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发酵乳杆菌C6全细胞催化剂的制备及产D-塔格糖催化条件优化

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中国酿造 2023年第3期42卷 179-186页

作者：邱露彭帅英李昆太江西农业大学生物科学与工程学院江西南昌330045 广东海洋大学食品科技学院广东湛江524088

以L-阿拉伯糖异构酶产生菌发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)C6为全细胞催化剂,对其发酵制备工艺以及生物转化D-塔格糖的催化反应条件和细胞透性化学处理方式进行优化。结果表明,菌株C6以最优培养基配方(葡萄糖10 g/L,酵母浸粉20 g/L... 详细信息

以L-阿拉伯糖异构酶产生菌发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)C6为全细胞催化剂,对其发酵制备工艺以及生物转化D-塔格糖的催化反应条件和细胞透性化学处理方式进行优化。结果表明,菌株C6以最优培养基配方(葡萄糖10 g/L,酵母浸粉20 g/L,蛋白胨20 g/L,无水乙酸钠10 g/L,MgSO_(4)·7H_(2)O 0.4 g/L,MnSO_(4)·2H_(2)O 0.05 g/L,K_(2)HPO_(4)0.4 g/L,L-阿拉伯糖3 g/L,ZnSO_(4)·7H_(2)O 0.04 g/L,生物素100μg/L,焦磷酸硫胺素400μg/L)在最优发酵条件(发酵温度37℃、初始pH值7.5、装液量70 mL/150 mL、接种量1%)下培养24 h,生物量(OD_(600 nm)值=1.25)和L-阿拉伯糖异构酶酶活(107.81 U/mL)较优化前分别提高了92.31%和116.44%;全细胞催化剂在优化的催化反应条件(反应温度60℃、反应pH值7.5、Mn^(2+)10 mmol/L、底物浓度0.5 mol/L、底物加入体积2 mL,反应时间24 h)及细胞透性处理(20%丙酮处理60 min)方式下,D-塔格糖产率达45.07%。

关键词：发酵乳杆菌C6 D-塔格糖全细胞催化剂 D-塔格糖产率透性化细胞

酿酒酵母表面展示NX1101蛋白酶全细胞催化剂制备火麻多肽

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中国麻业科学 2024年

作者：曲亚通苏宇波王悦高钢赵浩含陈佳王晓飞马智峰朱爱国陈继康陵川县清凉太行农产品开发有限公司张家川回族自治县经济作物工作指导站中国农业科学院麻类研究所/农业农村部麻类生物学与加工重点实验室

酶解法火麻肽制备具有安全性好、能耗低、营养损失小等优点。研究在综合脱脂火麻仁籽粕蛋白提取以及蛋白水解酶筛选的基础上，以穿梭质粒pYD1为表达载体，将源于牛肠道宏基因组文库中的蛋白水解酶NX1101锚定在酿酒酵母菌株（EYB100）表... 详细信息

酶解法火麻肽制备具有安全性好、能耗低、营养损失小等优点。研究在综合脱脂火麻仁籽粕蛋白提取以及蛋白水解酶筛选的基础上，以穿梭质粒pYD1为表达载体，将源于牛肠道宏基因组文库中的蛋白水解酶NX1101锚定在酿酒酵母菌株（EYB100）表面，并以此重组菌株作为全细胞催化剂制备火麻多肽。酶学性质分析发现，该全细胞催化剂的最适反应pH值为8.0，在pH 8～10的酶活稳定性较高，为耐碱性全细胞催化剂；其最适反应温度50 ℃，在50 ℃以下时酶活稳定性较高。脱脂火麻蛋白经表面展示表达NX1101的重组酵母全细胞催化剂酶解后，共获得1095个多肽，其中氨基酸数量≤10的短肽数量达140个。全细胞催化剂酶解效率相较常规酶解技术（以碱性蛋白酶粉剂为对照）增加6.5倍以上。

关键词：火麻肽蛋白水解酶酶学性质全细胞催化剂表面展示

酿酒酵母细胞表面展示米根霉脂肪酶制备全细胞催化剂及其特性研究

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酿酒酵母细胞表面展示米根霉脂肪酶制备全细胞催化剂及其特性研究

作者：张蕊北京化工大学

学位级别：硕士

生物柴油是一种清洁可替代绿色能源,己引起人们极大的关注。脂肪酶催化制备生物柴油,具有反应条件温和、无污染等优势,是生物柴油技术的发展方向。随着酶固定化方法的日臻完善,脂肪酶催化应用领域越来越广泛。脂肪酶表面展示技术集分离... 详细信息

生物柴油是一种清洁可替代绿色能源,己引起人们极大的关注。脂肪酶催化制备生物柴油,具有反应条件温和、无污染等优势,是生物柴油技术的发展方向。随着酶固定化方法的日臻完善,脂肪酶催化应用领域越来越广泛。脂肪酶表面展示技术集分离、纯化和固定化于一体,不仅可以提高脂肪酶的稳定性,而且还能降低酶固定化操作成本。为此,我们采用a凝集素Aga2作为锚定蛋白,以酿酒酵母为宿主菌,表面展示米根霉脂肪酶(ROL),构建全细胞催化剂,研究了全细胞催化剂的酶学特性,初步探讨了全细胞催化剂的发酵成本,以及在生物柴油中的应用。主要研究成果如下：1.借助生物信息学方法,确定了锚定蛋白、宿主菌和目的脂肪酶蛋白表面展示单元的匹配规律,为表面展示全细胞催化剂的构建奠定了理论基础。分析4种不同种类的脂肪酶和锚定蛋白结构信息,其中ROL为目标展示酶时,结构中具有分布较均匀的疏水性和柔性;催化三联体由S242,D301,H354组成,阴离子氧洞为T213,L267,活性中心离C端较近。因此,选择N端锚定的a凝集素Aga2-Agal比较合适。2.以a凝集素Aga2-Agal为锚定蛋白,成功地将ROL展示在酿酒细胞表面,获得了具有水解橄榄油活性的全细胞催化剂。该全细胞催化剂水解橄榄油活力为78.9 U·g-1,高于相关文献报道。同时,研究了ROL全细胞催化剂的酶学特性,最适温度为40 C,最适pH为7.5,具有良好的稳定性和有机溶剂耐受性。3.初步探讨了ROL全细胞催化剂发酵生产成本和催化生物柴油应用。结果表明,2L发酵菌丝体生物量大于3g,粗略计算,发酵成本为68.9元g-1。海藻酸钠固定化ROL全细胞催化剂催化制备生物柴油得率为81.2%,重复利用7批次后的转酯率仍保持80%以上

关键词：表面展示技术米根霉脂肪酶酿酒酵母全细胞催化剂生物柴油

基于酵母表面展示技术的耐热木聚糖酶全细胞催化剂的构建及酶学性质研究

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湖北农业科学 2021年第7期60卷 120-125,134页

作者：邓香连刘清怡熊海容张莉中南民族大学生命科学学院武汉430074

木聚糖酶是一种重要的工业用酶,在饲料、造纸、纺织、食品等领域有巨大的应用潜力。使用毕赤酵母表面展示技术,以细胞壁蛋白Gcw61为锚定蛋白,将实验室前期筛选获得的耐热木聚糖酶(DSB)展示在毕赤酵母表面,摇瓶发酵获得的全细胞催化剂的... 详细信息

木聚糖酶是一种重要的工业用酶,在饲料、造纸、纺织、食品等领域有巨大的应用潜力。使用毕赤酵母表面展示技术,以细胞壁蛋白Gcw61为锚定蛋白,将实验室前期筛选获得的耐热木聚糖酶(DSB)展示在毕赤酵母表面,摇瓶发酵获得的全细胞催化剂的酶活力最高达13510 U/g。然后对DSB的全细胞催化剂和游离酶的酶学性质进行比较分析,2种酶的最适反应温度均为65℃,最适反应pH均为6.5,但在70℃高温条件和pH 3.0的酸性条件下,DSB全细胞催化剂的稳定性均优于DSB游离酶。此外在高浓度NaCl、高浓度甲醇、多种金属离子(Na^(+)、Ca^(2+)、Ni^(2+))的环境条件下,DSB全细胞催化剂均能维持较高的酶活且稳定性优于DSB游离酶。

关键词：耐热木聚糖酶全细胞催化剂毕赤酵母酶学特性

毕赤酵母表面展示CALB全细胞脂肪酶催化剂的发酵优化及其在天然维生素C改性中的应用

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毕赤酵母表面展示CALB全细胞脂肪酶催化剂的发酵优化及其在天然维...

作者：徐娟浙江大学

学位级别：硕士

维生素C作为天然抗氧化剂备受青睐,但不具有脂溶性极大地限制了其应用。随着两步发酵生产技术的成熟,全球维生素C产能过剩危机严重。因此,维生素C改性对扩展其使用范围,增加其附加值,缓解产能过剩有重要的现实意义。对维生素C改性,生物... 详细信息

维生素C作为天然抗氧化剂备受青睐,但不具有脂溶性极大地限制了其应用。随着两步发酵生产技术的成熟,全球维生素C产能过剩危机严重。因此,维生素C改性对扩展其使用范围,增加其附加值,缓解产能过剩有重要的现实意义。对维生素C改性,生物法与化学法相比更具优势,但是目前生物酶制剂价格昂贵,制作繁琐。本论文对发酵法生产高效低成本的新型固定化生物催化剂—脂肪酶全细胞催化剂及其催化合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的工艺路线进行研究。首先对自主构建的毕赤酵母表面展示假丝酵母脂肪酶B （CALB）全细胞催化剂发酵、产酶关键条件进行优化。Invitrogen公司操作手册的基础上,优化后菌体富集BMGY培养基甘油含量为4%,装液量为25mL/250mL,转速为250r/min,发酵菌体密度OD600由优化前的24.68提高到55.4;诱导产酶BMMY培养基装液量为25mL/250mL,转速为250 r/min,甲醇的初始添加量为1%,每24h添加0.75%,诱导144h,单位发酵液的酶活力由优化前的11.7 U/mL升高到30.5U/mL。对毕赤酵母表面展示CALB全细胞催化剂的酶学特性进行研究。在催化对硝基苯酚棕榈酸酯的水解过程中,其最适反应pH是8,最适反应温度范围是40℃。同时,热稳定研究表明毕赤酵母表面展示CALB具有良好的稳定性,40℃恒温4h,仍能保持88%以上的水解活力。50℃恒温6h残存酶活仍在50%以上。 L-抗坏血酸脂肪酸酯合成必须在非水相中进行,为获得干燥、催化酯合成效率高的毕赤酵母表面展示CALB全细胞催化剂,对其冻干条件进行优化。优化后的冻干条件为：pH为7.5的磷酸盐缓冲液进行pH“记忆”,油酸进行印迹,以5%脱脂乳/5%海藻糖（1:1）作为冻干保护剂进行冻干,酶活提高5倍左右。应用毕赤酵母表面展示CALB冻干粉在有机相中合成L-抗坏血酸脂肪酸酯。优化后的合成条件为：四氢呋喃作为反应介质,5 mL反应体系中加入L-抗坏血酸（100 mmol）和棕榈酸（L-抗坏血酸／棕榈酸=1:7）,50 mg冻干全细胞催化剂,45℃, 100r/min下转化36h,反应6h时加入350 mg 4分子筛。优化后下,催化反应的转化率最高达到95.5%。

关键词：表面展示假丝酵母脂肪酶B 全细胞催化剂发酵冻干优化 L-抗坏血酸脂肪酸酯合成

丝瓜络固定化米根霉催化光皮树油制备生物柴油

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化工进展 2022年第10期41卷 5381-5389页

作者：纪淑兰李迅王飞南京林业大学化学工程学院江苏南京210037

近年来,全细胞生物催化剂应用于生物柴油生产的研究引起了人们的极大关注,全细胞催化剂的制备过程可省去烦琐的酶纯化过程和降低催化剂的制备成本,且全细胞催化剂使用寿命较长。本研究对一株高产脂肪酶的米根霉进行了固定化研究,并将其... 详细信息

近年来,全细胞生物催化剂应用于生物柴油生产的研究引起了人们的极大关注,全细胞催化剂的制备过程可省去烦琐的酶纯化过程和降低催化剂的制备成本,且全细胞催化剂使用寿命较长。本研究对一株高产脂肪酶的米根霉进行了固定化研究,并将其应用于生物柴油的制备。首先筛选不同的生物基固定化材料,探索其适宜的固定化条件,以获得的固定化米根霉作为全细胞催化剂催化光皮树油制备生物柴油,探讨了转酯化条件对生物柴油得率的影响。研究结果表明,丝瓜络作为固定化材料的固载率最高,以橄榄油作为碳源,多聚蛋白胨和NaNO作为复合氮源,获得的固定化细胞的固载率及脂肪酶活性最强。以丝瓜络固定化米根霉催化光皮树油,在含水量为10%、催化剂用量为12%的反应体系中,总醇油摩尔比为4∶1,甲醇分别在0h、10h、24h、40h以1∶1添加,甲酯得率可达94%以上。固定化全细胞重复使用6次后,转酯化效果依然保持在80%以上。

关键词：全细胞催化剂米根霉丝瓜络生物柴油光皮树油

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脂肪酶的酵母细胞表面展示及其应用

中国食品学报 2017年第5期17卷 152-160页

作者：赵敏洁蔡海莺李杨来佳张辉冯凤琴浙江大学生物系统工程与食品科学学院杭州310058

脂肪酶是一类在工业上应用广泛的酶制剂。传统的脂肪酶生产过程操作复杂,投资较大,使得脂肪酶的价格一直居高不下。脂肪酶的表面展示技术直接将脂肪酶固定在宿主细胞表面,其优点是:1)省去复杂的分离纯化和固定化过程,降低生产成本;2)表... 详细信息

脂肪酶是一类在工业上应用广泛的酶制剂。传统的脂肪酶生产过程操作复杂,投资较大,使得脂肪酶的价格一直居高不下。脂肪酶的表面展示技术直接将脂肪酶固定在宿主细胞表面,其优点是:1)省去复杂的分离纯化和固定化过程,降低生产成本;2)表面展示技术为脂肪酶的蛋白工程研究提供新的高通量筛选途径;3)部分研究表明展示的脂肪酶作为全细胞催化剂比传统的自由酶以及固定化的脂肪酶具有更高的酶学活性和更好的温度稳定性、有机溶剂耐受性等优良特性,应用前景良好。根据宿主不同,研究较多的脂肪酶表面展示系统可分为噬菌体、细菌和酵母3类。凭借成熟的基因工程操作技术和对真核蛋白良好的加工修饰能力,酵母细胞在脂肪酶表面展示上的应用越来越多。本文将简要介绍脂肪酶酵母表面展示系统的组成,影响因素及其在高通量筛选、全细胞催化剂和蛋白共展示技术等方面的应用前景。

关键词：脂肪酶表面展示酵母细胞高通量筛选全细胞催化剂

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透性化酪氨酸脱羧酶工程菌制备酪胺的研究

高校化学工程学报 2017年第6期31卷 1364-1371页

作者：赵伟睿胡升喻毅许汉良黄俊姚善泾梅乐和金志华浙江大学宁波理工学院生物与化学工程学院浙江宁波315100 浙江大学化学工程与生物工程学院浙江杭州310027 浙江科技学院生物与化学工程学院浙江杭州310023

制备具有高表观酪氨酸脱羧酶(TDC)催化活力的全细胞催化剂对于酪胺生产效率的提升和成本的降低都至关重要。为此,研究构建了表达有Lactobacillus brevis CGMCC 1306 TDC基因的工程菌(Origami(DE3)-p ET21a-tdc),并在此基础上,采用9种有... 详细信息

制备具有高表观酪氨酸脱羧酶(TDC)催化活力的全细胞催化剂对于酪胺生产效率的提升和成本的降低都至关重要。为此,研究构建了表达有Lactobacillus brevis CGMCC 1306 TDC基因的工程菌(Origami(DE3)-p ET21a-tdc),并在此基础上,采用9种有机溶剂对该工程菌进行透性化处理,来提高其菌体表观催化活力。结果表明,菌体表观TDC催化活力的改善程度与有机溶剂的疏水性具有较强相关性,高疏水性(log P>2.28)的有机溶剂能有效提高菌体表观TDC催化活力,最有效的透性化溶剂己烷的最适处理条件为:1%己烷处理工程菌10 min,在此条件下菌体细胞被膜结构发生明显改变,但细胞整体形态仍保持完整,菌体表观TDC催化活力可达1.48 U?mg-1。在pH 5.5,40℃的条件下,0.47 g?L-1透性化Origami B(DE3)-p ET21a-tdc菌体在4.5 h内可将18 g?L-1酪氨酸完全转化为酪胺。研究为系统地选择有机溶剂来提高TDC工程菌表观催化活性提供了参考,同时制备的透性化菌体显示了良好的工业应用前景。

关键词：酪氨酸脱羧酶有机溶剂透性化处理酪胺全细胞催化剂

异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达重组枯草芽孢杆菌的构建

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微生物学报 2017年第1期57卷 54-65页

作者：王亚盟班睿刘露申雨天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室天津300350 天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室天津300350

【目的】构建异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达的重组枯草芽孢杆菌,探讨其作为全细胞催化剂合成D-对羟基苯甘氨酸的可行性。【方法】采用P_(aco)表达盒表达D-海因酶基因hyd或sd1,采用P_(AE)表达盒表达N-氨甲酰水解酶基因adc。分别以... 详细信息

【目的】构建异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达的重组枯草芽孢杆菌,探讨其作为全细胞催化剂合成D-对羟基苯甘氨酸的可行性。【方法】采用P_(aco)表达盒表达D-海因酶基因hyd或sd1,采用P_(AE)表达盒表达N-氨甲酰水解酶基因adc。分别以质粒pHP13和pUB110为载体,构建D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达质粒pHCS、pHCY和pUCS。在受体菌中整合表达了acoR和sigL基因,敲除了skf和sdp基因。将共表达质粒分别转化不同的受体菌,通过测定全细胞催化活性,表征D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达的效果。【结果】带有质粒pHCY和pHCS的重组菌,全细胞催化活性分别为0.21 U/mL和0.31 U/mL。整合表达acoR和sigL基因以及高拷贝质粒pUCS,使全细胞催化活性达到1.0 U/mL。【结论】异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶在枯草芽孢杆菌中能够正确表达。基因拷贝数、acoR和sigL基因表达水平,及skf和sdp基因缺失对重组菌的催化活性具有显著影响。

关键词：枯草芽孢杆菌 D-海因酶 N-氨甲酰水解酶全细胞催化剂 D-对羟基苯甘氨酸