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作者：樊雅娇山西大学

学位级别：硕士

真核翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factors 5A,e IF5A)是细胞存活所必需的蛋白质,在翻译的起始、延伸和终止阶段发挥作用。e IF5A是真核细胞中目前已知的唯一含有羟腐胺赖氨酸化修饰(hypusination)的蛋白质,该翻... 详细信息

真核翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factors 5A,e IF5A)是细胞存活所必需的蛋白质,在翻译的起始、延伸和终止阶段发挥作用。e IF5A是真核细胞中目前已知的唯一含有羟腐胺赖氨酸化修饰(hypusination)的蛋白质,该翻译后修饰对e IF5A功能的发挥至关重要。e IF5A的羟腐胺赖氨酸化修饰以亚精胺为底物,由脱氧羟腐胺赖氨酸合酶(deoxyhypusine synthase,DHS)和脱氧羟腐胺赖氨酸羟化酶(deoxyhypusine hydroxylase,DOHH)催化完成。所有真核生物的修饰途径都是保守的,但古细菌表现出一定的特殊性,某些古细菌a IF5A发生羟腐胺赖氨酸化修饰,而某些古细菌a IF5A仅发生脱氧羟腐胺赖氨酸化修饰(deoxyhypusination)。八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)是一种单细胞真核生物,它具有独特的m RNA翻译方式,仅UAA和UAG作为终止密码子,而UGA可编码半胱氨酸,此外它还具有高频率的编程性核糖体移码(Programmed ribosomal frameshifting,PRF)现象。本课题组前期研究发现,在酿酒酵母中八肋游仆虫e IF5A不能发生羟腐胺赖氨酸化修饰,因此无法回补酿酒酵母e IF5A基因温度敏感突变株的生长。为了进一步探究八肋游仆虫e IF5A羟腐胺赖氨酸化修饰的途径及其在编程性核糖体移码中的作用,本研究对八肋游仆虫中DHS和DOHH基因进行了鉴定及生物信息学分析;将基因克隆后构建重组表达质粒,在大肠杆菌中进行表达纯化,利用western blot及高效液相色谱法对Eo-e IF5A的羟腐胺赖氨酸化修饰进行了检测;通过GC7处理细胞及RNAi两种方法抑制Eo-e IF5A的羟腐胺赖氨酸化修饰,检测该修饰对八肋游仆虫生长的影响。所得结果如下:1.八肋游仆虫DHS和DOHH基因的鉴定及生物信息学分析在八肋游仆虫大核基因组数据库中共鉴定到3个Eo-DHS基因和1个Eo-DOHH基因,说明八肋游仆虫中有完整的羟腐胺赖氨酸化修饰途径。序列分析表明,Eo-DHS1与Eo-DHS2和Eo-DHS3序列一致性较低,核苷酸序列一致性分别为65.5%和64.3%,氨基酸序列一致性分别为59.1%和59.7%;Eo-DHS2和Eo-DHS3序列一致性较高,核苷酸序列和氨基酸序列一致性分别为89.9%和94.6%。对不同物种DHS和DOHH的氨基酸序列分别构建系统进化树,发现所有游仆虫的DHS和DOHH分别聚为一枝,且DHS可分为DHS1和DHS2两个亚家族。随后对DHS和DOHH氨基酸序列分别进行多序列比对,发现三个Eo-DHS均具有保守的Lys催化位点以及与亚精胺、NAD结合的氨基酸残基;Eo-DOHH中存在4个保守的His-Glu基序。对Eo-DHS进行同源建模,得到Eo-DHS的四聚体结构。2.八肋游仆虫e IF5A羟腐胺赖氨酸化修饰的检测提取八肋游仆虫总蛋白,分别用anti-Eo-e IF5A抗体和anti-hypusine抗体进行western blot分析,结果在20-25 k Da之间得到特异性条带,说明八肋游仆虫e IF5A存在羟腐胺赖氨酸化修饰。通过PCR扩增得到Eo-e IF5A1、Eo-e IF5A2及Eo-DHS2基因,由于Eo-DHS1及Eo-DOHH基因含有读框内的TGA密码子,因此进行密码子优化并合成。将Eo-e IF5A1和Eo-e IF5A2分别连接到共表达质粒p ETDuet-1的第一个多克隆位点(multiple cloning site1,MCS1)处,将Eo-DHS1和Eo-DHS2分别连接到p ETDuet-1的第二个多克隆位点(MCS2)处,得到四个共表达重组质粒:p ETDuet-1-Eo-e IF5A1-DHS1、p ETDuet-1-Eo-e IF5A1-DHS2、p ETDuet-1-Eo-e IF5A2-DHS1及p ETDuet-1-Eo-e IF5A2-DHS2。同时将Eo-DOHH基因与共表达质粒p RSFDuet-1连接,得到重组表达质粒p RSFDuet-1-Eo-DOHH。随后将p RSFDuet-1-Eo-DOHH分别与四个p ETDuet-1重组表达质粒共同转化至*** BL21(DE3)中,同时诱导三个蛋白表达,用anti-hypusi ne抗体进行western blot检测Eo-e IF5A的修饰情况,结果表明当Eo-DHS1与Eo-D OHH及Eo-e IF5A同时表达时,Eo-e IF5A1和Eo-e IF5A2均被修饰,当Eo-DHS2与E o-DOHH及Eo-e IF5A同时表达时,Eo-e I

关键词：八肋游仆虫真核翻译起始因子5A 羟腐胺赖氨酸化修饰脱氧羟腐胺赖氨酸合酶脱氧羟腐胺赖氨酸羟化酶

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八肋游仆虫一种富含谷氨酸的蛋白GARP的表达与纯化

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高技术通讯 2007年第6期17卷 653-656页

作者：许静王伟柴宝峰梁爱华山西大学生物技术研究所、化学生物与分子工程教育部重点实验室太原030006

为研究游仆虫中含有三核苷酸重复序列的GARP基因编码的GARP蛋白在细胞中的功能,利用定点突变技术,将GARP基因中的TGA突变为通用半胱氨酸密码子TGT。突变后的GARP基因构建于原核表达载体pRSETc中,得到重组质粒pRSETc-GARP,将pRSETc-GARP... 详细信息

为研究游仆虫中含有三核苷酸重复序列的GARP基因编码的GARP蛋白在细胞中的功能,利用定点突变技术,将GARP基因中的TGA突变为通用半胱氨酸密码子TGT。突变后的GARP基因构建于原核表达载体pRSETc中,得到重组质粒pRSETc-GARP,将pRSETc-GARP质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导,带有纯化标签的重组蛋白His6-GARP获得可溶表达,表达产物与抗His抗体在约26 kDa处有很强的交叉反应。His6-GARP蛋白在不同pH条件下通过两次阴离子交换层析和一次凝胶层析三步纯化达到电泳纯。

关键词：八肋游仆虫富含谷氨酸的蛋白GARP 表达纯化

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八肋游仆虫Rab家族新成员Eo-rab-1 N基因的克隆与序列分析

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遗传 2006年第4期28卷 437-442页

作者：李凌燕柴宝峰梁爱华孙永华王伟山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室太原030006 中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室武汉430072

Rab蛋白家族属于小分子GTP结合蛋白家族Ras超家族中最大的亚家族，主要在囊泡运输中起作用。实验运用PCR、RT-PCR等技术，从八肋游仆虫中克隆到一种新的tab基因。序列分析结果表明：在大核中，该基因全长884bp，除去两端的端粒与非编码... 详细信息

Rab蛋白家族属于小分子GTP结合蛋白家族Ras超家族中最大的亚家族，主要在囊泡运输中起作用。实验运用PCR、RT-PCR等技术，从八肋游仆虫中克隆到一种新的tab基因。序列分析结果表明：在大核中，该基因全长884bp，除去两端的端粒与非编码区，该基因在大核中由723bp组成。从小核中克隆相应的基因片段，此基因片段序列与大核中序列一致，表明该基因在小核中无内部删除序列的存在。通过RT-PCR，从mRNA获得的该基因的开放读框为663bp，表明该基因在转录过程中有内含子的删除。大核基因序列和cDNA序列比较，发现60bp的内含子序列位于大核基因的153～212bp之间，并符合一类内含子GU-AG剪切规则。在遗传密码使用上，该基因内部含有2个TGA，在游仆虫中编码半胱氨酸。同时首次发现，八肋游仆虫基因使用TAG作为终止密码子。NCBI上序列比对表明该基因翻译的蛋白与其他物种Rabl蛋白的同源性达49％～52％，因此我们将它命名为Eo-rab-1N，GenBank登录号为DQl05562。Eo-rab-1N与其他物种的Rab1蛋白构建进化树，发现该蛋白的进化与物种的进化保持一致，表明该基因在细胞中具有重要功能。

关键词：八肋游仆虫 Eo—rab-1N基因基因克隆内含子

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八肋游仆虫微管蛋白基因家族的鉴定及进化分析

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水生生物学报 2021年第5期45卷 1005-1013页

作者：王软林肖羽李佳梁爱华山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室太原030006

为了系统分析八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)微管蛋白基因家族,从八肋游仆虫大核基因组中共鉴定得到20个微管蛋白基因,基于同源比对及系统进化分析,将其归入α、β、γ、δ、ε及η六个微管蛋白亚家族;多序列比对及Western blot结... 详细信息

为了系统分析八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)微管蛋白基因家族,从八肋游仆虫大核基因组中共鉴定得到20个微管蛋白基因,基于同源比对及系统进化分析,将其归入α、β、γ、δ、ε及η六个微管蛋白亚家族;多序列比对及Western blot结果显示八肋游仆虫η微管蛋白基因在翻译过程中需发生一次+1位编程性核糖体移码,其移码位点为AAA-TAA;所有自由生纤毛虫都含有多个α和β微管蛋白基因亚型,可能用于组成不同的微管结构。研究为后续深入探讨八肋游仆虫微管蛋白的生物学功能及微管多样性奠定了基础。

关键词：八肋游仆虫微管蛋白序列分析系统进化分析

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八肋游仆虫中无义介导的mRNA降解途径因子的细胞共定位研究

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中国生物化学与分子生物学报 2020年第6期36卷 646-655页

作者：周宝春王软林柴宝峰化学生物学与分子工程教育部重点实验室山西大学生物技术研究所太原030006

无义介导的mRNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)是一种mRNA质量监控机制,识别和降解含有提前终止密码子(premature termination codons, PTCs)的异常转录本,以保障基因的准确表达。到目前为止,有报道的从高等哺乳动物到果... 详细信息

无义介导的mRNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)是一种mRNA质量监控机制,识别和降解含有提前终止密码子(premature termination codons, PTCs)的异常转录本,以保障基因的准确表达。到目前为止,有报道的从高等哺乳动物到果蝇、线虫、酵母和原生动物中,均有NMD调控途径,但其机制模型存在一定的差异。由于原生动物在生物的起源与进化上的特殊地位,以及所含的调控因子相对简单,在各种分子机制的研究领域成为热点材料。本文以八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)作为研究对象,从八肋游仆虫大核基因组数据库中,经过同源序列比对,分析鉴定到参与NMD途径的相关因子,包括无义mRNA识别因子poly(A)结合蛋白(poly(A) binding protein, PABP);启动NMD途径的核心因子上游移码蛋白1(up-frameshift 1, UPF1)和上游移码蛋白2(up-frameshift 2, UPF2);外显子连接复合体(exon junction complex, EJC)组分因子MAGO(Mago nashi)、Y14(Tsunagi或RMB8)、eIF4AIII(eukaryotic initiation factor 4A3)和UAP56(U2AF56 associated protein 56);降解无义mRNA的相关因子外切体(exosome)、脱帽酶(decapping mRNA 2, DCP2)、外切酶(5′-3′exoribonuclease 1, XRN1)和去腺苷酸化酶(PGK promoter directed over production, POP2)。其中,后3种蛋白质是mRNA加工小体(processing body, P-Body)的组分。通过荧光共定位分析,分别依次证实UPF1与UPF2之间、EJC组分因子之间和P-body组分因子之间的相互作用关系。随后,通过UPF2分别与MAGO和Y14的荧光共定位结果,推测八肋游仆虫依赖于EJC的NMD途径模型。通过UPF1分别与DCP2和外切体(exosome)的荧光共定位结果,推测了八肋游仆虫无义mRNA的两种降解方式:一种是无义mRNA被介导到P-body中分别被DCP2和POP2脱去5′端帽和3′端Poly(A)尾,随后在XRN1的作用下,沿着5′→3′的方向降解;另一种是在胞质中,无义mRNA直接通过招募POP2去腺苷酸化,随后又在招募来的外切体作用下,沿着3′→5′的方向降解。

关键词：八肋游仆虫无义介导的mRNA降解途径外切体加工小体外显子连接复合体

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八肋游仆虫一种富含三核苷酸重复序列的新基因GARP的克隆与序列分析

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遗传 2007年第1期29卷 87-91页

作者：许静王伟柴宝峰梁爱华山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室太原030006

人类基因中三核苷酸重复序列拷贝数的异常扩增,可导致多种神经系统疾病。一种富含GAA三核苷酸的GARP(glutamicacid-richprotein)基因从八肋游仆虫(Euplotesoctocarinatus)大核文库中筛选获得。大核中该基因的染色体全长460bp,基因两端... 详细信息

人类基因中三核苷酸重复序列拷贝数的异常扩增,可导致多种神经系统疾病。一种富含GAA三核苷酸的GARP(glutamicacid-richprotein)基因从八肋游仆虫(Euplotesoctocarinatus)大核文库中筛选获得。大核中该基因的染色体全长460bp,基因两端具有下毛类纤毛虫大核特有的端粒序列(C4A4C4A4C4A4C4),开放读框内含有一个TGA(88-90)密码子,在游仆虫中编码为半胱氨酸。经DNAStar软件分析,该基因编码的蛋白质由112个氨基酸组成,预测其分子量为13kDa,等电点为3.82,含有四个α螺旋和一个β折叠。小核中对应的该基因含有两个内部删除序列,IES1和IES2。IES1和IES2分别长41bp,IES1以GA二核苷酸直接重复为删除信号,IES2以TA二核苷酸直接重复为删除信号。RT-PCR证明该基因具有转录活性。

关键词：八肋游仆虫 GARP基因三核苷酸重复

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八肋游仆虫大核基因组中组蛋白基因H4A和H4B的克隆及分析

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动物学杂志 2012年第3期47卷 73-80页

作者：杨旭霞许静梁爱华王伟山西大学生物技术研究所、化学生物学与分子工程教育部重点实验室太原030006

组蛋白作为核小体的基本组分,是染色质的结构和功能必需的。组蛋白的变体和修饰共同参与染色质修饰及基因的表达调控。真核生物细胞中的5种组蛋白在进化中高度保守,然而纤毛虫的组蛋白H4与其他真核生物相比有较大的差异。本实验应用PCR... 详细信息

组蛋白作为核小体的基本组分,是染色质的结构和功能必需的。组蛋白的变体和修饰共同参与染色质修饰及基因的表达调控。真核生物细胞中的5种组蛋白在进化中高度保守,然而纤毛虫的组蛋白H4与其他真核生物相比有较大的差异。本实验应用PCR技术从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)中获得了2种组蛋白H4基因,分别为H4A和H4B,GenBank登录号为:JN715068和JN715069。序列分析表明,H4A基因开放阅读框324 bp,预测编码107个氨基酸,分子量为11.6 ku,等电点为10.99。而H4B基因编码框384 bp,编码127个氨基酸,分子量为14.4 ku,等电点为9.93。Blast结果显示,H4A序列与其他生物中H4的一致性相对较高,达81%～94%,而H4B的一致性为36%～70%。H4A和H4B的一致性仅为44.7%。实时荧光定量PCR表明,H4A的转录本高于H4B。结果提示:在进化过程中八肋游仆虫可能进化出特殊的组蛋白H4基因,不同的组蛋白H4可能发挥不同的功能。

关键词：八肋游仆虫克隆组蛋白H4 转录

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八肋游仆虫Rab家族基因克隆和多样性分析

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动物学杂志 2010年第6期45卷 1-8页

作者：李江姣聂宇许静王伟山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室太原030006 北京协和医学院中国医学科学院阜外心血管病医院卫生部心血管疾病再生医学重点实验室北京100037

Rab蛋白是在真核细胞内膜泡运输过程中起重要调节作用的一类小分子Ras-like蛋白,为Ras超家族中最大的家族。Rab家族成员在不同的生物中表现出数量的多样性和功能上的分化。为进一步了解Rab蛋白的多样性及其在真核细胞内膜泡运输网络中... 详细信息

Rab蛋白是在真核细胞内膜泡运输过程中起重要调节作用的一类小分子Ras-like蛋白,为Ras超家族中最大的家族。Rab家族成员在不同的生物中表现出数量的多样性和功能上的分化。为进一步了解Rab蛋白的多样性及其在真核细胞内膜泡运输网络中的功能,本研究利用游仆虫大核染色体特异的端粒结构和基因大小的染色体结构特征,通过简并引物PCR方法从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)中克隆到9种新的Rab基因,分别为EoRab1A、EoRab2b、EoRab2c、EoRab2d、EoRab6、EoRab7、EoRab2-like、EoRabL2和EoRan(GenBank登陆号为HM371131～HM371139)。序列分析表明,游仆虫中Rab基因家族成员既包括具有维持细胞结构核心功能保守基因,又包括为适应环境而进化出的特殊功能的新基因。

关键词：八肋游仆虫 Rab 克隆多样性膜泡运输

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八肋游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1有2个亚型

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中国生物化学与分子生物学报 2015年第10期31卷 1092-1101页

作者：佘梅王软林张志云梁爱华山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室太原030006

真核生物酸性核糖体磷酸化蛋白(P0、P1、P2)位于核糖体60S大亚基上,它们在核糖体上共同组成一个向外侧凸出的五聚体的柄状复合物[P0·(P1·P2)2],该复合物在蛋白质合成延伸过程中起着重要作用.为了探讨单细胞真核生物核糖体柄状复合物... 详细信息

真核生物酸性核糖体磷酸化蛋白(P0、P1、P2)位于核糖体60S大亚基上,它们在核糖体上共同组成一个向外侧凸出的五聚体的柄状复合物[P0·(P1·P2)2],该复合物在蛋白质合成延伸过程中起着重要作用.为了探讨单细胞真核生物核糖体柄状复合物的组成形式及在蛋白质合成中的作用,对八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)的P1进行了研究.通过生物信息学方法,分析八肋游仆虫基因组及转录组数据,找到2个酸性核糖体蛋白P1基因,从DNA和c DNA中都扩增到这2个P1基因,表明八肋游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1确实存在2个亚型.将2个基因克隆后分别构建重组表达质粒p ET28a-P1A和p GEX-6P-1-P1B,在大肠杆菌BL21中获得高效表达.经镍柱和GST柱亲和层析后,获得较高纯度的八肋游仆虫酸性核糖体蛋白Eo P1A和Eo P1B,表达产物经Western印迹检测为阳性.Pull-down分析了Eo P1A和Eo P1B之间的相互作用.结果表明,游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1的2个亚型Eo P1A和Eo P1B之间存在相互作用.

关键词：八肋游仆虫酸性核糖体蛋白P1 基因克隆表达纯化

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八肋游仆虫氨酰-tRNA合成酶基因序列分析

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中国生物化学与分子生物学报 2017年第10期33卷 1026-1036页

作者：宋建英王软林梁爱华山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室太原030006

氨酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase,aaRS)是蛋白质生物合成中的关键酶,能够催化特定的氨基酸和相应tRNA结合。为了研究八肋游仆虫氨酰-tRNA合成酶(Euplotes octocarinatus aminoacyl-tRNA synthetase,EoaaRS)基因的种类、数目、结构及起源,本研究利用生物信息学方法,对八肋游仆虫大核基因组编码的aaRS进行了系统分析。结果表明,八肋游仆虫大核基因组共包含45个aaRS基因,可编码20种不同的aaRS蛋白。其中,Eo GlnRS和Eo AlaRS仅由1个基因编码,其余EoaaRS均由多个基因编码。亚细胞定位分析显示,仅8个EoaaRS具有线粒体导肽,对应于6种EoaaRS。此外,基于核酸序列分析显示,多个EoaaRS在翻译过程中需要发生编程性核糖体移码,才能形成结构完整的蛋白质产物。结构域分析表明,部分EoaaRS存在特殊结构域,暗示其可能具有氨酰化以外的新功能。进化分析揭示,2个Eo GlyRS起源于古菌,而2个Eo LysRS起源于细菌。本研究为后续探讨低等真核生物aaRS的结构与功能奠定了基础。

关键词：八肋游仆虫氨酰-tRNA合成酶序列分析

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