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免疫磁分离技术在E.coli O157∶H7检测中的应用

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光谱学与光谱分析 2009年第10期29卷 2614-2618页

作者：唐倩倩王剑平叶尊忠盖玲应义斌浙江大学生物系统工程与食品科学学院浙江杭州310029

免疫磁分离(i mmunomagnetic separation)技术因其具有选择性好、特异性强、能起到浓缩的作用,已与其他快速检测方法如电化学、光学等方法连用,应用于食品、环境卫生检测等领域。免疫磁分离技术是目前最有推广价值的技术之一。文章通过... 详细信息

免疫磁分离(i mmunomagnetic separation)技术因其具有选择性好、特异性强、能起到浓缩的作用,已与其他快速检测方法如电化学、光学等方法连用,应用于食品、环境卫生检测等领域。免疫磁分离技术是目前最有推广价值的技术之一。文章通过比较不同的E.coli O157∶H7-免疫磁珠(immunomagnetic beads,I MB)浓度配比、E.coli O157∶H7与Bacillus subtilis不同的体积比下的免疫磁分离的捕获率,得出当E.coli O157∶H7-I MB浓度配比为1∶30时,捕获率近100%,即所有的目标菌均可被捕获到;在总体积不变、IMB的加入量一定的情况下,随着Bacillus subtilis比例的增加,捕获率出现先下降后上升的情况。同时,将IMS与ATP生物发光法结合起来,对不同浓度的E.coliO157∶H7进行了检测,得出该方法与传统的平板培养法具有很好的线性相关性,则R2=0.9882,检测限可低达102CFU.mL-1。

关键词： E.coliO157∶H7 免疫磁分离 ATP生物发光捕获率菌落计数

食品中志贺氏菌快速检测免疫磁分离样品前处理技术研究

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计量学报 2023年第3期44卷 326-333页

作者：李静雯陈尔凝康福英洪甜富迎辉杜美红北京市科学技术研究院分析测试研究所(北京市理化分析测试中心) 北京100089 北京国际工程咨询有限公司北京100055

采用Protein A磁珠与志贺氏菌混合血清制备抗志贺氏菌多靶标免疫磁珠,建立了25 mL志贺氏菌免疫磁分离体系,并通过测定代表性食品(牛奶、水果、面包)中志贺氏菌生长曲线,设计食品样品前处理可行性技术方案,与环介导等温扩增(LAMP)检测技... 详细信息

采用Protein A磁珠与志贺氏菌混合血清制备抗志贺氏菌多靶标免疫磁珠,建立了25 mL志贺氏菌免疫磁分离体系,并通过测定代表性食品(牛奶、水果、面包)中志贺氏菌生长曲线,设计食品样品前处理可行性技术方案,与环介导等温扩增(LAMP)检测技术整合进行了食品中痕量志贺氏菌快速检测验证。结果显示:多靶标免疫磁珠能同时捕获福氏、宋内氏、鲍氏、痢疾氏等4种志贺氏菌,捕获效率为35%~94%,非特异性小于1%(金黄色葡萄球菌10%除外),1~2×10^(1)CFU志贺氏菌在25 mL纯牛奶、25 g梨/面包+25 mL志贺氏菌增菌肉汤基础中,通过6 h培养+免疫磁分离的策略可获得10^(2)CFU/mL以上的志贺氏菌,将志贺氏菌检测样品前处理时间由48 h缩短至8 h内,并能够满足后续检测技术检出限的需求,实现了食品中志贺氏菌的快速检测。

关键词：计量学食品检测志贺氏菌免疫磁分离捕获效率 Protein A磁珠多价血清

基于免疫磁分离和酶催化放大的化学发光免疫传感器测定人血清中癌胚抗原的含量

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理化检验（化学分册） 2022年第7期58卷 745-751页

作者：字琴江吴凡卢朝粉李佳昕刘梦婷周川华云南大学化学科学与工程学院国家级化学化工实验教学中心洱源671200 洱源县检验检测院洱源671200

基于免疫磁分离和酶催化放大策略,构建了一种用于测定人血清中癌胚肮原(CEA)含量的化学发光免疫传感器。利用抗原-抗体的特异性结合,将磁球作为免疫反应的固相载体去捕获癌胚抗原(CEA),并通过在免疫磁球表面负载辣根过氧化酶(HRP)作为... 详细信息

基于免疫磁分离和酶催化放大策略,构建了一种用于测定人血清中癌胚肮原(CEA)含量的化学发光免疫传感器。利用抗原-抗体的特异性结合,将磁球作为免疫反应的固相载体去捕获癌胚抗原(CEA),并通过在免疫磁球表面负载辣根过氧化酶(HRP)作为检测标记物,形成磁性免疫夹心复合物。通过HRP对过氧化氢的催化作用,氧化鲁米诺产生较强的化学发光信号,根据化学发光强度来定量CEA。结果显示:CEA的质量浓度在0.05~80.00μg·L^(-1)内与其对应的化学发光强度呈线性关系,检出限为4.5 ng·L^(-1);对样品进行回收试验,回收率为97.0%~100%。与其他固相载体和化学发光免疫传感器相比,该方法检测CEA的化学发光强度更强,并且具有更宽的线性范围和更低的检出限。

关键词：癌胚抗原免疫磁分离酶催化放大化学发光免疫传感器

免疫磁分离和可视化金纳米杂交探针法快速检测婴幼儿配方乳粉中的阪崎克罗诺杆菌

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食品科学 2021年第16期42卷 224-232页

作者：姜毓君杨涛满朝新周文琦王蕊陈思涵杨鑫焱付世骞高平娉任玉伟张微东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室黑龙江哈尔滨150030

利用免疫磁分离和金纳米杂交探针策略,开发一种快速和灵敏的可视化检测婴幼儿配方乳粉(powdered infant formula,PIF)中阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)方法。抗体功能化的磁颗粒捕获C.sakazakii,金纳米探针对聚合酶链式反应的... 详细信息

利用免疫磁分离和金纳米杂交探针策略,开发一种快速和灵敏的可视化检测婴幼儿配方乳粉(powdered infant formula,PIF)中阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)方法。抗体功能化的磁颗粒捕获C.sakazakii,金纳米探针对聚合酶链式反应的产物进行分析,这种探针法可以替代传统的电泳。免疫磁颗粒是由100μL磁颗粒、120μL碳化二亚胺盐酸盐、80μL C.sakazakii单克隆抗体和体积分数0.02%的吐温-20制备。特异性检测中仅有C.sakazakii是阳性结果。在纯培养基和不经预富集的人工污染PIF中,分别能检测到10^(2) CFU/mL和10^(3 )CFU/g的C.sakazakii。经过3 h的预富集,此方法可以在PIF中检测到低至4.5×10^(1) CFU/g的C.sakazakii。可视化检测、电泳和紫外扫描光谱结果一致。因此,免疫磁分离和金纳米探针的方法可以替代凝胶电泳,对于快速检测C.sakazakii具有重要的意义。此方法将有助于检测PIF样本的C.sakazakii。

关键词：阪崎克罗诺杆菌免疫磁分离金纳米颗粒婴幼儿配方乳粉可视化检测

免疫磁分离结合胶体金免疫层析法快速检测大肠杆菌O157∶H7

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分析化学 2013年第12期41卷 1812-1816页

作者：崔希熊齐荣熊勇华山珊赖卫华南昌大学食品科学与技术国家重点实验室中国检验检疫科学研究院食品安全研究所

以抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体偶联磁珠制得免疫磁珠;以胶体金标记的抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体为标记抗体,抗大肠杆菌O157∶H7多克隆抗体和驴抗鼠二抗分别作为检测线和质控线成分制备胶体金免疫层析试纸条。将免疫磁珠分离和胶体... 详细信息

以抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体偶联磁珠制得免疫磁珠;以胶体金标记的抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体为标记抗体,抗大肠杆菌O157∶H7多克隆抗体和驴抗鼠二抗分别作为检测线和质控线成分制备胶体金免疫层析试纸条。将免疫磁珠分离和胶体金免疫层析法相结合应用于大肠杆菌O157∶H7的现场快速检测中。结果表明:1 mL 7.6×103CFU/mL菌液经过免疫磁珠分离富集后,用胶体金免疫层析法检测可得到阳性结果。对于10 CFU/g大肠杆菌O157∶H7污染的食品样本,经过6 h预增菌,免疫磁珠分离和胶体金试纸条检测72 min即可检出。本方法的建立对于食品中有害物质的现场快速检测具有重要意义。

关键词：免疫磁分离胶体金免疫层析大肠杆菌O157∶H7

免疫磁分离技术结合阻抗测量法快速检测禽流感病毒

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分析化学 2013年第6期41卷 817-821页

作者：颜小飞汪懋华温新华安冬中国农业大学教育部现代精细农业系统集成研究重点实验室

采用免疫磁分离和阻抗测量技术联用的方法,实现了对禽流感H5亚型病毒的特异性快速检测。将偶联生物素的H5抗体固定于链霉亲和素修饰的纳米磁珠表面,制备成免疫磁珠,用于样品中禽流感H5N1病毒的分离和浓缩。使用金叉指阵列微电极测量样... 详细信息

采用免疫磁分离和阻抗测量技术联用的方法,实现了对禽流感H5亚型病毒的特异性快速检测。将偶联生物素的H5抗体固定于链霉亲和素修饰的纳米磁珠表面,制备成免疫磁珠,用于样品中禽流感H5N1病毒的分离和浓缩。使用金叉指阵列微电极测量样品阻抗,在特征频率(100 kHz)下,阻抗模值随样品中H5N1病毒浓度增加而增大。研究了抗体浓度、免疫反应时间和磁分离时间对阻抗信号的影响,结果表明,在优化的实验条件(抗体浓度0.25 g/L、免疫反应时间60 min、磁分离时间3 min)下,纯病毒样品和拭子样品中H5N1病毒浓度分别在2!1～24HA unit/50μL和20～24HA unit/50μL范围时,病毒浓度对数值与阻抗信号值呈线性相关关系,检出限分别为0.5 HA unit/50μL和2 HA unit/50μL。

关键词：免疫磁分离阻抗测量叉指阵列微电极禽流感病毒

三种食源性致病菌免疫磁分离—环介导等温扩增（IMS-LAMP）检测体系的构建及应用

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三种食源性致病菌免疫磁分离—环介导等温扩增（IMS-LAMP）检测体...

作者：赵青花南昌大学

学位级别：硕士

食品在生产、加工、包装、销售、烹调等众多环节都可能被食源性致病菌污染,食源性致病菌已经成为引起食品安全问题的重要因素。副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌以及河流弧菌都是常见的食源性致病菌,误食后轻则使人腹泻腹痛,严重时甚... 详细信息

食品在生产、加工、包装、销售、烹调等众多环节都可能被食源性致病菌污染,食源性致病菌已经成为引起食品安全问题的重要因素。副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌以及河流弧菌都是常见的食源性致病菌,误食后轻则使人腹泻腹痛,严重时甚至会造成死亡。目前其检测方法大多存在所需时间久,需要复杂、昂贵的检测设备以及操作繁琐的问题,因此急需建立一种方便快捷的方法来检测这些食源性致病菌。免疫磁珠分离(Immunomagnetic separation,IMS)技术将磁珠的优点与免疫学反应的高度特异性特点结合起来,可以将目标菌从复杂的样品基质或增菌液中直接分离、富集出来,有效地消除了基质干扰、有利于检测效率的提高,是对样品进行前处理的一种简单有效的方法。本文所用的单克隆抗体VF-H11与副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌、河流弧菌等均有结合活性,将其与磁珠偶联后,可以对多种弧菌进行捕获。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法具有特异性强、扩增效率高、反应快速、检测方法简单以及无需复杂设备等特点,非常适合对食源性致病菌进行快速检测。本研究将免疫磁分离技术与环介导等温扩增方法结合起来,建立了食源性致病菌的免疫磁分离-环介导等温扩增(IMS-LAMP)检测方法,具有简便、快速、灵敏度高、便于现场检测的特点。具体的实验结果如下:(1)建立副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌及河流弧菌免疫磁分离方法。采用聚乙烯亚胺-戊二醛介导系统合成免疫磁珠,副溶血性弧菌免疫磁珠、非O1/O139群霍乱弧菌免疫磁珠及河流弧菌免疫磁珠制备时,1 mg 250 nm羧基化磁珠的最佳抗体添加量分别为125、100、100μg。同时对副溶血性弧菌免疫磁珠、非O1/O139群霍乱弧菌免疫磁珠及河流弧菌免疫磁珠的富集条件进行了优化,最佳的免疫磁珠添加量分别为0.6、0.6、0.8 mg,最佳捕获时间均为45 min。当杂菌浓度高于目标菌约10倍时,其捕获效率几乎不变,有较强的抗干扰能力,同时当体系中菌液浓度为10 CFU/m L时,仍然能够捕获,具有良好的灵敏度。(2)建立副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌及河流弧菌环介导等温扩增检测方法。通过NCBI数据库选取常见弧菌的Tox R蛋白序列,经过多序列比对后选择可变区的蛋白序列,进一步确定核酸序列后通过在线网站https://primerexplorer.jp/e/index.html设计特异性的扩增引物并对引物进行筛选,之后通过优化反应过程中的Mg浓度、酶浓度、反应温度及反应时间等条件,建立LAMP反应体系,并对各引物的特异性及灵敏度进行检测。结果表明副溶血性弧菌LAMP最优反应体系如下:6 m M Mg,0.32 U/μL酶,反应温度63.5℃,30 min扩增时间;非O1/O139群霍乱弧菌LAMP最佳反应体系如下:4 m M Mg,0.32 U/μL酶,反应温度60.3℃、30 min扩增时间;河流弧菌LAMP最优反应体系如下:4 m M Mg,0.24 U/μL酶,反应温度为63℃、40 min扩增时间。三种体系具有良好的特异性,副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌以及河流弧菌纯培养物的灵敏度分别为1.9×10、6.2×10、7×10CFU/m L。(3)副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌及河流弧菌免疫磁珠-环介导等温扩增检测方法的建立。将之前建立的免疫磁分离方法与环介导等温扩增检测方法结合起来,使用荧光染料SYTO-9实现对检测结果的可视化检测。对水样及鱼样的检测灵敏度及反应的特异性进行研究。实验结果表明建立的IMS-LAMP检测方法具有良好的特异性。琼脂糖凝胶电泳结果表明副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌及河流弧菌的水样检测灵敏度分别为1.2×10、2.5×10、4.1×10 CFU/m L,鱼样检测灵敏度分别为3.2×10、2.5×10、4.1×10CFU/m L。使用荧光染料SYTO-9后,副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌及河流弧菌的水样检测灵敏度分别为1.2×10、2.5×10、4.1×10 CFU/m L,鱼样检测灵敏度分别为3.2×10、2.5×10、4.1×10 CFU/m L。荧光染料的使用使检测的灵敏度提高了10-100倍。

关键词：副溶血性弧菌非O1/O139群霍乱弧菌河流弧菌免疫磁分离环介导等温扩增

基于免疫磁分离和CdZnTe量子点的李斯特菌荧光免疫检测方法的研究

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基于免疫磁分离和CdZnTe量子点的李斯特菌荧光免疫检测方法的研究

作者：梁珊广东工业大学

学位级别：硕士

存在于食物中的李斯特菌(L.monocytogenes)引起的侵入性感染时常发生,婴儿和孕妇等免疫功能低下人群感染后一般会导致败血症和脑膜脑炎。相较于其他食源性致病菌,李斯特菌致病程度更严重,在某些暴发期间致死率接近30%。因此,李斯特菌的... 详细信息

存在于食物中的李斯特菌(L.monocytogenes)引起的侵入性感染时常发生,婴儿和孕妇等免疫功能低下人群感染后一般会导致败血症和脑膜脑炎。相较于其他食源性致病菌,李斯特菌致病程度更严重,在某些暴发期间致死率接近30%。因此,李斯特菌的灵敏、特异和快速检测对于确保食品安全和公众健康至关重要。细菌检测的金标准是平板菌落培养计数法,但这种方法既耗时又费力。传统方法的局限性促进了各种新兴病原菌检测技术和方法的发展,其中,荧光生物传感方法由于其定量性质和快速响应在检测李斯特菌中呈现出巨大的应用潜力。在本文中,首先培养目标致病菌并制备其免疫原,接着分别免疫豚鼠和新西兰大白兔,获得识别元件——抗李斯特菌抗体。接着通过正辛酸和饱和硫酸铵梯度盐析法纯化血清和获得特异性抗体,利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和BCA蛋白检测试剂盒鉴定抗体的纯度和相对分子质量,并采用酶联免疫吸附实验和FITC免疫荧光染色实验分析抗体的效价和特异性。第二步,合成超小顺磁性且在水溶液中分散性好的Fe3O4磁性纳米粒子(Fe3O4 NPs)和具有长波荧光发射的CdZnTe量子点(CdZnTe QDs)。将制备的豚鼠抗体通过静电作用结合到磁性纳米粒子上形成豚鼠抗体-磁性纳米粒子生物复合物(Fe3O4 NPs/pAb1);兔抗与CdZnTe量子点间通过酰胺键形成兔抗-CdZnTe量子点的生物共轭物(CdZnTe QDs/pAb2)。第三步,基于豚鼠抗体功能化的磁性纳米粒子和兔抗锚定的CdZnTe量子点设计一种用于检测痕量李斯特菌的荧光免疫传感方法。Fe3O4NPs/pAb1作为免疫磁分离器针对性捕获目标菌,CdZnTe QDs/pAb2作为特异性信号指示剂,磁分离器、信号指示剂和目标菌在抗原-抗体间作用力下形成稳定的夹心模式,最后通过荧光信号检测进行李斯特菌的定量分析。本文的研究结果表明:通过分析SDS-PAGE电泳图得到抗体的纯度相较于未纯化前有了显著提高,兔和豚鼠抗体效价分别超过1:256000和1:64 000。所制备的兔抗和豚鼠抗体具有效价高、特异性好和灵敏度高等特点。优化检测条件后,所提出的荧光免疫传感方法对李斯特菌的特异性检测具有1至109 CFU mL-1的宽检测范围和1 CFU mL-1的低检测限(LOD),实现了对李斯特菌异常灵敏的检测。李斯特菌在水和巴氏杀菌牛奶样品中的加标回收率在91-111%(RSD免疫传感方法对目标菌的检测耗时60 min,实现了复杂样品中的快速准确测定。此外,由于具有长波荧光发射的CdZnTe QDs/pAb2的指示和超小的顺磁性Fe3O4 NPs/pAb1的磁分离,所构建的免疫传感策略对生物基质具有优异的抗干扰性能。综上所述,高灵敏性、强特异性和较好抗干扰性的免疫传感方法在痕量李斯特菌测定中显示出巨大的潜力。有意义的是,本工作提出的免疫传感策略具有普适性,通过简单地替换特异性抗体即可用于其他食源性病原体检测。最后对全文总结如下:1.基于免疫磁分离和抗体修饰的长波荧光发射的CdZnTe量子点指示剂构建了免疫分析策略。2.该荧光免疫传感方法具有操作简单、耗时少、灵敏度高、对生物基质抗干扰性能优异等优点。3.本工作提出的免疫分析策略具有普遍适用性,可通过简单地替换特异性抗体,应用于其他食源性病原体检测。4.在实际应用中显示出检测李斯特菌的巨大潜力,对控制食源性疾病的爆发具有重要意义。

关键词：免疫磁分离量子点指示痕量检测特异性李斯特菌

海产品中霍乱弧菌免疫磁分离和环介导等温扩增快速检测方法的建立

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中国食品学报 2015年第2期15卷 168-173页

作者：程晋霞曾静张西萌张蕾刘莉张海予北京出入境检验检疫局北京100026 北京农学院北京102206

目的:采用纳米免疫磁珠分离霍乱弧菌,建立霍乱弧菌环介导等温扩增检测方法,以缩短检测时间。方法:采用本实验室制备的霍乱弧菌单克隆抗体制备纳米免疫磁珠,特异性吸附霍乱弧菌,结合环介导等温扩增技术,建立霍乱弧菌快速检测方法。结果:... 详细信息

目的:采用纳米免疫磁珠分离霍乱弧菌,建立霍乱弧菌环介导等温扩增检测方法,以缩短检测时间。方法:采用本实验室制备的霍乱弧菌单克隆抗体制备纳米免疫磁珠,特异性吸附霍乱弧菌,结合环介导等温扩增技术,建立霍乱弧菌快速检测方法。结果:霍乱弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度103CFU/m L水平,对霍乱弧菌的捕获率最高达70%。免疫磁分离结合环介导等温扩增技术,在纯培养、无需增菌的情况下,检测灵敏度达到4.8×102CFU/m L菌液。通过测试102株霍乱弧菌和101株非目标菌,该检测方法均具有良好的特异性。在食品基质添加试验中,其检测限为1 CFU/25g样品,增菌时间缩短到8 h。结论:霍乱弧菌免疫纳米磁珠结合环介导等温扩增技术缩短了增菌时间。目标菌纯培养、无需增菌条件下,检测灵敏度达到4.8×102CFU/m L增菌液。人工添加样品,8 h增菌条件下,检测低限达到1 CFU/25 g样品。

关键词：免疫磁分离霍乱弧菌环介导等温扩增