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贝莱斯芽孢杆菌LJ02中植物免疫蛋白的筛选及其功能

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中国农业科学 2021年第16期54卷 3451-3460页

作者：魏艳侠李卓然张斌苑瑜瑾于玮玮常若葵王远宏天津农学院园艺园林学院天津农学院工程技术学院

【目的】贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LJ02菌株能够诱导黄瓜等植物产生免疫抗病反应。本研究从生防菌LJ02中分离鉴定具有激发植物免疫活性的蛋白分子,通过验证其功能,进一步解析免疫蛋白的免疫信号通路。【方法】用硫酸铵沉淀... 详细信息

【目的】贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LJ02菌株能够诱导黄瓜等植物产生免疫抗病反应。本研究从生防菌LJ02中分离鉴定具有激发植物免疫活性的蛋白分子,通过验证其功能,进一步解析免疫蛋白的免疫信号通路。【方法】用硫酸铵沉淀法处理LJ02菌株发酵液,离心获得LJ02蛋白粗提物,将其经凝胶层析后再利用半制备高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分离,收集不同峰值处的蛋白组分。以烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)为靶标进行活性组分的筛选,从而获得具有免疫活性的组分。液相质谱联用仪(LC-MS)检测分析活性组分后发现,在组分F-23中含鞭毛蛋白(flagellin,FlgLJ02)。将鞭毛蛋白FlgLJ02进行原核表达并纯化,经过敏性坏死反应(hypersensitive reaction,HR)和抗病试验验证其免疫功能。为确定其主要免疫信号通路,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测水杨酸(salicylic acid,SA)和乙烯(ethylene,ET)途径的相关合成酶基因ICS1、PAL、ACS1以及免疫相关抗性基因NPR1、PR-1、EIN2和EIN3,通过免疫相关抗性基因的相对表达量解析鞭毛蛋白FlgLJ02免疫信号转导途径。【结果】HPLC层析分离出贝莱斯芽孢杆菌LJ02菌液产生的60个外泌蛋白组分(F-1—F-60),免疫烟草接种TMV后,观察分析发现组分F-20、F-23、F-41、F-44具有显著的免疫抗病效应,其中组分F-23抗TMV效果最为显著,其抑制率为81.7%。经过质谱数据分析发现该组分包含鞭毛蛋白FlgLJ02等7种物质。选择鞭毛蛋白FlgLJ02为研究对象构建表达载体,转化大肠杆菌BL21,诱导表达后破碎细胞,获得粗提蛋白。将粗提蛋白过柱、透析纯化后的FlgLJ02渗入珊西烟(Nicotiana tabacum var. xanthi)叶片,24 h后能观察到过敏性坏死反应。将FlgLJ02稀释为终浓度50、100、200μg·mL-1的稀释液后预处理珊西烟叶片,24 h后接种TMV,其对TMV的枯斑抑制率分别为65.6%、76.1%、88.1%。用鞭毛蛋白FlgLJ02处理珊西烟,其SA途径和ET信号途径的免疫抗病相关基因ICS1、PAL、NPR1、PR-1、ACS1、EIN2、EIN3的相对表达量在24—48 h均显著上调。【结论】贝莱斯芽孢杆菌LJ02外泌的鞭毛蛋白FlgLJ02可以激发珊西烟植株的免疫防御反应,提高烟草植株对TMV的抗病性。

关键词：贝莱斯芽孢杆菌鞭毛蛋白免疫蛋白珊西烟烟草花叶病毒

葡萄根癌病病原菌中效应蛋白Tae4与其免疫蛋白Tai4的鉴定与分析

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中外葡萄与葡萄酒 2022年第1期 1-7页

作者：王鹏飞袁丽芳张庆田王海利慕茜王钦超韩金涛赵红军山东省葡萄研究院山东济南250100 山东省农药科学研究院山东济南250100 山东师范大学山东济南250014 龙口市省级农业高新技术产业开发区管委会山东龙口265701 农业农村部华东都市农业重点实验室/山东省葡萄栽培与精深加工工程技术研究中心山东济南250100

葡萄根癌病是一种由葡萄根癌病病原菌引起的革兰氏阴性细菌病害。而革兰氏阴性细菌含有非致病相关效应蛋白Tae4,可以杀死其他竞争菌种。有些革兰氏阴性菌本身可表达免疫蛋白Tai4,使自身免受伤害。本研究鉴定了18个Agrobacterium tumefac... 详细信息

葡萄根癌病是一种由葡萄根癌病病原菌引起的革兰氏阴性细菌病害。而革兰氏阴性细菌含有非致病相关效应蛋白Tae4,可以杀死其他竞争菌种。有些革兰氏阴性菌本身可表达免疫蛋白Tai4,使自身免受伤害。本研究鉴定了18个Agrobacterium tumefaciens和4个Agrobacterium vitis株系的Tae4和Tai4蛋白,结果显示,A.tumefaciens含有14个Tae4蛋白,A.vitis含有1个Tae4蛋白和1个Tai4蛋白。通过蛋白性质分析、进化树分析、蛋白结构分析和编码基因的选择压力分析表明,A.tumefaciens Tae4蛋白和A.vitis Tae4蛋白相似度不高;A.tumefaciens Tae4蛋白可分为2组;A.tumefaciens和A.vitis的Tae4基因间遭受正向选择。对葡萄根癌病病原菌株系Tae4蛋白和Tai4蛋白的鉴定与分析将为借助Tae4蛋白消灭致病菌,进而防治病害奠定基础。

关键词：葡萄根癌病病原菌效应蛋白 Tae4蛋白免疫蛋白 Tai4蛋白

鱼类病原杀香鱼假单胞菌Ⅵ型分泌系统效应-免疫蛋白的筛选及功能初步研究

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鱼类病原杀香鱼假单胞菌Ⅵ型分泌系统效应-免疫蛋白的筛选及功能...

作者：李彦彦浙江海洋大学

学位级别：硕士

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是一种重要的鱼类致病菌,能造成大黄鱼等养殖鱼类的大量死亡。前期本实验室发现大黄鱼致病株XSDHY-P基因组中编码有3套Ⅵ型分泌系统(分别命名为T6SS-1、-2和-3),其中T6SS-2介导了菌间竞争,... 详细信息

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是一种重要的鱼类致病菌,能造成大黄鱼等养殖鱼类的大量死亡。前期本实验室发现大黄鱼致病株XSDHY-P基因组中编码有3套Ⅵ型分泌系统(分别命名为T6SS-1、-2和-3),其中T6SS-2介导了菌间竞争,可促进菌株在养殖环境或宿主中定植。目前,P.plecoglossicida介导T6SS菌间杀伤的效应因子及其功能尚未阐明。已发表的研究显示,菌间杀伤相关的T6SS效应因子都会在其编码基因上游或下游相邻区位点编码一个能中和其毒性的免疫蛋白;编码这些效应因子-免疫蛋白对(Effector and Immunity protein pairs;下文缩写为E-I)的基因多与Hcp、Vgr G、PAAR蛋白基因相关联。利用这些已知信息,本论文首先通过生物信息学分析,筛选了XSDHY-P菌株中具有潜在细菌毒性的T6SS效应因子,并预测了其毒性结构域;继而通过大肠杆菌生长抑制实验、质粒降解实验以及菌间竞争实验证明其中两对E-I在菌株T6SS介导的菌间竞争中发挥了作用,具体发现总结如下:1.P.plecoglossicida XSDHY-P基因组中编码了5个vgr G基因(其中3个位于3个不同的T6SS基因簇,另外两个为孤儿vgr G基因),其中vgr G-2及两个孤儿vgr G(vgr G-4和vgr G-5)基因下游编码有4个潜在细菌毒性效应因子(命名为Type six XSDHY-P effector缩写为Txe)及其免疫蛋白(Txi)。vgr G-2下游编码效应因子-免疫蛋白对Txe1-Txi1和Txe2-Txi2,vgr G-4下游编码Txe3-Txi3,vgr G-5下游编码Txe4-Txi4。2.结构域预测分析显示4个潜在效应毒力因子为不同蛋白家族的核酸酶毒素。Txe1、Txe2和Txe4中含有典型的RHS保守结构域,Txe1、Txe3和Txe4含有PAAR模体结构。在C端结构域(CTD)预测中,在CCD数据库缺乏与Txe1 CTD同源的结构域,但Alphafold2预测的蛋白模型显示Txe1 CTD携带有与Caspase-Activated DNase His-Me finger(PDB ID:1v0d)类似催化结构。Txe2携带Tox-AHH核酸酶结构域(pfam14412,HNH/Endo ⅥI核酸酶家族)。Txe3具有HNHc核酸酶结构域(pfam01844,HNH核酸酶家族)。Txe4具有Tox-SHH核酸酶结构域(pfam15652,HNH/Endo ⅥI核酸酶家族)。3.Txe1、Txe2和Txe4在大肠杆菌诱导表达实验中展示了明确的细菌毒性,而仅Txe1和Txe4在菌株XSDHY-P与被捕食菌共培养时发挥了显著的抑菌作用。本文将编码序列txe1、txe2、txe3、txe4、txe1(Txe1的C端结构域)、txe2、txe4、txe1-txi1(效应-免疫基因共表达)、txe2-txi2和txe4-txi4克隆至阿拉伯糖(L-arabinose)诱导质粒p BAD33.1,转化至E.coli BL21(DE3)进行生长抑制实验及细胞内质粒降解实验。结果分析得Txe1、Txe2、Txe4、Txe1、Txe2和Txe4抑制大肠杆菌生长,细胞内降解质粒。Txi1、Txi2和Txi4分别是效应因子Txe1、Txe2、Txe4的免疫蛋白。构建效应因子缺失株,将XSDHY-P野生株(WT)、效应因子缺失株和ΔT6SS-2作为捕食菌(attacker),E.coli XL10作为被捕食菌(prey),开展菌间竞争实验,结果表明仅Txe1和Txe4介导了菌株T6SS-2相关的菌间杀伤。

关键词：杀香鱼假单胞菌 Ⅵ型分泌系统抗菌活性效应因子免疫蛋白

基于电化学发光免疫分析仪的CHB免疫蛋白与患者年龄的联系研究

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自动化与仪器仪表 2023年第4期 343-347页

作者：李悦衡水市第六人民医院河北衡水053200

为了提升电化学发光免疫分析仪检测精度和灵敏度,提出了一种基于自适应单神经元PID控制的改进恒温控制系统,将PID控制与神经网络相结合,减小热噪声对免疫检测的影响,引入增益自适应调节方法,提升恒温控制系统的稳定性和适应性,并采用改... 详细信息

为了提升电化学发光免疫分析仪检测精度和灵敏度,提出了一种基于自适应单神经元PID控制的改进恒温控制系统,将PID控制与神经网络相结合,减小热噪声对免疫检测的影响,引入增益自适应调节方法,提升恒温控制系统的稳定性和适应性,并采用改进免疫分析仪探究CHB免疫蛋白与患者年龄之间的关系,验证改进分析仪在实际医疗应用中的实用性。实验结果表明,改进仪器的检测噪声值在25 dB左右,相较于传统PID控制,自适应PID控制模型的调节效率提升了87.5%。患者乙肝表面免疫蛋白阳性率随年龄增长呈现出下降趋势,0~2岁时期阳性率水平最高,在10~12岁之间和45~50岁之间呈现出波谷状态,24~26岁期间出现波峰。采用自适应PID控制实现免疫分析仪恒温控制,能有效提升免疫检测精度和稳定性,为医学诊断和治疗决策提供准确数据支撑。

关键词：电化学发光免疫分析仪 PID 乙肝免疫蛋白

Identification of immunoreactive proteins of Brucella melitensis by immunoproteomics

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中国科学：生命科学英文版 2011年第9期54卷 880-887页

作者： ZHAO ZhongPeng YAN Fang JI WenHui LUO DeYan LIU Xin XING Li DUAN YueQiang YANG PengHui SHI XiuMin LI Zhong WANG XiLiang State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology Beijing 100071 China College of Animal Science and Veterinary Medicine Shanxi Agricultural University Taigu 030801 China

Infection with Brucella causes brucellosis, a chronic disease in humans, which induces abortion and sterility in livestock. Among the different Brucella species, Brucella melitensis is considered the most virulent and is the predominant species associated with outbreaks in China. To date, no safe human vaccine is available against Brucella infection. The currently used live vaccines against Brucella in livestock induce antibodies that interfere with the diagnosis of field infection in vaccinated animals, which is harmful to eradication programs. However, there is as yet no complete profile of immunogenic proteins of B. melitensis. Towards the development of a safer, equally efficacious, and field infection-distinguishable vaccine, we used immunoproteomics to identify novel candidate immunogenic proteins from B. melitensis M5. Eighty-eight immunoreactive protein spots from B. melitensis M5 were identified by Western blotting and were assigned to sixty-one proteins by mass spectrometry, including many new immunoreactive proteins such as elongation factor G, F0F1 ATP synthase subunit beta, and OMP1. These provide many candidate immunoreactive proteins for vaccine development.

关键词：布鲁氏杆菌蛋白鉴定免疫反应布鲁氏菌感染接种疫苗免疫蛋白布氏杆菌病 beta版

灵芝免疫调节蛋白(Lz-8)在毕赤酵母中的表达及其免疫活性鉴定(英文)

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生物工程学报 2009年第3期25卷 441-447页

作者：梁重阳张淑芹刘志屹孙非吉林大学再生医学科学研究所细胞生物研究室长春130021

真菌免疫调节蛋白家族(Fungi immunoregulatory proteins,FIPs)各成员所具有的免疫调节和抗肿瘤活性已被广泛研究。本研究利用毕赤酵母表达系统对其成员Lz-8进行了重组表达。以毕赤酵母突变株GS115为表达宿主细胞,PCR和DNA测序结果均显... 详细信息

真菌免疫调节蛋白家族(Fungi immunoregulatory proteins,FIPs)各成员所具有的免疫调节和抗肿瘤活性已被广泛研究。本研究利用毕赤酵母表达系统对其成员Lz-8进行了重组表达。以毕赤酵母突变株GS115为表达宿主细胞,PCR和DNA测序结果均显示Lz-8的cDNA已被成功地整合入酵母基因组。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和免疫学实验均被用于重组表达蛋白的检测。实验结果表明Lz-8在毕赤酵母表达系统中得到成功表达,在SDS-PAGE中可观察到分子量为14000D的单一条带,MALDI-TOF-MS的实验结果显示rLz-8的分子量为12722D。在相关的免疫学实验中,rLz-8可引起绵羊血红细胞凝集,但对人血4种血型的红细胞并没有凝集作用,rlz-8还可诱导巨噬细胞吞噬作用,均与其他报道中的实验结果吻合。以上结果表明,本实验已成功地利用毕赤酵母表达系统对Lz-8进行重组表达。

关键词：灵芝免疫调节蛋白毕赤酵母免疫蛋白

替比夫定与乙型肝炎疫苗及免疫球蛋白联合阻断乙型肝炎病毒母婴垂直传播的研究

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中华医院感染学杂志 2014年第1期24卷 15-16,33页

作者：彭美莲刘玮吕雯庞玉良浙江省立同德医院妇产科浙江杭州310032

目的观察替比夫定与乙型肝炎疫苗、免疫球蛋白联合在阻断乙型肝炎病毒母婴垂直传播中的疗效。方法将2011年1月-2012年1月携带乙型肝炎病毒的孕妇随机分成两组,对照组采用乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)与乙型肝炎疫苗联合治疗,观察组在此基... 详细信息

目的观察替比夫定与乙型肝炎疫苗、免疫球蛋白联合在阻断乙型肝炎病毒母婴垂直传播中的疗效。方法将2011年1月-2012年1月携带乙型肝炎病毒的孕妇随机分成两组,对照组采用乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)与乙型肝炎疫苗联合治疗,观察组在此基础上口服替比夫定600mg,1次/d;比较两组患者间治疗前和分娩前乙型肝炎核心抗体(HBcAb)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒的脱氧核糖核酸(HBV-DNA)的差异及出生后24h、6、12个月HBsAg阳性率。结果治疗前两组孕妇间血清HBcAb、HBeAg、HBV-DNA水平差异无统计学意义;分娩前观察组血清HBeAg、HBV-DNA水平分别为(165.28±236.56)s/co、(0.67±0.62)106拷贝/ml,对照组分别为(467.38±368.41)s/co和(4.28±2.17)106拷贝/ml;婴儿间出生后24h、6、12个月HBsAg阳性率分别为16.67%、3.33%、3.33%,显著低于对照组同时期的36.67%、26.67%、16.67%。结论替比夫定联合乙型肝炎疫苗、免疫球蛋白能有效阻断乙型肝炎病毒母婴垂直传播,疗效显著优于乙型肝炎疫苗、免疫球蛋白方案。

关键词：乙型肝炎病毒母婴阻断替比夫定乙型肝炎疫苗免疫蛋白

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动物支原体相关蛋白的免疫原性研究进展

畜牧兽医学报 2021年第5期52卷 1230-1237页

作者：陈胜利郝华芳季文恒储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046

动物支原体可引起肺炎、关节炎、乳腺炎等一系列重要疾病,临床上常表现为慢性、持续性感染,给养殖业造成严重的经济损失。亚单位疫苗具有安全高效、成本低廉等优点,是支原体疫苗研究的重要发展方向。本文主要介绍了重要动物支原体相关... 详细信息

动物支原体可引起肺炎、关节炎、乳腺炎等一系列重要疾病,临床上常表现为慢性、持续性感染,给养殖业造成严重的经济损失。亚单位疫苗具有安全高效、成本低廉等优点,是支原体疫苗研究的重要发展方向。本文主要介绍了重要动物支原体相关蛋白的免疫原性研究进展,以期为今后动物支原体病亚单位疫苗研究提供参考。

关键词：动物支原体支原体蛋白免疫原性亚单位疫苗免疫蛋白

片球菌素BM-1免疫蛋白对甘露糖磷酸转移酶受体识别特异性研究

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中国乳品工业 2014年第4期42卷 4-7页

作者：周万里张京声张世湘郝彦玲中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083

利用牛津杯法筛选到对片球菌素BM-1敏感的植物乳杆菌WQ0815和肠膜明串珠菌05-43。并利用Nisin诱导表达系统,在乳酸乳球菌NZ9000中诱导表达两敏感菌株的甘露糖磷酸转移酶系统IICD组分,抑菌实验表明不同来源的IICD组分皆可被片球菌素BM-1... 详细信息

利用牛津杯法筛选到对片球菌素BM-1敏感的植物乳杆菌WQ0815和肠膜明串珠菌05-43。并利用Nisin诱导表达系统,在乳酸乳球菌NZ9000中诱导表达两敏感菌株的甘露糖磷酸转移酶系统IICD组分,抑菌实验表明不同来源的IICD组分皆可被片球菌素BM-1识别。进一步将片球菌素BM-1同源免疫蛋白分别与两种IICD组分同时在乳酸乳球菌中表达,抑菌实验表明:免疫蛋白可识别植物乳杆菌来源的IICD组分,不能识别肠膜明串珠菌来源的IICD组分。研究结果为IIa类细菌素的同源免疫蛋白对受体存在特异性识别提供了直接证据。

关键词：片球菌素免疫蛋白受体识别机制