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组织化学染色与免疫电镜双标记方法在检测大鼠脑干前包钦格复合体细胞色素氧化酶活性中的应用

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细胞与分子免疫学杂志 2017年第9期33卷 1177-1181页

作者：亢君君梁卫华黄晓峰刘莹莹第四军医大学神经生物学教研室陕西西安710032 第四军医大学病理与病理生理学教研室陕西西安710032

目的研究脑干前包钦格复合体(pre-B9t C)细胞色素氧化酶(COX)的活性变化。方法采用COX的组织化学染色与pre-B9t C的标记物神经激肽1受体(NK1R)纳米金-银加强免疫组织化学染色双标法,进行pre-B9t C特定神经核团尤其是不同亚细胞结构的CO... 详细信息

目的研究脑干前包钦格复合体(pre-B9t C)细胞色素氧化酶(COX)的活性变化。方法采用COX的组织化学染色与pre-B9t C的标记物神经激肽1受体(NK1R)纳米金-银加强免疫组织化学染色双标法,进行pre-B9t C特定神经核团尤其是不同亚细胞结构的COX活性检测,并进行COX活性的半定量分析。结果光镜下NK1R免疫反应性(NK1R-ir)产物主要分布于pre-B9t C神经细胞膜,清晰勾勒神经元轮廓,COX组织化学染色呈棕色,弥漫表达于NK1R-ir神经元胞质及突起内。电镜下NK1R-ir金颗粒主要分布于pre-B9t C神经元胞体和树突膜内表面,胞质内也可见金颗粒标记。pre-B9t C神经元不同亚细胞结构(胞体、轴突终末、树突)线粒体的形状和分布均有不同,在胞体和轴突终末线粒体多为圆形和椭圆形,在树突则以长杆状线粒体多见,胞体线粒体多为管泡状嵴,而板层嵴线粒体以轴突终末和树突多见。轴突终末内线粒体多聚集分布,树突内线粒体多近胞膜散在分布,但在突触部位,线粒体分布密集,且局部膨大接近突触后膜,这与突触的信息传递功能需要大量ATP产生密切相关。COX活性反应产物分布于线粒体嵴上,线粒体嵴电子密度不同表明COX活性不同。轴突终末和树突线粒体COX活性明显高于胞体。结论 pre-B9t C神经元不同亚细胞结构能量代谢不同,其中轴突终末和树突线粒体COX活性明显高于胞体,尤其突触部位线粒体分布密集,且表达高COX活性。将COX组织化学技术和免疫电镜技术相结合,为检测区域性COX活性,尤其是区域内不同亚细胞结构的COX活性提供了新方法。

关键词：细胞色素氧化酶组织化学染色免疫电镜神经激肽1受体前包钦格复合体大鼠

轻链近端肾小管病超微病理特征及免疫电镜的诊断价值

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中华肾病研究电子杂志 2023年第2期12卷 67-73页

作者：侯晓涛陈建雄钟学军岳书玲王伶杨惠霏官阳周军南方医科大学基础医学院病理学系广州510515 南方医科大学南方医院病理科广州510515 广州金域医学检验中心广州510005 暨南大学附属复大肿瘤医院广州510063 武汉大学人民医院超微病理中心武汉430060

目的探讨轻链近端肾小管病(LCPT)的超微病理学特征及免疫电镜的诊断价值。方法选择本中心2018至2021年确诊或考虑轻链近端肾小管病病例140例,所有病例均进行免疫电镜检查,分析其超微病理特点,并探讨免疫电镜在轻链近端肾小管病诊断中的... 详细信息

目的探讨轻链近端肾小管病(LCPT)的超微病理学特征及免疫电镜的诊断价值。方法选择本中心2018至2021年确诊或考虑轻链近端肾小管病病例140例,所有病例均进行免疫电镜检查,分析其超微病理特点,并探讨免疫电镜在轻链近端肾小管病诊断中的作用。结果病例以中老年为主,男性患者明显多于女性,所有病例均存在一定蛋白尿。这些LCPT患者的超微结构可分结晶型及非结晶型两大类,共5个形态学变异体。免疫病理分析,Kappa型轻链稍多,结晶型LCPT中,Kappa型占绝对优势,高达87.80%。免疫电镜在4种免疫病理检查方法中检出率最高,达94.29%。结论LCPT具有独特的超微病理表现,电镜及免疫电镜在LCPT诊断、分型及鉴别诊断上具有关键的作用,尤其在早期结晶型LCPT中。

关键词：免疫电镜轻链近端小管病超微病理

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免疫电镜技术在植物衰老研究上的应用

吉林农业大学学报 2010年第S1期32卷 92-96页

作者：位昕禹黑龙江省农业科学院黑河分院黑河164300

综述了免疫胶体金技术的发展及其在科学研究上的应用,同时对国内外衰老研究上的进展做了回顾和总结,希望找到其二者的结合点,以期展望通过免疫胶体金技术在细胞亚显微结构上应用来在分子细胞学层面揭示植物衰老的机制。

关键词：免疫电镜衰老亚显微结构应用

冷冻超薄切片免疫电镜技术在肾活检病理中的应用

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肾脏病与透析肾移植杂志 2013年第3期22卷 293-298页

作者：朱小东曾彩虹刘志红南京军区南京总医院全军肾脏病研究所南京210016

目的:介绍冷冻超薄切片免疫电镜技术在肾活检病理中的应用。方法:肾活检组织经固定、蔗糖冷冻保护后,应用改良Tokuyasu技术冷冻超薄切片进行IgA、κ、λ、C3aR、Podocine、Nephrin免疫胶体金标记,结合免疫荧光标记,并与Epon812常规免疫... 详细信息

目的:介绍冷冻超薄切片免疫电镜技术在肾活检病理中的应用。方法:肾活检组织经固定、蔗糖冷冻保护后,应用改良Tokuyasu技术冷冻超薄切片进行IgA、κ、λ、C3aR、Podocine、Nephrin免疫胶体金标记,结合免疫荧光标记,并与Epon812常规免疫电镜技术及LR White Resin低温包埋免疫电镜技术进行对比,观察和比较冷冻超薄切片免疫电镜方法对肾活检组织超微结构、抗原保存及免疫标记的影响。结果:冷冻超薄切片肾组织免疫电镜微细结构保存良好,细胞内结构清晰,肾组织及细胞内抗原保存较好,但细胞内基质、糖原保存不理想。IgA、κ、λ免疫标记金颗粒密度高,分布特异、敏感性高。Epon812常规免疫电镜和LR White Resin低温包埋免疫电镜方法能很好地标记C3aR、Podocine、Nephrin较难检测的抗原。结论:肾活检冷冻超薄切片免疫电镜方法免疫标记特异度强、敏感度高,是研究肾脏病理超微结构较为理想的方法。

关键词：冷冻超薄切片免疫电镜肾活检 Tokuyasu技术胶体金 LR White树脂

人成牙本质样细胞表达三种温度感觉相关TRPV通道蛋白的免疫电镜研究

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人成牙本质样细胞表达三种温度感觉相关TRPV通道蛋白的免疫电镜研...

作者：闻雯天津医科大学

学位级别：硕士

目的牙本质敏感(dentin hypersensitivity,DH)是目前临床上最常见的引起患者不适感的病变之一,它是指暴露的牙本质对外界刺激产生短而尖锐的疼痛,并且不能归因于其它特定原因引起的牙体缺损或者病变。关于牙本质的感觉传导机制目前有3... 详细信息

目的牙本质敏感(dentin hypersensitivity,DH)是目前临床上最常见的引起患者不适感的病变之一,它是指暴露的牙本质对外界刺激产生短而尖锐的疼痛,并且不能归因于其它特定原因引起的牙体缺损或者病变。关于牙本质的感觉传导机制目前有3种学说:神经末端传导学说(the neural theory)、牙本质细胞传导学说(odontoblastic transduction theory)以及流体动力学说(hydrodynamic theory),近些年在流体动力学说的基础上发展形成了成牙本质细胞流体动力受体学说(odontoblast hydrodynamic receptor theory)。认为外界刺激到达牙本质以后引起牙本质小管内的液体流动不仅能传导到周围的神经末梢,人成牙本质细胞(human odontoblast cells,HODs)位于牙髓最外层,其突起深入牙本质小管内,表达瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)等离子通道蛋白而扮演感觉受体细胞的角色可以直接感知外界伤害性刺激。TRP家族已经被证实参与人感受外界的各种刺激包括机械刺激、化学刺激、温度、酸和渗透压的过程。瞬时受体电位香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid-1,TRPV1)是目前TRP家族中研究最为广泛的离子通道蛋白之一,又被叫做辣椒素受体,并已经被证实表达于体外培养的HODs-like细胞中,本课题组前期实验也已经证明瞬时受体电位香草酸受体2(transient receptor potential vanilloid-2,TRPV2)以及瞬时受体电位香草酸受体3(transient receptor potential vanilloid-3,TRPV3)在体外培养的HODs-like细胞的表达,TRPV2和TRPV3作为TRPV1的同源异构体,三者具有相似的结构,也具有相似的温度感知区间[TRPV1(>43°C)、TRPV2(>52°C)、TRPV3(33-39°C)],但是三者在HODs-like细胞内亚细胞结构层面上表达分布差异并不清楚。本实验在体外建立HODs-like细胞模型,通过免疫电镜(immunoelectron microscopy,IEM)以及定量IEM分析的方法观察比较研究TRPV1、TRPV2和TRPV3三种温度感觉相关离子通道蛋白在HODs-like细胞层面及其亚细胞水平上的表达和分布差异,为研究TRP通道在牙齿感觉传导作用机制的研究奠定基础。方法选取本课题组前期参照S.Gronthos的方法体外诱导人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells HDPCs)得到的冻存HODs-like细胞,细胞复苏后,选取第三代至第四代且生长状态良好的细胞作为实验对象,首先用免疫荧光(immunofluorescence,IF)以及逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法对体外诱导获得的HODs-like细胞进行鉴定,确定ODs内特征性蛋白质,巢蛋白(nestin)以及牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoproteins,DSPP)的基因以及蛋白质的表达。一部分细胞进行固定,利用IF的方法从细胞层面检测TRPV1,TRPV2和TRPV3三种通道蛋白的表达;选取同一批细胞进行裂解,逆转录RNA获取HODs-like细胞的DNA进行RT-PCR检测;另取同一批细胞固定,制取超薄切片进行IEM研究,在透射电镜放大一万倍下比较观察胶体金颗粒标记TRPV1,TRPV2和TRPV3三种通道蛋白抗原抗体复合物在HODs-like细胞亚细胞结构中的表达,并运用Mayhew提出的基于标记密度(labeling density,LD)与相对标记指数(relative labeling index,RLI)等数据的定量IEM方法,体视学估算以及统计学数据分析这三种离子通道蛋白在HODs-like细胞内细胞器层面上的分布情况。结果(1)IF结果显示HODs-like细胞为核偏位,单侧长突起的细胞,RT-PCR以及IF结果确定HOD-like细胞表达HODs特征性蛋白质,DSPP以及nestin的基因以及蛋白质,验证体外培养的HODs-like细胞具有HODs特性。同时RT-PCR、IF结果从细胞以及基因的层面确定HODs-like细胞内TRPV1,TRPV2和TRPV3三种通道基因以及蛋白的表达。(2)IEM结果证明在HODs-like细胞的亚细胞层面,如细胞质、细胞核、内质网(endoplasmic reticulum,ER)、线粒体、细胞突起和初级纤毛等细胞器内观察到胶体金颗粒标记的TRPV1,TRPV2和TRPV

关键词：人成牙本质样细胞瞬时感受器电位香草酸受体1 瞬时感受器电位香草酸受体2 瞬时感受器电位香草酸受体3 免疫电镜

伪狂犬病毒被膜蛋白VP22单克隆抗体的制备及免疫电镜方法的建立

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黑龙江畜牧兽医 2018年第11期 37-40,252页

作者：刘慧敏陈利红史智宾刘春国仇铮王靖飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

为了制备伪狂犬病毒（PRV）被膜蛋白VP22的单克隆抗体并建立免疫电镜方法,试验首先构建真核重组质粒pCAGGS-UL49,酶切及间接免疫荧光验证该质粒是否构建成功,然后用真核重组质粒以100μg/只的剂量免疫6周龄Balb/c雌性小鼠,经过4次免疫... 详细信息

为了制备伪狂犬病毒（PRV）被膜蛋白VP22的单克隆抗体并建立免疫电镜方法,试验首先构建真核重组质粒pCAGGS-UL49,酶切及间接免疫荧光验证该质粒是否构建成功,然后用真核重组质粒以100μg/只的剂量免疫6周龄Balb/c雌性小鼠,经过4次免疫后进行细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性克隆,抗体亚类试剂盒鉴别抗体亚类,收集第5,10,20代次的杂交瘤细胞上清液用ELISA法检测其效价,Western-blot法鉴定其特异性,将该抗体分别稀释50,100,200倍并作为一抗,免疫电镜检测VP22蛋白的表达效果。结果表明：获得1株稳定分泌VP22蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞（3D6）,该单克隆抗体的亚类为IgM,能与VP22蛋白发生特异性反应,100倍稀释的单克隆抗体可达到利用免疫电镜技术检测细胞内该蛋白表达的最佳效果。说明筛选得到的PRV被膜蛋白VP22单克隆抗体和建立的免疫电镜方法可用于该病毒的致病性及装配机制研究。

关键词：伪狂犬病毒被膜蛋白单克隆抗体细胞融合杂交瘤细胞免疫电镜

窖蛋白-1在小鼠不同发育时期成釉细胞中的免疫电镜观察

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郑州大学学报（医学版） 2018年第5期53卷 560-564页

作者：史璐白书锋李凌云冯海玲郑州大学第一附属医院牙体牙髓科郑州450052

目的:观察窖蛋白-1(Caveolin-1)在小鼠不同发育时期成釉细胞中的超微结构定位。方法:取胚胎发育第16.5天、第18.5天和出生第2.0天的C57BL/6小鼠下颌第一磨牙牙胚,HE染色、透射电镜观察不同发育时期成釉细胞的组织学形态及超微结构变化,... 详细信息

目的:观察窖蛋白-1(Caveolin-1)在小鼠不同发育时期成釉细胞中的超微结构定位。方法:取胚胎发育第16.5天、第18.5天和出生第2.0天的C57BL/6小鼠下颌第一磨牙牙胚,HE染色、透射电镜观察不同发育时期成釉细胞的组织学形态及超微结构变化,免疫电镜技术观察Caveolin-1在成釉细胞中的超微结构定位。结果:在各个发育阶段的成釉细胞细胞膜上均可见形态类似于胞膜窖的凹陷状结构,随着成釉细胞逐渐发育成熟,细胞器数量逐渐增多;在不同发育阶段的成釉细胞中均可见Caveolin-1免疫阳性颗粒,在成熟成釉细胞的内质网腔中也可检测到Caveolin-1免疫阳性颗粒。结论:在小鼠下颌第一磨牙牙胚成釉细胞中,Caveolin-1定位于成釉细胞的细胞膜及成熟成釉细胞的内质网中。

关键词：小鼠成釉细胞胞膜窖窖蛋白-1 免疫电镜

伪狂犬病毒pUL37、VP16、VP22单抗制备及免疫电镜方法的建立

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伪狂犬病毒pUL37、VP16、VP22单抗制备及免疫电镜方法的建立

作者：刘慧敏中国农业科学院

学位级别：硕士

伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的可感染多种哺乳动物的急性传染病。猪是PRV的自然宿主,感染可造成怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎,新生仔猪急性死亡。PRV属于疱疹病毒科,具有疱疹病毒... 详细信息

伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的可感染多种哺乳动物的急性传染病。猪是PRV的自然宿主,感染可造成怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎,新生仔猪急性死亡。PRV属于疱疹病毒科,具有疱疹病毒粒子的典型结构,其中,被膜层是一个复杂的蛋白网络,位于衣壳和囊膜之间。由UL37、UL48、UL49基因分别编码的被膜蛋白pUL37、VP16、VP22在病毒复制及装配中执行着不同的生物学功能,研究这些蛋白的功能对新的抗病毒靶点筛选具有重要意义。然而,对这些蛋白进行检测和定位的方法还没有建立起来。本研究,首先将UL49、UL48、UL37基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS,并采用KCl染色切胶法纯化原核表达的蛋白。分别用真核质粒和纯化的蛋白作为抗原,对Balb/c小鼠进行3次免疫。通过细胞融合及单抗特性鉴定试验获得1株稳定分泌VP22蛋白单抗的杂交瘤细胞株3D6;2株稳定分泌VP16蛋白单抗的杂交瘤细胞株1D4、4B6;3株稳定分泌pUL37蛋白单抗的杂交瘤细胞株1E2、2G2、11C3。间接免疫荧光（IFA）和Western-blot试验表明,抗体株均可与相应蛋白特异性结合;经抗体亚类试剂盒鉴定,单抗亚类均为IgMκ;ELISA检测单抗的效价,1D4为1:8000,11C3为1:6000,3D6为1:3000,4B6为1:4000,1E2、2G2为1:32000。测定PRV分离株HLJ-2013的病毒滴度,并将其（0.1 MOI）接种于易感性细胞PK15,16 h后收集细胞并制备免疫标记用超薄切片。将以上实验获得的单克隆抗体进行1:50,1:100,1:200稀释作为一抗,商品化抗鼠金标抗体1:100倍稀释作为二抗,进行感染细胞内伪狂犬病毒VP22、VP16、pUL37蛋白免疫标记和电镜检测。通过对免疫电镜结果的分析,筛选出在亚细胞水平结合特异性强的单克隆抗体株:3D6、1D4、1E2,其最佳稀释比例分别为:1:100、1:100、1:200。综上所述,本研究成功制备出针对PRV被膜蛋白pUL37、VP16、VP22的单克隆抗体,为PRV结构研究提供了生物材料;利用单克隆抗体建立了在PRV感染细胞内pUL37、VP16、VP22蛋白的免疫胶体金标记方法,为这几种蛋白的功能及被膜装配机制的研究提供了技术手段。

关键词：伪狂犬病毒被膜蛋白单克隆抗体免疫电镜

免疫电镜技术在微波辐射致大鼠海马突触结构损伤研究中的应用

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分析仪器 2014年第3期 62-65页

作者：汤先华单毅乔思默王丽峰海军总医院急救部急诊科北京100048 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京100850

目的:通过免疫电镜技术的应用,探讨微波辐射致大鼠海马突触结构损伤的机制。方法:采用30mW/cm2微波辐射Wistar大鼠,通过电镜观察辐射后6h海马突触结构改变;采用不同实验条件摸索胶体金标记的免疫电镜染色方法,并检测磷酸化突触素I和囊... 详细信息

目的:通过免疫电镜技术的应用,探讨微波辐射致大鼠海马突触结构损伤的机制。方法:采用30mW/cm2微波辐射Wistar大鼠,通过电镜观察辐射后6h海马突触结构改变;采用不同实验条件摸索胶体金标记的免疫电镜染色方法,并检测磷酸化突触素I和囊泡氨基酸递质转运体的改变。结果:30mW/cm2微波辐射后大鼠海马突触前囊泡堆积,活性区延长、突触后致密物增加、突触曲率增加,GABA囊泡转运体和磷酸化突触素I(Ser-553)在海马堆积囊泡中表达增加。结论:胶体金标记的免疫电镜染色操作过程中,固定液中戊二醛浓度和处理时间对其结果影响至关重要;微波辐射可引起突触结构损伤,Ser-553位点突触素I磷酸化参与微波辐射所致GABA能囊泡的堆积。

关键词：微波免疫电镜突触突触素I 囊泡递质转运体