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葡萄糖氧化酶的有机相共价固定化

生物工程学报 2012年第4期28卷 476-487页

作者：周涛朱雄军苏建华姚冬生刘大岭暨南大学生命科学技术学院微生物技术研究所广东广州510632 广东省生物工程药物重点实验室广东广州510632

将葡萄糖氧化酶(GOD)在最适pH条件下冻干后,以戊二醛活化的壳聚糖为载体,分别在传统水相和1,4-二氧六环、乙醚、乙醇三种不同的有机相中进行共价固定化。通过比较水相固定化酶和有机相固定化酶的酶比活力、酶学性质及酶动力学参数,考察... 详细信息

将葡萄糖氧化酶(GOD)在最适pH条件下冻干后,以戊二醛活化的壳聚糖为载体,分别在传统水相和1,4-二氧六环、乙醚、乙醇三种不同的有机相中进行共价固定化。通过比较水相固定化酶和有机相固定化酶的酶比活力、酶学性质及酶动力学参数,考察酶在有机相中的刚性特质对酶在共价固定化过程中保持酶活力的影响。结果表明,戊二醛浓度为0.1%、加酶量为80 mg/1 g载体、含水1.6%的1,4-二氧六环有机相固定化GOD与水相共价固定化GOD相比,酶比活力提高2.9倍,有效酶活回收率提高3倍;在连续使用7次后,1,4-二氧六环有机相固定化GOD的酶活力仍为相应水相固定化酶的3倍。在酶动力学参数方面,不论是表观米氏常数,最大反应速度还是转换数,1,4-二氧六环有机相固定化的GOD(Kmapp=5.63 mmol/L,Vmax=1.70μmol/(***),Kcat=0.304 s-1)都优于水相共价固定化GOD(Kmapp=7.33 mmol/L,Vmax=1.02μmol/(*** GOD),Kcat=0.221 s-1)。因此,相比于传统水相,GOD在合适的有机相中进行共价固定化可以获得具有更高酶活力和更优催化性质的固定化酶。该发现可能为酶蛋白在共价固定化时因构象改变而丢失生物活性的问题提供解决途径。

关键词：葡萄糖氧化酶共价固定化有机介质酶比活

拟青霉β-1,3(4)-葡聚糖酶同源建模及共价固定化

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食品科学 2013年第1期34卷 252-256页

作者：华承伟于江傲谢凤珍陈晓静河南科技学院生命科技学院河南新乡453003 河南科技学院新科学院河南新乡453003

采用同源建模的方法构建拟青霉β-1,3(4)-葡聚糖酶的三维结构。通过对其活性位点及表面氨基酸残基侧链的分析,利用氨基载体Sepabeads EC-HA共价固定化葡聚糖酶,优化固定化条件,比较固定化酶与游离酶的酶学参数。结果表明:m(酶粉):m(载体... 详细信息

采用同源建模的方法构建拟青霉β-1,3(4)-葡聚糖酶的三维结构。通过对其活性位点及表面氨基酸残基侧链的分析,利用氨基载体Sepabeads EC-HA共价固定化葡聚糖酶,优化固定化条件,比较固定化酶与游离酶的酶学参数。结果表明:m(酶粉):m(载体)=1.2:1、温度40～45℃、固定化时间8h,固定化效果最好。蛋白结合率可达91.7%,酶活回收率达87.6%,固定化酶最适温度、热稳定性、pH值稳定性和批次使用稳定性均得到明显提高。

关键词： β-1,3(4)-葡聚糖酶同源建模共价固定化

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用有机相提高共价固定化胰蛋白酶活力

暨南大学学报（自然科学与医学版） 2012年第5期33卷 468-472,476页

作者：王旭曼苏建华朱雄军谢春芳刘大岭暨南大学生物工程系微生物技术研究所广东广州510632 广东省生物工程医药重点实验室广东广州510632

蛋白质共价固定时,容易发生由于共价化学反应而引起蛋白质构象的不可逆变化而造成蛋白活性丧失的现象,该问题在诸如药物修饰、蛋白质芯片、酶生物电极等制备中十分重要.本研究以壳聚糖为载体,以胰蛋白酶为研究对象,比较了水相与多种有... 详细信息

蛋白质共价固定时,容易发生由于共价化学反应而引起蛋白质构象的不可逆变化而造成蛋白活性丧失的现象,该问题在诸如药物修饰、蛋白质芯片、酶生物电极等制备中十分重要.本研究以壳聚糖为载体,以胰蛋白酶为研究对象,比较了水相与多种有机相条件下的共价固定化酶的动力学特性.结果发现,固定化酶特征常数Km值:所有的有机相条件下共价固定的胰蛋白酶均优于传统的水相中共价固定的该酶,且更接近于游离酶的Km值(水相中固定的胰蛋白酶其Km是1,4-二氧六环中固定的胰蛋白酶的3.69倍),提示有机相中固定的胰蛋白酶比水相中固定的该酶更接近于酶的天然构象;与水相中共价固定的胰蛋白酶相比,所有有机相中共价固定的胰蛋白酶均获得了更高的转换数Kcat(乙酸乙酯中固定的胰蛋白酶其转换数Kcat是水相中固定的该酶的58.64倍),即有机相中共价固定的胰蛋白酶均显示出比传统的水相中共价固定的该酶更高的催化效率.本研究表明,利用酶蛋白在有机相中变得刚硬的特性,在有机相中对某些酶进行共价固定化修饰有利于维持酶蛋白天然构象,一定程度上能够克服传统水相中进行共价固定化过程中造成的酶变性失活现象.

关键词：有机相共价固定化酶蛋白构象

Methylomonas Z201 细胞在戊二醛活化DEAE纤维素上的共价固定化

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分子催化 1997年第4期11卷 273-277页

作者：夏仕文尉迟力沈润南李树本中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室

以戊二醛活化的ＤＥＡＥ纤维素为载体，采用共价键法固定化ＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓＺ２０１细胞．固定化细胞催化丙烯环氧化的最优细胞／载体比为３２ｍｇ干重细胞／（ｇＤＥＡＥ纤维素），最适ｐＨ值和最适温度分别为７．８和３... 详细信息

以戊二醛活化的ＤＥＡＥ纤维素为载体，采用共价键法固定化ＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓＺ２０１细胞．固定化细胞催化丙烯环氧化的最优细胞／载体比为３２ｍｇ干重细胞／（ｇＤＥＡＥ纤维素），最适ｐＨ值和最适温度分别为７．８和３５℃．用纯氧代替空气作为氧源，分别使游离和固定化细胞的ＭＭＯ活性提高了８％和３５％．外源性电子给体甲酸钠对固定化细胞ＭＭＯ活性的激发作用小于游离细胞．失活动力学分析结果表明，固定化细胞的稳定性高于游离细胞．

关键词：甲烷单加氧酶共价固定化细胞固定化催化

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葡萄糖氧化酶的有机相共价固定化

葡萄糖氧化酶的有机相共价固定化

有机相中的共价固定化方法对酶蛋白构象影响的研究

第八届中国酶工程学术研讨会

作者：周涛朱雄军苏建华谢春芳刘大岭姚冬生暨南大学微生物技术研究所广东省生物工程药物重点实验室基因工程药物国家工程研究中心

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)属于氧化还原酶类(ECl.1.3.4),能专一行地将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢,广泛存在于动植物和微生物体内。该酶主要应用于食品卫生、饲料工业和生物医药等领域。酶是生物催化剂,固定化技术是... 详细信息

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)属于氧化还原酶类(ECl.1.3.4),能专一行地将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢,广泛存在于动植物和微生物体内。该酶主要应用于食品卫生、饲料工业和生物医药等领域。酶是生物催化剂,固定化技术是常用的提高酶稳定性的方法之一,共价固定化由于其使酶与载体结合牢固,不易造成酶的流失且具有良好的重复使用性而倍受关注。传统观点认为,酶只有在天然状态下,即只有在水中才是有活性的。但后来的许多研究表明多种酶在疏水有机溶剂中存在催化活性,且比水介质下的酶具有更高的稳定性,而且进一步的研究显示,为保持酶在有机相中的活性,一定量水的存在是必需的。人们尝试用酶构象的柔性理论去解释上述现象,认为酶悬浮在含微量水(含水量小于1%)的有机溶剂时,蛋白质分子内氢键起主导作用,使蛋白质变得"刚硬(rigidity)",活动的自由度变小,而有机溶剂中含有微量的水为酶的催化反应提供足够的构象柔性,使酶在行使其高效的催化活性时能维持正确的构象,进而发挥高效的催化活力。本文尝试利用蛋白质在有机溶剂中的"刚性"特点,在微水有机相中对蛋白质进行共价固定化,考察微水有机相环境能否一定程度地改善共价结合过程中,蛋白质因构象变化而失活的情况。我们将最适pH条件下冻干的葡萄糖氧化酶(GOD)分别转入1,4-二氧六环、乙醚、乙醇有机相和水相中,以戊二醛活化的壳聚糖微球为载体进行共价交联固定化。结果显示:在戊二醛浓度为0.1%、加酶量为80mg/1g载体、含水1.6%的1,4-二氧六环有机相中固定化葡萄糖氧化酶的酶活可达到水相中以相似条件共价固定化葡萄糖氧化酶活力的3.9倍;在pH5.5时,水相固定化酶比活力仅是1,4-二氧六环有机相固定化酶比活的20%;有机相固定化酶与水相固定氧化酶的最适反应pH值相近;60℃孵育30min后,乙醇有机相固定化酶的热稳定半衰期是水相固定化酶热稳定半衰期的1.34倍;从操作稳定性看,连续使用7次后,1,4-二氧六环有机相固定化酶残留相对酶活力仍可维持在60%以上,而水相固定化酶残留酶相对酶活力只有10%左右;1,4-二氧六环有机相固定化酶的有效酶活回收率达到88.37%,而水相固定化酶的有效酶活回收率只有22.71%;1,4-二氧六环固定化GOD的动力学参数:表观米氏常数、最大反应速率和转换数分别为K为5.63mmol/L、V为1.70μmol/min mg protein和K为0.304 S;优于水相固定化GOD的表观米氏常数、最大反应速率和转换数:K=7.33mmol/L、V=1.02μmol/min mg protein和K=0.221(S)。我们发现,在有机相中进行酶的共价固定化比在水相中进行更有利于葡萄糖氧化酶保持其活性,其中1,4-二氧六环有机相共价固定酶的优势较为明显。该发现有可能为解决酶蛋白在共价固定过程中因构象改变而丢失生物活性提供新途径。

关键词：葡萄糖氧化酶共价固定化有机相酶活力

来源： cnki会议评论

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有机相中的共价固定化方法对酶蛋白构象影响的研究

南极假丝酵母在纳米聚苯乙烯上的共价固载及其在微波辅助酯化反应中的应用（英文）

第八届中国酶工程学术研讨会

作者：王旭曼朱雄军姚冬生谢春芳刘大岭暨南大学微生物技术研究所广东省生物工程药物重点实验室基因工程药物国家工程研究中心

＜正＞酶作为一种高效的生物催化剂,在工业应用及商业生产上受到限制的最主要原因就是酶的不稳定性问题。共价固定化方法在提高酶稳定性的研究中占据着重要地位,由于该法主要利用的是酶和载体之间的共价作用,所得到的固定化酶与载体连... 详细信息

＜正＞酶作为一种高效的生物催化剂,在工业应用及商业生产上受到限制的最主要原因就是酶的不稳定性问题。共价固定化方法在提高酶稳定性的研究中占据着重要地位,由于该法主要利用的是酶和载体之间的共价作用,所得到的固定化酶与载体连接牢固,即使使用高底物浓度或离子强度高的溶液进行反应,也不会导致酶和载体分离,因而具有良好的稳定性及重复使用性,被广泛应用于生物医药、

关键词：有机相共价固定化酶蛋白构象

来源： cnki会议评论

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催化学报 2014年第9期35卷 1555-1564页

作者： Attaullah Bukhari Ani Idris Madiha Atta Teo Chee Loong Department of Bioprocess Engineering Faculty of Chemical Engineering c/o Institute of Bioproduct Development University Teknology Malaysia 81310 UTM Skudai Johor Malaysia

Nanopolystyrene was used as a solid support for the covalent immobilization of Candida antarctica lipase B(Cal B) using the photoreactive reagent 1‐fluoro‐2‐nitro‐4‐azido benzene(FNAB) as a cou‐pling reagent. The obtained derivative was then used as a biocatalyst in a microwave assisted ester‐ification experiment. Factors such as contact time, pH, and enzyme concentration were investigated during immobilization. The hydrolytic activity, thermal, and operational stability of immobi‐lized‐Cal B were determined. The maximum immobilized yield(218 μg/mg support) obtained at pH 6.8 exhibited optimum hydrolytic activity(4.42 × 103 mU p‐nitrophenol/min). The thermal stability of Cal B improved significantly when it was immobilized at pH 10, however, the immobilized yield was very low(93.6 μg/mg support). The immobilized‐Cal B prepared at pH 6.8 and pH 10 retained 50% of its initial activity after incubation periods of 14 and 16 h, respectively, at 60 °C. The opera‐tional stability was investigated for the microwave assisted esterification of oleic acid with metha‐nol. Immobilized‐Cal B retained 50% of its initial activity after 15 batch cycles in the micro‐wave‐assisted esterification. The esterification time was notably reduced under microwave irradia‐tion. The combined use of a biocatalyst and microwave heating is thus an alternative total green synthesis process.

关键词：共价固定化微波辅助酯化反应酵母脂肪酶南极对硝基苯酚生物催化剂运行稳定性

PGA在含环氧活性基的多孔高聚物载体上的固定化及修饰

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华东理工大学学报（自然科学版） 2007年第6期33卷 798-802页

作者：高克亮颜淑玮许伟钦魏东芝华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室鲁华生物技术研究所上海200237

研究了青霉素G酰化酶（PGA）在含环氧活性基的多孔高聚物载体上的固定化及修饰，优化固定化条件为1mol/L，pH8.0的磷酸钾缓冲体系，每克载体（湿重）投酶量为500～550U，30℃下150r/min固定化36～48h，得到的固定化酶表观酶活为每克载... 详细信息

研究了青霉素G酰化酶（PGA）在含环氧活性基的多孔高聚物载体上的固定化及修饰，优化固定化条件为1mol/L，pH8.0的磷酸钾缓冲体系，每克载体（湿重）投酶量为500～550U，30℃下150r/min固定化36～48h，得到的固定化酶表观酶活为每克载体（湿重）177U，表观酶活回收率35％。固定化酶经巯基乙醇修饰后提高了热稳定性。固定化酶水解青霉素G的最适pH为9.0，最适温度为47℃在pH4～9，40℃以下稳定。固定化酶的各项性能均优于游离酶。

关键词：青霉素G酰化酶共价固定化化学修饰环氧树脂

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多酶共固定化的研究进展

生物工程学报 2015年第4期31卷 469-480页

作者：王金丹张光亚华侨大学生物工程与技术系福建厦门361021

固定化酶技术是现代生物催化的核心技术。过去几十年里,固定化酶技术的研究主要集中在单酶固定化。近年来,多酶共固定化由于具有可增加反应的局部浓度、提高反应收率等优点而得到研究者的广泛关注。本文根据国内外研究现状并结合本实验... 详细信息

固定化酶技术是现代生物催化的核心技术。过去几十年里,固定化酶技术的研究主要集中在单酶固定化。近年来,多酶共固定化由于具有可增加反应的局部浓度、提高反应收率等优点而得到研究者的广泛关注。本文根据国内外研究现状并结合本实验研究从多酶非特异性共价共固定化、非特异性非共价共固定化、非共价包埋固定化以及位点特异性固定化四个方面阐述多酶固定化方法的研究进展,并分析和展望了其在工业上的应用前景。

关键词：多酶共固定化共价固定化非共价固定化包埋固定化特异性固定化