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免疫磁珠分离法分选提纯骨髓造血干细胞CD117

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贵阳医学院学报 2009年第2期34卷 167-169页

作者：任玮左丽钟志强贵阳医学院免疫学教研室贵州贵阳550004

目的:探讨用免疫磁珠分离法(magnetic activated cell sorting,MACS)从小鼠股骨、胫骨分离纯化骨髓造血干细胞CD117的方法。方法:收集小鼠骨髓细胞,台盼蓝染色观察其活力,用免疫磁珠分离法分选CD117细胞,流式细胞仪检测荧光标记CD117表... 详细信息

目的:探讨用免疫磁珠分离法(magnetic activated cell sorting,MACS)从小鼠股骨、胫骨分离纯化骨髓造血干细胞CD117的方法。方法:收集小鼠骨髓细胞,台盼蓝染色观察其活力,用免疫磁珠分离法分选CD117细胞,流式细胞仪检测荧光标记CD117表达阳性率。结果;未分选前CD117细胞纯度为(41.56±18.77)%,MACS分选CD117细胞纯度(88.68±4.74)%,纯化前后有明显差异(P法分选系统能有效分选骨髓造血干细胞CD117。

关键词：造血干细胞 CD117+细胞免疫磁珠分离法小鼠,近交BALBC

2012年东台市肠出血性大肠埃希菌O157︰H7监测分析

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中国病原生物学杂志 2013年第11期8卷 1020-1022页

作者：袁义平吴银华鲁静静武建民王迎庆江苏省东台市疾病预防控制中心江苏东台224200

目的了解肠出血性大肠埃希菌O157︰H7在东台市动物宿主和腹泻患者中带菌及毒力基因携带与耐药情况。方法于流行季节采集动物宿主、腹泻患者粪便及生熟食品和苍蝇标本,mEC肉汤增菌后,用特异性免疫磁珠集菌、科玛嘉显色平板分离,纯化的菌... 详细信息

目的了解肠出血性大肠埃希菌O157︰H7在东台市动物宿主和腹泻患者中带菌及毒力基因携带与耐药情况。方法于流行季节采集动物宿主、腹泻患者粪便及生熟食品和苍蝇标本,mEC肉汤增菌后,用特异性免疫磁珠集菌、科玛嘉显色平板分离,纯化的菌株经生化鉴定,血清分型,以K-B纸片法进行药敏试验,采用PCR方法检测uida基因和stx1、stx2、eaeA、hly等4种毒力基因。结果 683份标本共检出O157︰H7菌株35株,检出率为5.12%,其中动物粪便检出率为10.59%(34/321),检出率最高的为牛粪(26.92%),其次为山羊粪(7.50%)和猪粪(7.32%),腹泻患者的检出率为0.39%(1/256)。35株菌株均检出eaeA和hly毒力基因,而牛粪中stx2、eaeA和hly等3种毒力基因组合型检出率达12.82%。35株菌株对氨苄西林敏感率为14.3%,对其余17种抗生素敏感率均>90%。结论东台市动物宿主和腹泻患者均不同程度携带肠出血性大肠埃希菌O157︰H7,且存在流行的潜在危险。

关键词：肠出血性大肠埃希菌O157 H7 监测免疫磁珠分离法毒力基因宿主动物东台市,江苏省

应用免疫磁珠分离法及荧光定量PCR技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7

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中国人兽共患病学报 2011年第4期27卷 291-293,315页

作者：王涛刘凯王艳綦廷娜叶长芸熊衍文贵阳医学院微生物学教研室贵阳550004 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206

目的建立免疫磁珠分离法(immunomagnetic separation,IMS)联合荧光定量PCR(real-time PCR)技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfbEO157设计引物和荧光探针,建立real-time... 详细信息

目的建立免疫磁珠分离法(immunomagnetic separation,IMS)联合荧光定量PCR(real-time PCR)技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfbEO157设计引物和荧光探针,建立real-time PCR检测体系,并检测其特异性及敏感性;用O157免疫磁珠特异性捕获标本菌液中的O157∶H7大肠埃希菌,结合real-time PCR对磁珠捕获菌细胞的DNA进行检测分析。结果 Real-time PCR检测结果显示,O157∶H7大肠埃希菌可产生荧光信号,而其他常见致病菌均未见明显荧光信号;采用IMS-real-time PCR方法检测标本,菌液含菌量为3.3×102CFU/mL时即可被检出,检测全过程需时约4h。结论 IMS-real-time PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、快速易操作等特点,该检测方法能提高O157∶H7大肠埃希菌的检出率和准确性,可用于标本的快速诊断、疾病监测和暴发疫情的病原学调查。

关键词：免疫磁珠分离法荧光定量PCR 大肠埃希菌O157∶H7

两种细胞因子诱导人骨髓多能成体祖细胞向肝样细胞分化的作用

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中华肝脏病杂志 2005年第11期13卷 862-864页

作者：高毅唐力军慕宁南方医科大学珠江医院普外科广州510282

本实验用免疫磁性分离(MACS)方法分选骨髓间充质干细胞(MSCs)亚群MAPCs[1],用成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)及肝细胞生长因子(HGF)诱导其向肝细胞方向分化,并采用不同方法鉴定了细胞分化能力.

关键词：肝细胞生长因子成纤维细胞生长因子细胞分化免疫磁珠分离法骨髓间充质干细胞多能成体祖细胞细胞因子诱导人骨髓免疫磁性分离分化能力

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肝干细胞的来源与移植应用

中国临床康复 2005年第26期9卷 186-188页

作者：龚雪刘慧雯哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室黑龙江省哈尔滨市150086

目的:肝干细胞的研究已成为近年的热点,本文检索了肝干细胞的分类、诱导、分离、培养及移植后的鉴定方法,分析了它们与肝病的关系和临床应用前景。资料来源:应用计算机检索PUBMED2000-01/2005-01和EBSCO2000-01/2005-01期间的相关文章,... 详细信息

目的:肝干细胞的研究已成为近年的热点,本文检索了肝干细胞的分类、诱导、分离、培养及移植后的鉴定方法,分析了它们与肝病的关系和临床应用前景。资料来源:应用计算机检索PUBMED2000-01/2005-01和EBSCO2000-01/2005-01期间的相关文章,检索词为“hepaticstemcells”,并限定文章语言种类为英文。同时计算机检索万方数据库2000-01/2005-01期间的相关文章,检索词为“肝干细胞”,并限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:文章所述内容应与肝干细胞的研究相关。排除标准:重复研究或Meta分析类文章。资料提炼:共收集到161篇相关文献,37篇文献符合纳入标准,排除的124篇文献中是由于内容陈旧或重复。资料综合:37篇文献中,28篇涉及肝干细胞的分类,6篇涉及肝干细胞的诱导、分离、培养及移植后的鉴定,3篇涉及肝干细胞的临床应用。一般认为肝干细胞是多源性的,可分为内源性和外源性两大类。目前已经建立的细胞分离方法主要是基于细胞表面标志的免疫分离法,包括应用流式细胞仪的荧光激活细胞分离法和免疫磁珠分离法,它们根据表面标志的有无和表达的高低来确定细胞的类型和特征。这样可能会忽略了一些标志阴性却具有肝细胞分化潜能的肝干细胞,所以肝干细胞的分离有待改进。在临床应用中,肝细胞移植为病损肝脏的细胞重建及衰竭肝脏的功能恢复提供了一种全新的治疗策略,具有移植技术简单、对受体影响小、价格相对低廉等优点,但免疫排斥、肝细胞的来源、移植肝细胞在体内的增殖等问题尚未完全解决。结论:目前对急性或晚期肝病引起的肝功能衰竭,最佳治疗方法是肝移植,包括原位肝移植、肝细胞移植和生物人工肝3种方法。原位肝移植受肝源缺乏和免疫排斥所限,受益者很少;后两者均因肝细胞来源问题,临床价值受限。而利用肝干细胞移植和肝组织工程治疗各种肝病其前景已得到肯定。

关键词：干细胞肝/细胞学造血干细胞移植骨髓细胞分化生物医学工程综述文献肝干细胞移植移植后免疫磁珠分离法

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肝干细胞及其应用的研究进展

实用器官移植电子杂志 2015年第1期3卷 54-58页

作者：王政禄郑虹天津市第一中心医院病理科天津300192 天津市第一中心医院器官移植中心天津市器官移植重点实验室天津300192

肝干细胞(hepatic stem cell,HSC)是一类具有同时向肝细胞及胆管细胞分化和增殖以及自我更新潜能的原始细胞,当肝实质损伤尤其是肝脏大部分切除后,HSC会发生分化和高效增殖,参与到肝脏的再生和修复过程中,为机体细胞的更新提供潜在的无... 详细信息

肝干细胞(hepatic stem cell,HSC)是一类具有同时向肝细胞及胆管细胞分化和增殖以及自我更新潜能的原始细胞,当肝实质损伤尤其是肝脏大部分切除后,HSC会发生分化和高效增殖,参与到肝脏的再生和修复过程中,为机体细胞的更新提供潜在的无限细胞来源。相对于手术而言,HSC治疗具有损伤小、并发症少的优势,为终末期肝病的治疗提供了崭新的思路[1]。本文就HSC的研究和治疗进展进行综述。1 HSC的分类目前认为,HSC按照其来源可分为肝源性和非肝源性两种。肝源性HSC来源于前肠内胚层,

关键词：肝干细胞肝源性胆管细胞机体细胞自我更新细胞外基质祖细胞免疫磁珠分离法修复过程门静脉栓塞

成年小鼠心脏干细胞的分离、培养及其离子通道特性

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成年小鼠心脏干细胞的分离、培养及其离子通道特性

作者：刘祖梅华中科技大学

学位级别：硕士

长期以来人们认为成年哺乳动物心脏处于后有丝分裂期,即心脏是终末分化器官,不具备自我更新的能力。心脏内有丝分裂的发现,使人们认识到心脏内有可能存在着干细胞。新近的一些实验结果证实了心脏干细胞的存在,这些发现立即受到生物医学... 详细信息

长期以来人们认为成年哺乳动物心脏处于后有丝分裂期,即心脏是终末分化器官,不具备自我更新的能力。心脏内有丝分裂的发现,使人们认识到心脏内有可能存在着干细胞。新近的一些实验结果证实了心脏干细胞的存在,这些发现立即受到生物医学界的高度关注。现在已经从成年人和其他哺乳动物心脏中分离得到了心脏干细胞。通过细胞移植或是原位激活,心脏干细胞都有能力再生肌细胞,并能改善心脏功能。然而各家报道的心脏干细胞分离培养的方法不尽相同。关于心脏干细胞在分化前的离子通道特性至今未见报道。本实验致力于建立一种有效的、重复性好的成年小鼠心脏干细胞的分离、培养和鉴定方法,并在此基础上研究心脏干细胞在分化前存在的离子通道的类型及其特性。第一部分成年小鼠心脏干细胞的分离、培养和鉴定成年小鼠心脏干细胞的分离采用Langendorff法灌流小鼠心脏,用胶原酶酶解法制备单个心肌细胞,差速离心法将较大的细胞（如心室肌细胞）和较小的细胞分离开。取用较小细胞,用c-kit抗体孵育后,然后用免疫磁珠分离法分离心脏干细胞。结果显示,分离出的细胞数约104个,细胞形态为圆形,镜下观察较亮,每个细胞上带有一个或者多个磁珠,细胞直径较小,约在4～10μm之间。成年小鼠心脏干细胞的培养分离的细胞先在有血清培养基条件下培养48小时以除去贴壁杂细胞,然后将悬浮细胞转移到另一新培养皿中,在改良神经干细胞培养基条件下继续培养。结果显示,在培养两天后,有少量细胞开始贴壁,培养五天后,较多细胞开始贴壁生长,七到十天后,形成小克隆,并可持续生长。成年小鼠心脏干细胞的鉴定新鲜分离的原代细胞和传代培养后的细胞采用免疫荧光法鉴定其表型,在激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光。结果显示,原代细胞和传代细胞表面都带有绿色荧光,证明其表型为c-kit,心脏干细胞传代培养后其表型没有发生变化。此结果说明,传代后细胞保持了干细胞特性,没有发生分化。第二部分成年小鼠心脏干细胞离子通道特性培养的小鼠CSCs在贴壁生长形成较大克隆之后,用0.25%胰蛋白酶消化,当大部分细胞回缩变圆之后,用血清终止消化。细胞一部分用于传代,一部分保存用于膜片钳实验。应用全细胞膜片钳记录方法,在电压钳模式下记录离子通道电流。结果显示,未分化的成年小鼠心脏干细胞上存在离子电流。我们记录到两种类型的电流,一种为外向电流,激活速度较慢,另一种为内向电流。大部分的心脏干细胞上所记录到的电流为外向电流,激活速度缓慢,呈电压依赖性,具有非失活特性。此外向电流对TEA敏感,能被TEA可逆性的抑制,该电流为延迟整流钾电流（IKDR）。结论:（1）采用胶原酶酶解,免疫磁珠分离法分离,能够分离出较纯的,数目较多的心脏干细胞;（2）分离出的心脏干细胞具有再生和克隆能力;（3）新鲜分离的心脏干细胞具有c-kit表型,传代培养后c-kit表型依然存在;（4）未分化的成年小鼠心脏干细胞上存在延迟整流钾电流（IKDR）。

关键词：心脏干细胞分离和培养免疫磁珠分离法延迟整流钾电流免疫细胞化学 c-kit 离子通道 Langendorff灌流 CSCs IKDR

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双阴性选择法纯化培养人骨髓多能成体祖细胞

第一军医大学学报 2005年第5期25卷 535-537页

作者：慕宁高毅唐力军南方医科大学珠江医院普外科广东广州510282

目的建立体外分选纯化及培养人骨髓来源多能成体祖细胞(MAPCs)的方法.方法取健康成人志愿者适量骨髓采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞,贴壁培养后,将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45、血糖蛋白A(GlyA)免疫微磁珠(miniMACS)负分选,流式... 详细信息

目的建立体外分选纯化及培养人骨髓来源多能成体祖细胞(MAPCs)的方法.方法取健康成人志愿者适量骨髓采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞,贴壁培养后,将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45、血糖蛋白A(GlyA)免疫微磁珠(miniMACS)负分选,流式细胞术鉴定分选后细胞纯度;对传代到不同阶段的细胞进行CD45、GlyA流式细胞分析,初步了解MAPCs在培养、增殖过程中的免疫学稳定性.结果通过miniMACS分选,平均每1×106/ml骨髓贴壁细胞可分选出约(5～10)×104/ml的MAPCs,分选前后细胞活力分别为(96.7±1.7)%和(96.0±2.4)%,无明显差异;自制的培养基培养分选后的MAPCs生长良好,最长传代到第16代;流式细胞仪分析获取的CD45、G1yA-细胞纯度大于98%;流式细胞仪分析传代第4、8、12代MAPCs,CD45-、G1yA-细胞纯度大于98%.结论CD45、GlyA miniMACS负分选可从骨髓中分离高纯度的MAPCs;MAPCs在本室自制的人MAPCs培养基中体外有较强的增殖能力,且能保持较长时间的稳定状态.

关键词：人骨髓来源多能成体祖细胞免疫磁珠分离法分离纯化细胞培养流式细胞术

人骨髓来源的多能成体祖细胞在体外定向诱导分化为肝样细胞的实验研究

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人骨髓来源的多能成体祖细胞在体外定向诱导分化为肝样细胞的实验...

作者：唐力军第一军医大学

学位级别：硕士

肝炎、肝硬化及肝癌等肝脏疾病所至的终末期肝功能障碍，目前最有效的治疗手段是原位肝移植(OLT)。然而，由于供体的缺乏、免疫排斥和高额费用等问题，OLT的广泛应用受到了限制。杂交型生物人工肝(HBAL)的目的是使终末期肝病病人桥接(br... 详细信息

肝炎、肝硬化及肝癌等肝脏疾病所至的终末期肝功能障碍，目前最有效的治疗手段是原位肝移植(OLT)。然而，由于供体的缺乏、免疫排斥和高额费用等问题，OLT的广泛应用受到了限制。杂交型生物人工肝(HBAL)的目的是使终末期肝病病人桥接(bridge)肝移植，而且肝细胞具有强大的再生能力，临时应用生物人工肝也可以解决急性肝功能的失代偿，促进肝细胞再生，部分患者肝功能完全自然恢复，病情康复。但由于作为HBAL核心生物材料的肝细胞来源问题未得到根本解决，使HBAL的临床应用远未达到理论上的预期效果。研究证明人骨髓来源的多能成体祖细胞(MAPCs)具有向肝样细胞分化的潜能，由于其具有易于调控、供源丰富、容易获取、有自体供源、避免免疫排斥等优点，因此，有望成为理想的肝组织工程细胞来源。第一部分：人骨髓来源的多能成体祖细胞分离纯化及体外培养的实验研究目的建立体外分选纯化人MAPCs的方法，用自行配制的细胞培养基对MAPCs进行体外培养，了解其生长、增殖特性。方法取志愿者适量骨髓后采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞，对单个核细胞行贴壁培养后，将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45、GlyA免疫微磁珠负分选，流式细胞仪鉴定分选后细胞纯度;培养观察细胞生长情况，对传代到不同阶段的细胞进行CD45、GlyA流式细胞分析，初步了解MAPCs在培养、增殖过程中的免疫学稳定性。结果 (1)通过MACS分选，平均每1×10／ml骨髓贴壁细胞可分选出约5—10×10／ml数量级的MAPCs，分选前后细胞活力分别为(96.7±1.7)％和(96.0±2.4)％，无明显差异;(2)用我们自制的培养基培养分选后的MAPcs，细胞生长良好，最长传代到第16代;(3) 流式细胞仪分析获取的CD45一、GlyA一细胞纯度大于98%;流式细胞仪分析传代第4、8、12代MA卫Cs，eD45一、GlyA一细胞纯度大于95%。结论(1) CD45、GlyA免疫微磁珠负分选可从骨髓中分离高纯度的M妙cs;(2)MAPcs在体外有较强的增殖能力，且能保持较长时间的稳定状态;(3)我们自行研制的人MAPCs培养基能成功体外培养 MAPCS。第二部分:人骨髓来源的多能成体祖细胞在不同诱导条件下向肝样细胞分化的实验研究目的探索人骨髓来源MAPCs在不同条件下诱导分化为肝细胞的可行性;摸索并确立骨髓MAPCs诱导为肝细胞的适当培养方法及条件，建立一个获得“骨髓源MAPCs”的成熟技术平台，为其在组织工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。方法(一)分组:A组:H邵(Zong/ml)、B组:FGF一4(10ng/ml)、C 组:HGF(Zong/ml)+FGF一4(long/ml)、D组:24小时70%肝叶切除兔门静脉血清(RPVS，10%浓度)诱导分化MAPCs，E组(阳性对照组): L一02人肝细胞株、F组(阴性对照组):未加任何诱导因素的MAPCs;(2)免疫细胞化学、免疫荧光化学鉴定各组不同诱导分化阶段细胞的 ALB、AFP、CK一18、CK一19等肝细胞特征的表型变化并计数阳性细胞比率;(3)RT一 CR检测A、B、C组不同诱导分化阶段细胞的ALB、AFP、 e玲18、eK一19的mRNA转录;(4)westem blot检测B、e组诱导分化第21天、35天后细胞的ALB的表达。结果(l)免疫细胞化学、免疫荧光化学结果:ALB、CK-18在A、 B、c、D、E组中基本为阳性着色;cK一19均为阴性着色，仅D组有阳性着色;AFP作为早期不成熟肝细胞的一个标志，在A、B、C组的诱导早期基本为阳性着色，在诱导中、晚期基本为阴性着色，仅D组在诱导中、晚期有阳性着色。计数阳性细胞比率显示:HGF及FGF一4均能诱导 MAPcs向肝样细胞分化，HGF+FGF一4诱导强于二种细胞因子单独诱导，我们自行制作的即VS诱导分化能力最强，各种肝细胞表型标志表达的阳性率最高;(2)RT一CR结果:作为不成熟肝细胞表型的AFP，在诱导分化的第7天，A、B、C组mRNA均有阳性表达，CK-19在分化的第 21天mRNA均为阴性;作为成熟肝细胞表型的ALB及CK一18，各组在不同时间段mRNA的表达基本都为阳性;(3) Westemblot检测结果:B、 C组在诱导分化第21天、35(38)天，ALB均有阳性表达。结论(l)人骨髓来源的MAPCs具有向肝样细胞分化的潜能;(2) HGF及FGF一4具有诱导人骨髓来源的MAPCs向肝样细胞分化的能力， HGF+FGF一4诱导强于二种细胞因子单独诱导;(3)24小时70%肝叶切除兔门静脉血清(对Vs)具有诱导人骨髓来源的MAPCs向肝样细胞分化的能力，且强于细胞因子诱导。

关键词：人骨髓来源多能成体祖细胞免疫磁珠分离法分离纯化细胞培养流式细胞仪肝细胞生长因子成纤维生长因子-4 24小时70%肝叶切除兔门静脉血清细胞分化