毒性

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中国药理学与毒理学杂志 2011年第5期25卷 463-468页

作者：周喆鲁燕华孟琴浙江大学化学工程与生物工程学系浙江杭州310027

目的研究非诺贝特对凝胶包埋培养的原代大鼠肝细胞内氧化压力和脂质含量的影响。方法将收获得到的新鲜原代大鼠肝细胞进行胶原凝胶包埋,构建肝细胞体外凝胶包埋培养模型,同时构建传统平板模型作为对照。在肝细胞培养过程中加入非诺贝特2... 详细信息

目的研究非诺贝特对凝胶包埋培养的原代大鼠肝细胞内氧化压力和脂质含量的影响。方法将收获得到的新鲜原代大鼠肝细胞进行胶原凝胶包埋,构建肝细胞体外凝胶包埋培养模型,同时构建传统平板模型作为对照。在肝细胞培养过程中加入非诺贝特25和100μmol.L-1,分别于培养3和7 d后,检测细胞内活性氧类(ROS)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)含量,并用尼罗红和油红O对细胞内中性脂滴进行定量分析和染色观察。结果平板模型非诺贝特各组之间没有显著性差异,而凝胶包埋模型非诺贝特各组之间差异明显。对于凝胶包埋模型,非诺贝特25和100μmol.L-1均导致细胞内ROS增加,其中非诺贝特处理3 d组细胞内ROS分别为对照组的(131±19)%和(149±10)%,非诺贝特处理7 d组细胞内ROS分别为正常对照组的(121±8)%和(117±5)%(P培养原代大鼠肝细胞作为体外培养模型相对于平板模型能更好地反映非诺贝特的肝毒性作用。

关键词：非诺贝特共同培养技术肝毒性作用

CRISPR-Cas9诱导KRT5基因突变的HaCaT细胞对共培养人黑素细胞的影响研究

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中华皮肤科杂志 2022年第8期55卷 659-664页

作者：贾苇雪王建波罗玲玲张媛媛王雪郭右铭孔令卓姜祎群李诚让中国医学科学院、北京协和医学院皮肤病医院皮肤科南京210042 河南省人民医院皮肤科郑州450003 江苏省皮肤病与性病学重点实验室南京210042 中国医学科学院、北京协和医学院皮肤病医院病理科南京210042 郑州大学第一附属医院皮肤科郑州450000

目的探究敲减角质形成细胞KRT5基因对共培养黑素细胞黑素含量的影响,以解释屈侧网状色素沉着症(DDD)的色素增加性皮损形成的机制。方法通过成簇的规律间隔的短回文重复序列-相关蛋白9(CRISPR-Cas9)技术获得KRT5基因杂合突变的HaCaT细胞... 详细信息

目的探究敲减角质形成细胞KRT5基因对共培养黑素细胞黑素含量的影响,以解释屈侧网状色素沉着症(DDD)的色素增加性皮损形成的机制。方法通过成簇的规律间隔的短回文重复序列-相关蛋白9(CRISPR-Cas9)技术获得KRT5基因杂合突变的HaCaT细胞,将转染非靶向单向导RNA:Cas9蛋白复合物的HaCaT细胞设为对照组,分别与人原代黑素细胞HEMn体外共培养。免疫荧光观察共培养细胞中细胞角蛋白及黑素小体表达;差异胰酶消化获得不同共培养组中黑素细胞,检测细胞内黑素含量。免疫组化检测1例KRT5突变DDD患者皮损和正常对照皮肤中黑素细胞特异性前黑素小体蛋白17(Pmel17)的表达改变。结果Sanger测序显示,实验组HaCaT细胞KRT5基因第1外显子起始密码子发生杂合突变(c.1delA),对照组HaCaT细胞KRT5基因未发生突变。Western印迹显示,实验组HaCaT细胞KRT5蛋白表达水平(0.60±0.05)显著低于对照组(1.00±0.00,t=32.38,P=0.001)。HEMn细胞与实验组HaCaT细胞共培养体系中Pmel17标记的黑素小体较与对照组共培养体系增多,且细胞内黑素含量增加52.5%,差异具有统计学意义(t=-3.48,P=0.025)。KRT5突变DDD患者皮损组织中Pmel17表达量较正常对照皮肤增加。结论本研究通过CRISPR-Cas9诱导KRT5基因突变的HaCaT细胞,与黑素细胞在体外建立共培养细胞模型,验证了其对共培养黑素细胞的影响,为进一步研究角质形成细胞与黑素细胞相互作用机制以及皮肤色素异常的发病机制提供了初级研究模型。

关键词：黑素细胞角蛋白细胞共同培养技术角蛋白5 生物,基因修饰色素沉着过多屈侧网状色素沉着症 CRISPR-Cas9

趋化因子Fractalkine协同M2型巨噬细胞对胰腺癌细胞株生物学功能的影响

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肿瘤 2019年第12期39卷 985-992,1010页

作者：刘惠娟谢娟黄李雅宁夏医科大学临床医学院宁夏银川750004 宁夏医科大学总医院消化内科宁夏银川750004

目的:探讨趋化因子Fractalkine(FKN)联合肿瘤相关M2型巨噬细胞对人胰腺癌PANC-1细胞增殖、侵袭和迁移等生物学功能的影响。方法:将含FKN基因序列的重组慢病毒HBLV-h-FKN-GFP-PURO感染人胰腺癌PANC-1细胞,同时用佛波酯及白细胞介素4序贯... 详细信息

目的:探讨趋化因子Fractalkine(FKN)联合肿瘤相关M2型巨噬细胞对人胰腺癌PANC-1细胞增殖、侵袭和迁移等生物学功能的影响。方法:将含FKN基因序列的重组慢病毒HBLV-h-FKN-GFP-PURO感染人胰腺癌PANC-1细胞,同时用佛波酯及白细胞介素4序贯诱导人白血病单核细胞THP-1成为M2型巨噬细胞,然后通过Transwell小室系统建立胰腺癌细胞与M2型巨噬细胞非接触式共培养模型。共培养后收集胰腺癌细胞,采用CCK-8法检测PANC-1细胞的增殖情况,Transwell小室法和划痕愈合实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力。结果:HBLV-h-FKN-GFP-PURO感染人胰腺癌细胞PANC-1后,FKN蛋白表达水平较未感染对照组和空病毒感染组明显升高(P值均培养M2型巨噬细胞的能力明显增强(P 培养后,PANC-1细胞的增殖、侵袭和迁移能力均更加显著地增强(P值均<0.01);依据析因设计资料的双向分组方差分析结果提示,FKN与M2型巨噬细胞之间存在交互作用(P增殖<0.01,P侵袭<0.01,P迁移<0.05)。结论:趋化因子FKN能促使人胰腺癌PANC-1细胞趋化募集M2型巨噬细胞。FKN和M2型巨噬细胞均可增强PANC-1细胞的增殖、侵袭和迁移能力,且二者之间具有交互协同作用。

关键词：胰腺肿瘤趋化因子Fractalkine M2型巨噬细胞共同培养技术

卵巢上皮性癌淋巴结高转移细胞和脐静脉内皮细胞交互和共同培养后细胞特征的变化

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中华妇产科杂志 2014年第7期49卷 510-516页

作者：卢迎新高婷陈艳华张新颖李力谢一泓李鸿阮和云黎丹戎广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科南宁530021

目的：探讨卵巢上皮性癌（卵巢癌）淋巴结高转移细胞和脐静脉内皮细胞体外交互和共同培养后细胞特征的变化。方法建立绿色荧光蛋白（GFP）标记的卵巢癌淋巴结高转移细胞株SKOV3/PM4细胞和细胞膜红色荧光染料DiI标记的人脐静脉内皮细胞株... 详细信息

目的：探讨卵巢上皮性癌（卵巢癌）淋巴结高转移细胞和脐静脉内皮细胞体外交互和共同培养后细胞特征的变化。方法建立绿色荧光蛋白（GFP）标记的卵巢癌淋巴结高转移细胞株SKOV3/PM4细胞和细胞膜红色荧光染料DiI标记的人脐静脉内皮细胞株HUVEC细胞，分别收集SKOV3/PM4、HUVEC细胞的培养上清液，作为交互培养的条件培养基（如以HUVEC细胞培养的上清液培养SKOV3/PM4细胞），建立两种细胞交互培养和共同培养体系。细胞交互培养后，光镜观察细胞形态的变化并计算细胞分裂指数，透射电镜观察细胞超微结构的变化，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞生长速度，流式细胞仪分析细胞周期比例；细胞共同培养后，激光共聚焦显微镜观察两种细胞间的相互作用情况，明胶酶谱法检测细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9的表达。结果细胞交互培养后，与单独培养的SKOV3/PM4细胞相比，交互培养的SKOV3/PM4细胞伪足增多，核分裂象[细胞分裂指数分别为（4.8±0.8）%、（11.2±0.3）%；P〈0.05]增多，生长速度明显增快，G0/G1期细胞比例[分别为（69.4±3.6）%、（48.4±4.6）%；P〈0.05]降低，G2/M期细胞比例[分别为（5.2±1.6）%、（24.9±2.2）%；P〈0.05]升高；与单独培养的HUVEC细胞相比，交互培养的HUVEC细胞形态改变明显，出现空泡化超微结构，核分裂象[细胞分裂指数分别为（2.7±0.5）%、（5.7±0.6）%；P〈0.05]增多，生长速度略降低，G0/G1期细胞比例[分别为（51.4±2.2）%、（79.0±4.1）%；P〈0.05]升高，G2/M期细胞比例[分别为（19.1±1.2）%、（3.3±0.5）%；P〈0.05]降低。细胞共同培养48 h后，激光共聚焦显微镜观察，绿色荧光标记的SKOV3/PM4细胞和红色荧光标记的HUVEC细胞出现融合现象；明胶酶谱法检测显示，MMP-2在HUVEC细胞中不表达，在SKOV3/PM4细胞中低表达，在共同培养的SKOV3/PM4＋HUVEC细胞中高表达，SKOV3/PM4＋HUVEC细胞、SKOV3/PM4细胞中MMP-2的灰度值分别为1885±84和1209±114，两者比较，差异有统计学意义（P〈0.05）；而MMP-9在HUVEC细胞、SKOV3/PM4细胞、SKOV3/PM4＋HUVEC细胞均不表达。结论 SKOV3/PM4、HUVEC细胞交互培养、共同培养分别与单独培养相比，其细胞特征均发生明显改变，推测可能与细胞生长的微环境及细胞间相互作用有关。

关键词：卵巢肿瘤淋巴转移肿瘤细胞,培养的人脐静脉血管内皮细胞共同培养技术培养基,条件性

软骨细胞与脂肪基质细胞共培养体外构建软骨的初步研究

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中华整形外科杂志 2012年第1期28卷 49-54页

作者：吕晓杰周广东刘霞刘凯刘虎仙陈俊男曹谊林中国人民解放军第二炮兵总医院烧伤整形科北京100088 上海交通大学医学院附属第九人民医院中国医学科学院整形外科医院

目的探讨软骨细胞与脂肪基质细胞（adipose-derived stromal cells,ADSCs）共培养体外构建软骨的可行性,并阐明软骨细胞提供的软骨微环境能否诱导ADSCs向软骨细胞分化并形成软骨组织.方法分别培养扩增人ADSCs与猪耳软骨细胞,将2种细胞... 详细信息

目的探讨软骨细胞与脂肪基质细胞（adipose-derived stromal cells,ADSCs）共培养体外构建软骨的可行性,并阐明软骨细胞提供的软骨微环境能否诱导ADSCs向软骨细胞分化并形成软骨组织.方法分别培养扩增人ADSCs与猪耳软骨细胞,将2种细胞按7：3（ADSCs：软骨细胞）比例混匀,以5.0×107/ml的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸（PGA/PLA,直径8 mm,高2 mm）支架作为共培养组,以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯ADSCs分别接种相同支架作为阳性对照组及阴性对照组,以30％上述浓度（1.5×107/ml）的单纯软骨细胞接种作为低浓度软骨细胞对照组.每组各接种6例标本,每例接种细胞悬液200μl.全部标本均于体外培养8周时取材,通过大体观察、组织学、免疫组化及湿重、蛋白多糖定量检测等方法对新生软骨进行初步评价.多样本t检验统计分析各组湿重及蛋白多糖含量差异.结果各组细胞均与材料粘附良好.共培养组及阳性对照组体外培养8周时基本保持了复合物初始大小和形状,大体观察2组均形成了较成熟软骨组织,组织学显示大量软骨基质和软骨陷窝形成,免疫组化显示软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原分泌.定量测定结果表明,共培养组的平均湿重为（174±12） mg,平均蛋白多糖含量为（7.6±0.4） mg,两者分别达到阳性对照组的75％（P＜ 0.01）和79％（P＜ 0.01）.阴性对照组（单纯ADSCs组）明显皱缩变形,组织学未见成熟软骨陷窝.低浓度软骨细胞组明显变薄,新生软骨平均湿重为（85 ±5） mg,是阳性对照组的37％（P＜ 0.01）,只在局部形成了不连续的软骨组织.结论软骨细胞与ADSCs共培养能够在体外构建较成熟的软骨组织,软骨细胞能够诱导ADSCs成软骨分化及体外形成软骨组织.

关键词：组织工程软骨细胞脂肪基质细胞共同培养技术

组蛋白乙酰化修饰在骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化中的作用

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解放军医学杂志 2019年第5期44卷 369-374页

作者：杨婧王延洲梁志清贵州省人民医院妇产科贵阳550001 陆军军医大学(原第三军医大学)西南医院妇产科重庆400038

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)在平滑肌微环境中发生分化后平滑肌标志性基因乙酰化水平的变化,以及组蛋白乙酰化修饰在干细胞分化中的作用及机制。方法体外培养BMSCs和膀胱平滑肌细胞(BSMCs),选择同批次的第3代BMSCs,将与BSMCs共培... 详细信息

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)在平滑肌微环境中发生分化后平滑肌标志性基因乙酰化水平的变化,以及组蛋白乙酰化修饰在干细胞分化中的作用及机制。方法体外培养BMSCs和膀胱平滑肌细胞(BSMCs),选择同批次的第3代BMSCs,将与BSMCs共培养3d的BMSCs作为实验组,未经共培养的BMSCs作为对照组,采用RT-PCR检测两组BMSCs中平滑肌α肌动蛋白(α-SMA)、钙调节蛋白(calponin)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)的表达丰度。采用条件为80%、20次、0.5 s、8个循环的超声破碎实验组及对照组BMSCs的DNA,以H3K9抗体结合特定乙酰化位点,采用免疫共沉淀技术(ChIP)沉淀BMSCs组蛋白乙酰化位点基因,接头PCR扩增所获基因,Real-time PCR检测所获基因中3种目的基因(α-SMA、Calponin、SM-MHC)的表达水平。结果 RT-PCR检测结果显示,实验组BMSCs中的平滑肌标志性基因(α-SMA、Calponin、SM-MHC)的mRNA表达水平较对照组明显增高[分别为0.176±0.003 vs. 0.070±0.002,0.079±0.002vs.0.051±0.003,0.091±0.004vs.0.034±0.001],差异均有统计学意义(P0.05)。结论在平滑肌微环境中,BSMCs特定位点H3K9乙酰化程度的增加可促进BMSCs向BSMCs的分化。

关键词：间充质干细胞膀胱平滑肌细胞共同培养技术乙酰化作用免疫共沉淀