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兔出血症病毒2型SC株VP60基因工程疫苗研制及其与传统兔出血症病毒疫苗的交叉保护作用

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江苏农业科学 2022年第16期50卷 50-54页

作者：宋艳华胡波范志宇魏后军陈萌萌仇汝龙徐为中王芳江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程重点实验室江苏南京210014

兔出血症病毒2型毒株于2020年在我国首次发现并报道,目前尚无有效的疫苗可用于对该毒株的防控。针对我国兔出血症病毒2型SC毒株VP60蛋白,构建获得表达该毒株VP60蛋白的重组杆状病毒rBAC-RHDV2-VP60。以rBAC-RHDV2-VP60为疫苗毒种,接种... 详细信息

兔出血症病毒2型毒株于2020年在我国首次发现并报道,目前尚无有效的疫苗可用于对该毒株的防控。针对我国兔出血症病毒2型SC毒株VP60蛋白,构建获得表达该毒株VP60蛋白的重组杆状病毒rBAC-RHDV2-VP60。以rBAC-RHDV2-VP60为疫苗毒种,接种昆虫细胞,表达获得重组VP60蛋白。以氢氧化铝胶为佐剂制成RHDV2 SC株VP60基因工程疫苗,结合前期制备的传统RHDV型WF株VP60基因工程疫苗,分别免疫2~3月龄健康易感兔,1.0 mL/只;免疫后21 d,检测2种疫苗分别对国内RHDV2流行株和传统RHDV毒株的免疫保护力。结果显示,用SC株攻毒,免疫RHDV2 SC株VP60基因工程疫苗的家兔,免疫组无死亡,而免疫生理盐水的对照组全部死亡;免疫传统RHDV WF株VP60基因工程疫苗的家兔,免疫兔6/10死亡,对照组兔全部死亡;用WF株攻毒,免疫RHDV2 SC株VP60基因工程疫苗的家兔,免疫组死亡7/10,而免疫生理盐水的对照组全部死亡;免疫传统RHDV WF株VP60基因工程疫苗的家兔,免疫兔无死亡,对照组兔全部死亡;提示传统RHDV型WF株疫苗不能对国内流行毒株RHDV2 SC毒株产生有效的免疫保护,RHDV2 SC株VP60基因工程疫苗也不能对国内传统RHDV毒株产生有效的免疫保护,两型毒株间交叉保护作用较低。本研究中针对我国流行RHDV2 SC毒株研制的基因工程疫苗对有效预防和控制国内流行的RHDV2将发挥重大作用。

关键词：兔出血症病毒2型杆状病毒表达基因工程疫苗免疫效力交叉保护

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兔出血症病毒2型理化特性研究

微生物学报 2021年第3期61卷 707-713页

作者：陈婉婷周明忠陈斌张鹏飞姜睿姣曾红梅涂藤陈弟诗杨泽晓罗燕姚学萍王印四川农业大学动物医学院四川成都611130 四川省动物疫病预防控制中心四川成都610041 动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川成都611130

【目的】本研究旨在研究该病毒的理化特性,评价不同处理条件对RHDV2的杀灭效果。【方法】本研究拟对临床疑似RHDV2感染致死的家兔进行RT-PCR鉴定病原,并利用不同pH值、不同温度、常用兽用消毒剂、不同浓度甲醛处理RHDV2,通过PMA-RT-qPC... 详细信息

【目的】本研究旨在研究该病毒的理化特性,评价不同处理条件对RHDV2的杀灭效果。【方法】本研究拟对临床疑似RHDV2感染致死的家兔进行RT-PCR鉴定病原,并利用不同pH值、不同温度、常用兽用消毒剂、不同浓度甲醛处理RHDV2,通过PMA-RT-qPCR对病毒理化特性进行研究。【结果】经RT-PCR检测与测序分析,确诊为RHDV2感染,该毒株VP60基因序列与GenBank中RHDV2(登录号:MN276176.1)一致性为98.35%。PMA-RT-qPCR结果表明,RHDV2对酸碱、高温、兽用消毒剂、甲醛均表现不同程度的敏感性。酸碱处理病毒,随pH值降低或升高,病毒杀灭率均有提高。65℃处理病毒30 min后,病毒杀灭率可达77.61%,83℃处理5 min后,病毒杀灭率可达95.10%。RHDV2对3种所测兽用消毒剂均敏感,其中聚维酮碘对RHDV2杀灭作用最好,作用30 min后,病毒杀灭率达88.78%。0.3%甲醛的杀灭率优于0.2%甲醛,作用30 min后,其杀灭率可达82.22%。【结论】本研究探究了RHDV2的理化特性,该病毒对酸碱、高温、兽用消毒剂、甲醛均有不同程度的敏感性。本研究为RHDV2的诊断、临床消毒剂的选择提供了参考依据,为该病毒致病机理研究与疫苗研发奠定基础。

关键词：兔出血症病毒2型理化特性 PMA-RT-qPCR 消毒

兔出血症病毒2型TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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江苏农业学报 2021年第6期37卷 1476-1480页

作者：陈萌萌仇汝龙范志宇胡波宋艳华魏后军朱伟峰徐为中王芳江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程重点实验室江苏南京210014

以新发生的兔出血症病毒2型(RHDV2)SC 2020/04株VP60基因序列为参考,设计出1对特异性引物和TaqMan探针,建立了一种快速、灵敏且特异的用于检测新型病毒的荧光定量RT-PCR检测方法。试验结果显示:本研究建立的方法,标准曲线线性关系良好,R... 详细信息

以新发生的兔出血症病毒2型(RHDV2)SC 2020/04株VP60基因序列为参考,设计出1对特异性引物和TaqMan探针,建立了一种快速、灵敏且特异的用于检测新型病毒的荧光定量RT-PCR检测方法。试验结果显示:本研究建立的方法,标准曲线线性关系良好,R^(2)值达到0.999;其特异性较好,与兔出血症病毒1型(RHDV1)、仙台病毒(SV)和轮状病毒(RRV)病原均无交叉反应;灵敏性高,最低检出量为1μl 1×10拷贝;且重复性良好,批内和批间试验的变异系数平均值均小于2%。临床检测结果表明,利用该方法对108份临床病料进行检测,检出RHDV2阳性样品72份,检出率为66.7%,明显高于常规的RT-PCR方法(62.0%)。结果证明,新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法适合于RHDV2感染的特异性诊断。

关键词：兔出血症病毒2型 TaqMan探针荧光定量RT-PCR 敏感性特异性

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兔出血症病毒2型感染的病例诊断

中国养兔 2022年第3期 4-9页

作者：常赵阳刘玉梅刘潍淇王佳宁位兰兰张自强河南科技大学动物科技学院洛阳471000

为了解河南疑似兔出血症病毒2型(RHDV)的感染情况,并对RHDV的致病性进行初步分析。研究采集病死兔的肝组织,利用微量血凝试验、RT-PCR扩增及测序、VP60基因系统进化树分析和动物回归试验进行病原鉴定。微量血凝试验结果显示,组织样本悬... 详细信息

为了解河南疑似兔出血症病毒2型(RHDV)的感染情况,并对RHDV的致病性进行初步分析。研究采集病死兔的肝组织,利用微量血凝试验、RT-PCR扩增及测序、VP60基因系统进化树分析和动物回归试验进行病原鉴定。微量血凝试验结果显示,组织样本悬液能够凝集人“O”型血红细胞;RT-PCR扩增、测序及序列分析结果显示,检测到RHDV特异性条带,片段大小为829 bp;系统进化树分析结果发现,分离的病毒与我国四川发现的首例RHDV毒株SC2020/04的VP60基因相似性高达98.2%;临床病例的剖检显示病死兔胸腺、气管、肺、肝、脾、肾等实质性器官出血较为严重;动物回归试验发现攻毒组家兔病死率为100%,平均死亡时间为65.8 h,RT-PCR扩展均检测到RHDV特异性条带。该研究是首次在河南兔场检测到RHDV,为RHDV的防控提供科学参考。

关键词：兔出血症病毒1型兔出血症病毒2型 VP60基因 RT-PCR 致病力

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1例兔出血症病毒2型感染疫情的诊断

畜牧兽医学报 2022年第6期53卷 1886-1894页

作者：常赵阳刘玉梅刘潍萁王佳宁位兰张自强河南科技大学动物科技学院洛阳471000

旨在了解河南疑似兔出血症病毒2型(RHDV2)的感染情况,并对RHDV2的致病性进行初步分析。本研究采集病死兔的肝组织,利用微量血凝试验、RT-PCR扩增及测序、VP60基因系统进化树分析和动物回归试验进行病原鉴定。微量血凝试验结果显示,组织... 详细信息

旨在了解河南疑似兔出血症病毒2型(RHDV2)的感染情况,并对RHDV2的致病性进行初步分析。本研究采集病死兔的肝组织,利用微量血凝试验、RT-PCR扩增及测序、VP60基因系统进化树分析和动物回归试验进行病原鉴定。微量血凝试验结果显示,组织样本悬液能够凝集人“O”型血红细胞;RT-PCR扩增、测序及序列分析结果显示,检测到RHDV2特异性条带,片段大小为829 bp;系统进化树分析结果发现,分离的病毒与我国四川发现的首例RHDV2毒株SC2020/04的VP60基因相似性高达98.2%;临床病例的剖检显示病死兔胸腺、气管、肺、肝、脾、肾等实质性器官出血较为严重;动物回归试验发现攻毒组家兔死亡率为100%,平均死亡时间为65.8 h,RT-PCR扩增均检测到RHDV2特异性条带。本研究首次在河南兔场检测到RHDV2,为RHDV2的防控提供了科学参考。

关键词：兔出血症病毒1型兔出血症病毒2型 VP60基因 RT-PCR 致病力

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兔出血症2型研究进展

动物医学进展 2023年第9期44卷 97-101页

作者：董浩张乐颖左琴董青花朱婉月刘佐民梁春南中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物资源库北京102629

兔出血症2型是由兔出血症病毒2型引起的危害家兔和野兔的一种新型高度传染性、急性致死性疫病,该病2010年在法国首次被发现。2020年4月该病传入我国四川省后,迅速传播至我国多个省份,对我国养兔业的健康发展造成了严重危害。目前,国内... 详细信息

兔出血症2型是由兔出血症病毒2型引起的危害家兔和野兔的一种新型高度传染性、急性致死性疫病,该病2010年在法国首次被发现。2020年4月该病传入我国四川省后,迅速传播至我国多个省份,对我国养兔业的健康发展造成了严重危害。目前,国内外关于兔出血症2型的研究比较有限,而且国内没有商品化的疫苗用于该病的预防,因此应该加强对该病的重视程度,积极开展防控技术的研究。论文通过对兔出血症2型的流行情况、病原学及理化特性、流行病学、临床症状、剖检病变、诊断方法和防治措施等多个方面进行阐述,以期为科学预防和控制兔出血症2型提供参考。

关键词：兔兔出血症病毒2型流行病学诊断方法防控措施

兔出血症病毒1、2型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立和应用

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江苏农业科学 2023年第18期51卷 40-44页

作者：王冠萱陈萌萌仇汝龙范志宇胡波宋艳华魏后军葛雷徐为中王芳钱莺娟江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程重点实验室江苏南京210014 南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业农村部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)的急性致死性传染性疾病。RHDV属于杯状病毒科(Calicivirus)兔病毒属(Lagovirus)。目前兔出血症病毒1型(GI.1)和兔出血症病毒2型(GI.2)2种基因型均有在我国流行。为了更好地进行流行病学调查、实时监测兔出血症发展趋势和临床诊断,建立了一种检测RHDV1型和RHDV2型病原的快速、简单、特异且敏感的Taq Man实时PCR。结果显示,稀释度为1×10^(8)~1×10^(4) copies/μL标准品建立的标准曲线有良好的线性关系,决定系数r^(2)为0.999;该方法对RHDV1型和RHDV2型具有高度特异性,与兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌等其他病原没有任何交叉反应;检测灵敏度为100~1000 copies/μL;组内和组间变异系数在0.01%~1.61%之间。用该方法对60份临床肝脏样品和52份鼻肛拭子样本进行检测,结果显示,RHDV检出率为70.5%,敏感性显著高于普通RT-PCR方法(51%)。因此,该方法能够同时检测RHDV1型和RHDV2型,可用于鉴别诊断兔出血症病毒。

关键词：兔出血症病毒1型兔出血症病毒2型双重TaqMan qPCR

一株兔出血症病毒2型基因组分析和致病性研究

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一株兔出血症病毒2型基因组分析和致病性研究

作者：刘杰西南民族大学

学位级别：硕士

兔出血症病毒二型(RHDV2),2020年首次在中国分离,可感染不同日龄家兔,尤以对幼龄兔表现出较高的病死率。。临床上以精神沉郁、厌食、严重低温、呼吸困难、反应迟钝、心动过缓、心律失常,病兔口鼻流出泡沫状红色血液,且肛门松弛伴黄色稀... 详细信息

兔出血症病毒二型(RHDV2),2020年首次在中国分离,可感染不同日龄家兔,尤以对幼龄兔表现出较高的病死率。。临床上以精神沉郁、厌食、严重低温、呼吸困难、反应迟钝、心动过缓、心律失常,病兔口鼻流出泡沫状红色血液,且肛门松弛伴黄色稀粪为主要特征。本研究立足于对山东某兔场出现疑似RHDV2病例进行实验,通过系列研究,鉴定为RHDV2,并进行全基因组序列的扩增分析和初步的致病性实验,取得成果如下:1.临床病料中RHDV2的鉴定为了鉴定该养殖场兔子死亡的病原,首先将肝脏悬液进行了血凝检测,结果显示其具有血凝特性。随后运用RHDV的分型引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳观察到在对应RHDV2的480bp处出现特异性目的条带,而对应RHDV1的193bp处则无扩增条带。经序列比对分析证实病料中扩增获得的目的片段为RHDV2的VP60部分序列,与国内的RHDV2毒株高度同源。将该病料中鉴定的RHDV2毒株命名为SD-2021。另外使用兔巴氏杆菌鉴定引物进行PCR扩增,未扩增出特异条带。2.SD-2021毒株的全基因序列的扩增与分析为了解该毒株的基因组信息,本研究根据四川RHDV2毒株SC2020/0401(MT586027)序列设计了8对全序扩增引物,分片段对SD-2021进行扩增。扩增结果显示,从肝脏中扩的8个片断的大小同预期的片段大小一致。使用DNAStar拼接获得基因全长序列7443bp,随后利用MEGA11进行系统进化树和同源性分析。发现SD-2021与四川SC2020/0401(MT586027)、CHN/SC2020(MT434995)全基因组同源性为88.03%,VP60核苷酸同源性为98.91%,非结构核苷酸同源性84.46%;系统进化树分析发现,分离的SD-2021毒株在RHDV2和经典RHD中形成独立的一个分支,针对和四川毒株全基因组同源性较低的情况下,用RDP和Simpolt软件进行重组分析,确认SD-2021发生了重组事件,重组断点在5266bp处,其主要亲本株为RHDV1/Triptis(EF558583),次要亲本RHDV2/SC2020/0401(MT586027)。3.SD-2021毒株的致病性研究将肝脏组织悬液皮下注射30日龄家兔进行攻毒,攻毒后出现典型的口鼻出血,浑身抽搐,角弓反张等临床症状,剖检发现肝脏、肺脏、心脏均有出血,脾脏边缘肿大等现象。病理切片在20倍视野下可以观察到肝脏组织结构紊乱,中央的静脉、汇管区域和肝实质内有明显的肝细胞呈弥散性坏死。对其病死兔的心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、气管、粪便进行荧光定量,发现其病毒含量最高部位在肝脏组织,其余脏器均含有病毒,其粪便有的能检测出,有的检测不出。肝脏研磨后梯度稀释为10、10、10、10对30日龄的兔子进行半数致死量测定,结果为10～10。用同样的方法对30、40、60日龄的兔子进行攻毒时发现,日龄小的兔子对该病毒更敏感。综上所述,本研究首次发现中国境内出现RHDV2的重组毒株,表明RHDV2在不断的变异,具有遗传多样性。并且对其重组毒株进行了体内复制试验,证实了其对家兔的毒力,为RHDV2的临床防控提供了数据支持。

关键词：兔出血症病毒2型基因组分析重组致病研究

鉴别RHDV与RHDV2荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

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中国预防兽医学报 2021年第5期43卷 512-520页

作者：肖跃强孙培姣周迎春陈萌萌崔平杨慧于雪于新友王芳沈志强山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600 山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014 安徽省动物疫病预防与控制中心安徽合肥230061 滨州市畜牧兽医管理服务中心山东滨州256600

为建立一种敏感、特异、快速、操作简便、易于判定的鉴别检测兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)荧光定量RT-PCR检测方法,本研究选择RHDV与RHDV2 VP60基因序列高度同源的保守区域设计了3对引物,经荧光定量PCR扩增比较,筛选出1... 详细信息

为建立一种敏感、特异、快速、操作简便、易于判定的鉴别检测兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)荧光定量RT-PCR检测方法,本研究选择RHDV与RHDV2 VP60基因序列高度同源的保守区域设计了3对引物,经荧光定量PCR扩增比较,筛选出1对引物,对各反应条件进行优化,建立了RHDV与RHDV2荧光定量PCR检测方法,且基于RHDV较RHDV2扩增产物熔解曲线Tm值高1.57℃~2.74℃,能够达到鉴别检测的目的。特异性试验显示,该方法仅对RHDV和RHDV2检测为阳性,对猪瘟兔化弱毒、兔多杀性巴氏杆菌、A型魏氏梭菌、波氏杆菌检测均为阴性,特异性强。敏感性试验显示,该方法对RHDV与RHDV2 VP60基因重组质粒标准品的最低检测限均为1×10^(1)拷贝/μL,敏感性高;重复性试验显示,RHDV VP60基因质粒标准品批内和批间Cp值最大变异系数分别为1.91、3.60,Tm值最大变异系数分别小于0.72、0.48;RHDV2 VP60基因质粒标准品批内和批间Cp值最大变异系数分别为1.90、3.93,Tm值最大变异系数分别为0.29、0.17,均小于5%,重复性好。采集RHDV AV34株感染病死兔的肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、心肌组织、内皮组织、口鼻粘液、肌肉组织、肛门排泄物、尿液等组织样品,进行病毒组织分布与排毒的检测,结果显示,各组织样品均为阳性,表明病毒在体内分布广泛,病毒可通过口鼻分泌物及粪尿排泄物排出。利用该方法检测临床肝组织样品,结果显示,RHDV AV34标准株阳性肝组织与14份RHDV临床肝组织样品、RHDV2分离株SC2020/04感染样品均为阳性,而常规RT-PCR方法对其中1份RHDV临床肝组织样品检测为阴性,两种方法符合率为93.3%。本研究建立了一种能够鉴别检测RHDV与RHDV2的荧光定量RT-PCR方法,为开展兔病毒性出血症的临床诊断、流行病学调查与防控等提供了有效的技术保障。

关键词：兔出血症病毒兔出血症病毒2型荧光定量RT-PCR 鉴别