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我国首株兔出血症病毒2型的致病性及病理学初步研究

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江苏农业科学 2020年第11期48卷 143-147页

作者：范志宇陈萌萌胡波魏后军宋艳华仇汝龙薛家宾王芳江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程重点实验室江苏南京210014

为深入研究国内首次发现并鉴定的兔出血症病毒2型(RHDV2)四川分离株SC2020/04的致病性,用SC2020/04 RHDV2分离株,以皮下注射方式感染25日龄仔兔和4月龄成年兔,记录家兔发病情况,对病死兔进行剖检,并取肝脏样品进行血凝(HA)和核酸检测,... 详细信息

为深入研究国内首次发现并鉴定的兔出血症病毒2型(RHDV2)四川分离株SC2020/04的致病性,用SC2020/04 RHDV2分离株,以皮下注射方式感染25日龄仔兔和4月龄成年兔,记录家兔发病情况,对病死兔进行剖检,并取肝脏样品进行血凝(HA)和核酸检测,取心、肝、脾、肺、肾、十二指肠等组织制作病理切片,进行病理学研究。试验结果显示,感染后仔兔18 h出现死亡,成年兔40 h出现死亡,死亡率均为5/5;感染后试验兔出现典型兔瘟临床症状,濒死时四肢抽搐、角弓反张,部分死亡兔可见口鼻流出红色血液;剖检主要病变为肝脏肿大并伴有明显的小叶样改变,脾肿大,肺、肝、脾和肾出现充血和弥漫性瘀点出血,腹腔内有血样渗出物;血凝试验结果显示,病死仔兔和成年兔肝脏血凝效价没有明显差异;采用鉴别经典RHDV/RHDV2的RT-PCR方法检测攻毒死亡兔肝脏样品,结果显示为RHDV2阳性;病理学观察可见多脏器严重出血、肿胀,淋巴细胞和中性粒细胞大量浸润,病死仔兔十二指肠组织严重糜烂,成年兔十二指肠病变较轻。本研究对我国首个RHDV2毒株进行了致病性初探和病理学观察,研究结果可以为RHDV2疫苗研发和致病机理研究奠定基础。

关键词：兔出血症病毒2型临床症状剖检病变病理学观察

一种兔出血症病毒2型VP60蛋白VLP疫苗的研制

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一种兔出血症病毒2型VP60蛋白VLP疫苗的研制

中国微生物学会兽医微生物学专业委员会暨中国畜牧兽医学会...

作者：郭伟伟向银辉刘大卫郭玉广楚电峰范根成杜元钊青岛易邦生物工程有限公司

兔出血症病毒2型SC株衣壳蛋白VP60基因经克隆、测序鉴定后,依次构建重组pFastBacHTA-VP60、重组Bacmid-VP60,转染对数分裂期的昆虫细胞Sf9,获得了重组杆状病毒re-BacVP60,并对其进行一系列鉴定。结果表明:经SDS-PAGE、Western blot,均... 详细信息

兔出血症病毒2型SC株衣壳蛋白VP60基因经克隆、测序鉴定后,依次构建重组pFastBacHTA-VP60、重组Bacmid-VP60,转染对数分裂期的昆虫细胞Sf9,获得了重组杆状病毒re-BacVP60,并对其进行一系列鉴定。结果表明:经SDS-PAGE、Western blot,均证明兔出血症衣壳蛋白VP60基因在杆状病毒表达系统中得到了高效表达,重组蛋白分子量约为60kDa。电镜观察可见表达的重组蛋白能形成病毒样颗粒(VLPs),大小约为30nm,表面有特征性的突起结构。重组杆状病毒接种昆虫细胞Sf9,72h后其培养上清液和离心收集的细胞裂解上清均具有明显的血凝性,培养上清液红细胞凝集价达8log2,细胞裂解上清红细胞凝集价达14log2。用该VLP蛋白制备疫苗,能很好地防御兔出血症病毒Ⅱ型病毒的攻击,说明有很好的免疫原性。

关键词：兔出血症病毒2型衣壳蛋白 VP60 重组杆状病毒构建

来源： cnki会议评论

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浅谈兔出血症病毒2型防控要点

兽医导刊 2021年第16期 155-155页

作者：卫一新项朝荣孙冰洁李春贤济源市动物疫病预防控制中心河南济源459000

兔出血性病毒(RHDV)引起的兔病毒性出血症俗称兔瘟,在我国被列为二类动物疫病,在家兔养殖中的危害严重,是家兔养殖中的首号疾病。兔瘟病毒只感染家兔,且易感染2月龄以上的家兔,感染后48~72h发病死亡,家兔死亡率高达90%,主要表现为呼吸... 详细信息

兔出血性病毒(RHDV)引起的兔病毒性出血症俗称兔瘟,在我国被列为二类动物疫病,在家兔养殖中的危害严重,是家兔养殖中的首号疾病。兔瘟病毒只感染家兔,且易感染2月龄以上的家兔,感染后48~72h发病死亡,家兔死亡率高达90%,主要表现为呼吸系统和肝、脾、肾、心等实质脏器瘀血、肿大和出血等特征,但未断奶仔兔不易感。到目前为止,我国主要使用含有兔瘟病毒的组织灭活疫苗进行家兔的免疫,免疫后对经典兔瘟病毒的保护效果较好。

关键词：兔出血症病毒2型防控

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兔出血症2型研究进展

动物医学进展 2023年第9期44卷 97-101页

作者：董浩张乐颖左琴董青花朱婉月刘佐民梁春南中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物资源库北京102629

兔出血症2型是由兔出血症病毒2型引起的危害家兔和野兔的一种新型高度传染性、急性致死性疫病,该病2010年在法国首次被发现。2020年4月该病传入我国四川省后,迅速传播至我国多个省份,对我国养兔业的健康发展造成了严重危害。目前,国内... 详细信息

兔出血症2型是由兔出血症病毒2型引起的危害家兔和野兔的一种新型高度传染性、急性致死性疫病,该病2010年在法国首次被发现。2020年4月该病传入我国四川省后,迅速传播至我国多个省份,对我国养兔业的健康发展造成了严重危害。目前,国内外关于兔出血症2型的研究比较有限,而且国内没有商品化的疫苗用于该病的预防,因此应该加强对该病的重视程度,积极开展防控技术的研究。论文通过对兔出血症2型的流行情况、病原学及理化特性、流行病学、临床症状、剖检病变、诊断方法和防治措施等多个方面进行阐述,以期为科学预防和控制兔出血症2型提供参考。

关键词：兔兔出血症病毒2型流行病学诊断方法防控措施

不同亚型兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

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不同亚型兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

作者：孔德生中国农业科学院

学位级别：硕士

兔出血症病毒(Rabbit Haemorrhagic Disease Virus,RHDV)隶属于嵌杯病毒科兔病毒属,是成年兔急性、烈性、高度接触性传染病,即兔病毒性出血症(Rabbit Haemorrhagic Disease,RHD)的病原体。2010年在法国的家兔和野兔中发现了一种新型的R... 详细信息

兔出血症病毒(Rabbit Haemorrhagic Disease Virus,RHDV)隶属于嵌杯病毒科兔病毒属,是成年兔急性、烈性、高度接触性传染病,即兔病毒性出血症(Rabbit Haemorrhagic Disease,RHD)的病原体。2010年在法国的家兔和野兔中发现了一种新型的RHDV突变体,并命名为RHDV2。研究表明,RHDV1(传统的RHDV)和RHDV2有着不同的抗原性和遗传特性,系统进化树分析RHDV2为一个独立的分支,可能为兔病毒属的一个新的成员。在我国还没有对RHDV2的报道,加强对RHDV的病原学、流行病学、诊断方法和预防措施的综合性研究显得十分必要和紧迫。VP60蛋白是RHDV的主要衣壳蛋白,在机体诱导抗病毒感染的免疫反应中起着重要的作用,是RHDV的免疫保护性抗原。本实验首先设计引物扩增RHDV1 TP株(登录号:AF453761.1)的VP60序列,并克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建重组表达载体p ET-R1-VP60。合成Gen Bank中已发表RHDV2 10-32株(登录号:HE800532.1)的VP60序列并将其克隆至原核表达载体p ET-32a中,构建重组表达载体p ET-R2-VP60。阳性质粒分别转化E.coli BL21 Star(DE3)p Lys S表达菌,经IPTG诱导后两种亚型的VP60重组蛋白p VP60-1和p VP60-2均得到大量表达。KCl染色后切胶纯化VP60重组蛋白,Western blot检测表达的p VP60-1和p VP60-2均具有良好的抗原性。将纯化的p VP60-1和p VP60-2分别与佐剂混合作为免疫原分别免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤融合技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。通过比对RHDV1和RHDV2的氨基酸序列,合成了6段差异性多肽。以p VP60-1和p VP60-2、合成的差异肽以及RHDV1 TP株作为检测抗原,建立间接ELISA检测方法筛选分泌抗RHDV1及抗RHDV2单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞。通过有限稀释法进行3次亚克隆,共筛选到20株稳定分泌抗RHDV1的单抗株,其中有3株仅能识别RHDV1,分别命名为1D6、1H2、3F2;筛选到15株稳定分泌抗RHDV2的单抗株,其中有4株仅能识别RHDV2,分别命名为1G2、2C1、3B7、5D6。为了进一步鉴定这7株MAb的差异识别性,应用真核表达的VP60重组蛋白对7株MAb进行间接免疫荧光(IFA)和Western blot分析。首先采用体内诱生腹水法制备7株MAb的单克隆抗体。利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,将表达RHDV1 vp60基因的重组杆状病毒(Bac-R-VP60)和表达RHDV2 vp60基因的重组杆状病毒(Bac-R2-VP60)接种Sf9细胞,分别表达了s VP60-1蛋白和s VP60-2蛋白,对7株MAb进行IFA鉴定。以真核表达载体pc DNA3.1(+)为骨架构建pc DNA-R1-VP60和pc DNA-R2-VP60重组质粒,转染hela细胞分别表达了RHDV1型VP60蛋白e VP60-1蛋白和RHDV2型e VP60-2蛋白,对7株MAb进行Western blot和IFA鉴定。IFA和Western blot结果表明1D6、1H2和3F2单独识别RHDV1 VP60蛋白,其中1D6的抗原表位为256RWNGQ260,1H2和3F2的抗原表位相同均为312VLQFW316;1G2、2C1、3B7和5D6单独识别RHDV2 VP60蛋白,其中2C1的抗原表位为324ADNPIS329,1G2、3B7和5D6的抗原表位相同均为294AIDHD298(倾斜字体为不同亚型中表达差异的氨基酸)。将鉴定的抗原表位与NCBI发布的兔病毒属成员VP60蛋白的氨基酸序列比对分析的结果表明只针对RHDV1 VP60蛋白单抗的抗原表位同源性为98%,而只针对RHDV2 VP60蛋白单抗的抗原表位同源性为100%。以上结果表明筛选得到的差异识别单抗的差异识别性比较稳定,能够区分不同亚型的RHDV,为型特异性单抗。本研究通过杂交瘤融合技术制备了RHDV病毒型特异性单克隆抗体,并鉴定出了特异性单抗的抗原表位。型特异性单抗株的制备为RHDV的鉴别诊断建立奠定了基础,对RHDV的流行病学调查,遗传进化分析及防控具有重要的意义。

关键词：兔出血症病毒兔出血症病毒2型 VP60蛋白型特异性单克隆抗体抗原表位

鉴别RHDV与RHDV2荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

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中国预防兽医学报 2021年第5期43卷 512-520页

作者：肖跃强孙培姣周迎春陈萌萌崔平杨慧于雪于新友王芳沈志强山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600 山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014 安徽省动物疫病预防与控制中心安徽合肥230061 滨州市畜牧兽医管理服务中心山东滨州256600

为建立一种敏感、特异、快速、操作简便、易于判定的鉴别检测兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)荧光定量RT-PCR检测方法,本研究选择RHDV与RHDV2 VP60基因序列高度同源的保守区域设计了3对引物,经荧光定量PCR扩增比较,筛选出1... 详细信息

为建立一种敏感、特异、快速、操作简便、易于判定的鉴别检测兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)荧光定量RT-PCR检测方法,本研究选择RHDV与RHDV2 VP60基因序列高度同源的保守区域设计了3对引物,经荧光定量PCR扩增比较,筛选出1对引物,对各反应条件进行优化,建立了RHDV与RHDV2荧光定量PCR检测方法,且基于RHDV较RHDV2扩增产物熔解曲线Tm值高1.57℃~2.74℃,能够达到鉴别检测的目的。特异性试验显示,该方法仅对RHDV和RHDV2检测为阳性,对猪瘟兔化弱毒、兔多杀性巴氏杆菌、A型魏氏梭菌、波氏杆菌检测均为阴性,特异性强。敏感性试验显示,该方法对RHDV与RHDV2 VP60基因重组质粒标准品的最低检测限均为1×10^(1)拷贝/μL,敏感性高;重复性试验显示,RHDV VP60基因质粒标准品批内和批间Cp值最大变异系数分别为1.91、3.60,Tm值最大变异系数分别小于0.72、0.48;RHDV2 VP60基因质粒标准品批内和批间Cp值最大变异系数分别为1.90、3.93,Tm值最大变异系数分别为0.29、0.17,均小于5%,重复性好。采集RHDV AV34株感染病死兔的肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、心肌组织、内皮组织、口鼻粘液、肌肉组织、肛门排泄物、尿液等组织样品,进行病毒组织分布与排毒的检测,结果显示,各组织样品均为阳性,表明病毒在体内分布广泛,病毒可通过口鼻分泌物及粪尿排泄物排出。利用该方法检测临床肝组织样品,结果显示,RHDV AV34标准株阳性肝组织与14份RHDV临床肝组织样品、RHDV2分离株SC2020/04感染样品均为阳性,而常规RT-PCR方法对其中1份RHDV临床肝组织样品检测为阴性,两种方法符合率为93.3%。本研究建立了一种能够鉴别检测RHDV与RHDV2的荧光定量RT-PCR方法,为开展兔病毒性出血症的临床诊断、流行病学调查与防控等提供了有效的技术保障。

关键词：兔出血症病毒兔出血症病毒2型荧光定量RT-PCR 鉴别