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副猪嗜血杆菌黏附基因的表达和免疫原性鉴定

中国预防兽医学报 2010年第5期32卷 398-400页

作者：耿屹曹荣峰高晓宇李守军张桂红山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109 华南农业大学兽医学院广东广州510642

为获得副猪嗜血杆菌(HPS)黏附素基因的表达产物并对其进行免疫原性鉴定,本研究采用PCR技术扩增了HPS黏附素基因序列,将扩增产物与表达载体pET-32a(+)连接,得到表达重组质粒。通过EcoRⅤ和HindⅢ双酶切鉴定和测序确认正确后,将重组质粒... 详细信息

为获得副猪嗜血杆菌(HPS)黏附素基因的表达产物并对其进行免疫原性鉴定,本研究采用PCR技术扩增了HPS黏附素基因序列,将扩增产物与表达载体pET-32a(+)连接,得到表达重组质粒。通过EcoRⅤ和HindⅢ双酶切鉴定和测序确认正确后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析,获得了59.5ku的表达产物,与预期大小的黏附素蛋白分子量一致。经western blot检测,表达产物与HPS阳性血清反应,证明表达产物具有一定的免疫活性。提示本研究所表达的蛋白将有助于HPS的血清学诊断和疫苗的研发。

关键词：副猪嗜血杆菌黏附素基因表达免疫原性鉴定

淋病奈瑟菌表面蛋白A克隆、表达和免疫原性鉴定

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中国现代医生 2012年第3期50卷 9-10,15页

作者：杜蓬吴森林钟雅文孙爱华浙江医学高等专科学校浙江杭州310053

目的克隆并构建淋病奈瑟菌表面蛋白A(nspA)基因原核表达系统,并对重组产物rNspA进行免疫原性鉴定。方法采用PCR扩增nspA基因,构建nspA基因原核表达系统。SDS-PAGE检测目的重组蛋白rNspA表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rNspA,免疫双扩散... 详细信息

目的克隆并构建淋病奈瑟菌表面蛋白A(nspA)基因原核表达系统,并对重组产物rNspA进行免疫原性鉴定。方法采用PCR扩增nspA基因,构建nspA基因原核表达系统。SDS-PAGE检测目的重组蛋白rNspA表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rNspA,免疫双扩散试验及Western Blot鉴定rNspA的免疫原性。结果克隆的nspA基因与GenBank中相关序列相似性为100%,rNspA表达量为细菌总蛋白的40.1%,提纯的rNspA在SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带。rNspA抗血清免疫双扩散效价为1∶4,rNspA抗血清能有效识别rNspA。结论所构建的nspA基因原核表达系统能高效表达rNspA,表达的产物有良好的免疫原性,为淋病奈瑟菌免疫疫苗的研制奠定基础。

关键词：淋病奈瑟菌 nspA基因克隆/重组表达免疫原性鉴定

副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因的分段表达及其免疫原性分析

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畜牧兽医学报 2011年第12期42卷 1743-1749页

作者：辛伟李郁黄晓慧魏建忠安徽农业大学动物科技学院合肥230036

本研究旨在获得副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)转铁结合蛋白A基因(tbpA)的表达产物(TbpA),并对其免疫原性进行分析鉴定。采用生物信息学方法预测HPS的TbpA抗原表位,根据GenBank上发表的HPS(SH0165株)tbpA的核苷酸序列设计合成... 详细信息

本研究旨在获得副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)转铁结合蛋白A基因(tbpA)的表达产物(TbpA),并对其免疫原性进行分析鉴定。采用生物信息学方法预测HPS的TbpA抗原表位,根据GenBank上发表的HPS(SH0165株)tbpA的核苷酸序列设计合成3对引物,用PCR从安徽省HPS分离株(LJ3)tbpA中分段扩增出tbpA1、tbpA2和tbpA3,并连接到pET-32a(+)载体上,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE检测目的蛋白,Western blotting分析重组蛋白的免疫活性;通过小鼠免疫攻毒保护试验和血清杀菌力试验,鉴定重组蛋白的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力。结果表明,从HPS(LJ3)tbpA中扩增出与预期设计的1 140、897、666bp大小相符的3个片段(tbpA1、tbpA2、tbpA3),扩增产物连接载体得到重组质粒,在大肠杆菌中实现表达,获得大小为62、54、44ku的目的蛋白(rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3),均能与HPS阳性血清反应。rTbpA1与甲醛灭活菌体对小鼠免疫攻毒的保护率分别为20%和40%,但rTbpA1引起小鼠平均死亡时间显著延迟,兔抗rTbpA1与兔抗HPS(LJ3)血清具有同样显著的杀菌活性。结果显示,成功表达的rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3均具有良好的反应原性,其中rTbpA1更具有良好的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力,可望成为副猪嗜血杆菌病疫苗和血清学检测的候选成分。

关键词：副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因表达免疫原性鉴定

粉尘螨13.8 kDa溶菌酶的克隆表达、纯化鉴定及生物信息学分析

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中国人兽共患病学报 2016年第9期32卷 779-783,788页

作者：梁志林刘志刚邬玉兰陈思敏杨平常刘晓宇深圳大学过敏反应和免疫学研究所深圳518060

目的克隆表达粉尘螨13.8kDa溶菌酶(Bac)基因,纯化鉴定蛋白的过敏原性,并进行生物信息学分析。方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,根据已知基因序列设计引物,经RT-PCR扩增Bac基因片段,产物连入pMD-32T载体中。扩增后,利用限制性内切酶E... 详细信息

目的克隆表达粉尘螨13.8kDa溶菌酶(Bac)基因,纯化鉴定蛋白的过敏原性,并进行生物信息学分析。方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,根据已知基因序列设计引物,经RT-PCR扩增Bac基因片段,产物连入pMD-32T载体中。扩增后,利用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切将目的基因片段连接到Pet-44a表达载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达;间接ELISA法检验重组Bac蛋白特异性过敏原性;clustalw2进行同源性分析,MEGA5工具包来构建系统进化树,ProtParam Tools预测其理化性质,PSIPRED预测其二级结构,SWISS-MODEL预测其三级结构。利用网络服务器IEDB内相关软件和Preprod,对Bac蛋白T细胞抗原表位进行预测。用DNAStar对Bac的B细胞抗原表位进行预测。结果经测序鉴定,本研究成功克隆出了粉尘螨Bac基因,其开放阅读框396bp,编码131组氨基酸。将Bac基因导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后高效表达Bac重组蛋白。该蛋白主要以可溶性形式存在,蛋白分子量约14kDa。间接ELISA法证明Bac能与粉尘螨过敏患者血清IgE结合。测序发现本实验室克隆的粉尘螨Bac基因与GenBank上公布的GenBank KF113885.1同源性为96%。系统进化树结果显示粉尘螨与屋尘螨亲缘关系比较近。理化性质预测显示Bac蛋白质较稳定。二级结构及三级结构预测结果显示Bac的结构主要以无规则卷曲组成。T细胞抗原表位预测得到4个肽序列(6-14、38-46、85-99、122-130)。B细胞抗原表位预测得到6个肽序列(15-30、26-40、44-59、58-73、95-110、101-116)。结论成功克隆并表达了粉尘螨Bac,并证实重组Bac蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究尘螨过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。

关键词：粉尘螨 13.8kDa溶菌酶(Bac) 原核表达免疫原性鉴定生物信息学分析

家蚕蚕蛹过敏原表皮蛋白RR-2基序63前体(CPR63)的克隆表达、纯化鉴定及生物信息学分析

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免疫学杂志 2016年第7期32卷 565-569页

作者：梁志林李平刘志刚刘晓宇深圳大学过敏反应和免疫学研究所 518060

目的克隆表达家蚕蚕蛹表皮蛋白RR-2基序63前体（CPR63）基因,纯化鉴定蛋白的过敏原性,并进行生物信息学分析。方法合成家蚕蚕蛹CPR63蛋白的基因（ref｜NM_001173223.1｜）,将其连接至克隆载体p MD18-T,p MD18-T-CPR63阳性质粒与原核表... 详细信息

目的克隆表达家蚕蚕蛹表皮蛋白RR-2基序63前体（CPR63）基因,纯化鉴定蛋白的过敏原性,并进行生物信息学分析。方法合成家蚕蚕蛹CPR63蛋白的基因（ref｜NM_001173223.1｜）,将其连接至克隆载体p MD18-T,p MD18-T-CPR63阳性质粒与原核表达载体p ET-44a分别用限制性内切酶酶切,构建出重组表达质粒p ET-44a-CPR63,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达;Western blot检测重组CPR63蛋白特异性过敏原性;用clustalw2和MEGA5工具包进行同源性分析;用Prot Param Tools预测其理化性质;用PSIPRED和SWISS-MODEL预测其蛋白质结构。利用网络服务器IEDB、Preprod和DNAStar,对CPR63蛋白T、B细胞抗原表位进行预测。结果经测序鉴定,本研究成功克隆出了家蚕蚕蛹CPR63基因,其开放阅读框549 bp,编码182组氨基酸。通过大肠杆菌E.coli BL21（DE3）表达CPR63重组蛋白主要以可溶性形式存在,相对分子质量约20 000。Western blot显示重组CPR63能够与家蚕蚕蛹过敏患者血清Ig E结合。家蚕蚕蛹CPR63蛋白与黑脉金斑蝶表皮蛋白RR-2基序63（gb｜EHJ69818.1｜）同源性为85%。系统进化树结果显示家蚕蚕蛹与小菜蛾亲缘关系比较近。理化性质预测显示CPR63蛋白质较稳定。二级结构及三级结构预测结果显示CPR63的结构主要以无规则卷曲组成。T细胞抗原表位预测得到4个肽序列（5～13、20～28、51～59和87～95）。B细胞抗原表位预测得到4个肽序列（21～40、37～56、47～66和64～83）。结论成功克隆并表达了家蚕蚕蛹CPR63,并证实重组CPR63蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究家蚕蚕蛹过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。

关键词：家蚕蚕蛹表皮蛋白RR-2基序63前体(CPR63) 原核表达免疫原性鉴定生物信息学分析