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猪流行性腹泻病毒非结构蛋白Nsp8与宿主细胞互作蛋白的筛选与鉴定

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微生物学报 2024年第10期64卷 3932-3944页

作者：涂赟于瑞明张莉萍王永录潘丽刘霞杜晓华刘新生甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种能引起严重腹泻、脱水的肠道病毒,PEDV的广泛流行对生猪养殖产业造成巨大经济损失,目前仍无有效的预防和治疗手段。Nsp8是一种参与PEDV复制的重要非结构蛋白,其存在相互... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种能引起严重腹泻、脱水的肠道病毒,PEDV的广泛流行对生猪养殖产业造成巨大经济损失,目前仍无有效的预防和治疗手段。Nsp8是一种参与PEDV复制的重要非结构蛋白,其存在相互作用的宿主蛋白尚不清楚。【目的】筛选与PEDV Nsp8互作宿主蛋白,初步探究互作宿主蛋白对PEDV复制的影响,为寻找PEDV新的关键性治疗靶点提供理论基础。【方法】利用真核表达载体pcDNA3.1(+)成功构建PEDV Nsp8真核表达质粒,通过免疫共沉淀、质谱分析及激光共聚焦等技术筛选能够与其相互作用的宿主蛋白,进一步在LLC-PK细胞中通过过表达、敲低等方法探究互作宿主蛋白对PEDV复制的影响。【结果】质谱检测筛选到Nsp8潜在互作宿主蛋白36个,验证了宿主蛋白热休克蛋白成员8(heat shock protein member 8,HSPA8)与Nsp8相互作用,在LLC-PK细胞中过表达HSPA8能够剂量依赖性抑制Nsp8蛋白过表达,而且在蛋白质和转录水平显著剂量依赖性抑制PEDV复制;干扰内源性HSPA8表达能够显著促进PEDV复制,TCID50和间接免疫荧光试验检测(indirect immunofluorescent assay,IFA)结果进一步证明了HSPA8抑制PEDV复制。【结论】本研究筛选出PEDV Nsp8的互作宿主蛋白HSPA8,并且证明HSPA8能显著抑制PEDV复制,为设计以HSPA8为靶点的预防或治疗药物提供新思路。

关键词：猪流行性腹泻病毒 Nsp8 免疫共沉淀技术 HSPA8

DEAD-box RNA解旋酶5和转录因子12与肌萎缩侧索硬化症的关系

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解剖学报 2021年第5期52卷 698-705页

作者：林宝勇徐进超应涵韬蒋欣刘焕彩王箐王巧真陈燕春潍坊医学院生命科学与技术学院山东潍坊261053 潍坊医学院神经疾病与再生修复重点实验室山东潍坊261053 潍坊医学院基础医学院组织学胚胎学教研室山东潍坊261053

目的通过检测DEAD-box RNA解旋酶5(DDX5)和转录因子12(TCF12)在SOD1-G93A突变型肌萎缩侧索硬化症(ALS)转基因小鼠海马中表达情况及其相互作用关系,揭示DDX5和TCF12表达改变与ALS海马病变的关系。方法将42对SOD1-G93A突变型ALS转基因小... 详细信息

目的通过检测DEAD-box RNA解旋酶5(DDX5)和转录因子12(TCF12)在SOD1-G93A突变型肌萎缩侧索硬化症(ALS)转基因小鼠海马中表达情况及其相互作用关系,揭示DDX5和TCF12表达改变与ALS海马病变的关系。方法将42对SOD1-G93A突变型ALS转基因小鼠和野生型小鼠,按照95 d龄(发病早期)、108 d龄(发病中期)和122 d龄(发病晚期)分为3组,通过RT-PCR、Western blotting和免疫荧光双标记技术,检测DDX5和TCF12在海马中的表达情况,通过免疫共沉淀技术检测DDX5和TCF12蛋白之间是否具有相互作用。结果与同龄野生型小鼠相比,在SOD1-G93A突变型ALS转基因小鼠海马中DDX5和TCF12 m RNA无明显变化,而蛋白在95 d、108 d和122 d表达均上调,差异均有统计学意义。海马齿状回和海马本部均可见DDX5和TCF12阳性细胞,且DDX5和TCF12在海马神经元中表达。SOD1-G93A突变型ALS转基因小鼠海马中DDX5和TCF12免疫阳性反应均较同龄野生型小鼠增强。免疫共沉淀实验检测发现,DDX5和TCF12蛋白质之间存在相互作用。结论DDX5和TCF12蛋白在SOD1-G93A突变型ALS转基因小鼠海马组织中表达上调,DDX5和TCF12表达异常与ALS海马组织病变有关。

关键词：肌萎缩侧索硬化症 DEAD-box解旋酶5 转录因子12 海马免疫共沉淀技术 SOD1-G93A转基因小鼠

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蛋白质相互作用的研究方法

生物技术通报 2009年第1期25卷 50-54,68页

作者：陈谋通刘建军深圳市疾病预防控制中心深圳518020

随着基因组测序工程数量的增加,未知功能蛋白质测序工作也呈现指数式增长。生物学进程主要是由蛋白质执行和控制的,因此,阐明未知或已知蛋白质的生物学功能和从细胞水平上确定细胞机制,已成为蛋白质组学研究的主要目标。目前,随着酵母[1... 详细信息

随着基因组测序工程数量的增加,未知功能蛋白质测序工作也呈现指数式增长。生物学进程主要是由蛋白质执行和控制的,因此,阐明未知或已知蛋白质的生物学功能和从细胞水平上确定细胞机制,已成为蛋白质组学研究的主要目标。目前,随着酵母[1]、果蝇[2]、线虫[3]相互作用图谱的相继完成,蛋白质相互作用研究方法也不断发展和完善。综述了当前研究蛋白质相互作用的主要技术方法,包括酵母双杂交技术,GSTpull-down技术,免疫共沉淀技术和串联亲和纯化技术等多种研究方法,分析了各种技术方法的优缺点以及各种方法的改进,在试验中可根据不同的要求和目的选择适宜的方法。

关键词：蛋白质相互作用酵母双杂交免疫共沉淀技术串联亲和纯化技术

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蛋白质相互作用技术在分子水平的应用

生命科学 2024年

作者：韩镌竹杨文腰高铎辽宁省检验检测认证中心辽宁成大生物股份有限公司沈阳药科大学生命科学与生物制药学院

通过对蛋白质相互作用研究以阐明蛋白质所参与的功能复合物的组成、上下游信号通路的构成、寻找与目标蛋白质作用直接相关的酶或其作用的底物等。基于蛋白复合物在钠离子通道相关疾病中的调控作用，文章综述了蛋白质相互作用构建蛋白质... 详细信息

通过对蛋白质相互作用研究以阐明蛋白质所参与的功能复合物的组成、上下游信号通路的构成、寻找与目标蛋白质作用直接相关的酶或其作用的底物等。基于蛋白复合物在钠离子通道相关疾病中的调控作用，文章综述了蛋白质相互作用构建蛋白质关系的网络和生物学通路中涉及的体内和体外相关检测方法：酵母双杂交系统、双分子荧光互补、免疫共沉淀技术、融合蛋白Pull-Down技术、单分子下拉、高通量蛋白质芯片、微生物质谱、串联亲和蛋白纯化、以生物信息学为主的研究方法等技术以及它们之间相互验证，通过相关检测技术在大分子蛋白复合物中的应用并获得新的靶点。蛋白-蛋白相互作用是所有细胞过程的核心，是蛋白质执行功能的重要基础。蛋白相互作用的深入研究，以及对蛋白相关靶点的广泛研究，为靶点药物的研究提供了有力的支持。

关键词：蛋白质-蛋白质相互作用酵母双杂交系统双分子荧光互补免疫共沉淀技术串联亲和蛋白纯化

沙眼衣原体CT813与CREB3相互作用的鉴定

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沙眼衣原体CT813与CREB3相互作用的鉴定

作者：程永婷河北北方学院

学位级别：硕士

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)是严格活细胞内寄生、且具有独特的发育周期的微生物。通过性传播感染泌尿生殖道,可引起女性盆腔炎、宫外孕和不孕不育等,引起学者高度关注。CT感染开始于原体(EB)进入宿主细胞,在胞浆液泡内(包涵... 详细信息

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)是严格活细胞内寄生、且具有独特的发育周期的微生物。通过性传播感染泌尿生殖道,可引起女性盆腔炎、宫外孕和不孕不育等,引起学者高度关注。CT感染开始于原体(EB)进入宿主细胞,在胞浆液泡内(包涵体)迅速分化成网状体又称始体(RB),RB复制后分化成EB感染相邻细胞。CT的整个生物合成过程是在包涵体内完成的,为了维持自身发育生长,CT需通过包涵体膜与宿主细胞间进行物质交换与信息传递。在此过程中,包涵体膜发挥很重要的生物学作用。包涵体膜蛋白(inclusion membrane protein,Inc)是包涵体的重要组成成分,由衣原体基因编码,具有特异性的蛋白质。研究发现,Inc的N末端和C末端均在宿主细胞浆,N末端具有III型分泌信号,C末端至少具有两个跨膜螺旋亲水区域。当RB形成时,Incs可通过III型分泌系统(T3SS)分泌表达,对于衣原体的生长、发育发挥重要的作用,故对于Incs的研究尤为重要。目前推测CT有多于50个假定的包涵体膜蛋白。其中,CT813是被预测并经过证实的包涵体膜蛋白之一,初步研究揭示其在CT感染的泌尿系统疾病的女性中具有免疫原性并可诱导宿主产生免疫反应,但CT813的具体生物学功能尚不清楚。为此,我们对CT813进行了进一步研究,前期实验运用酵母双杂交技术筛选出与CT813相互作用的分子,包括环腺苷酸应答原件结合蛋白3(CREB3)、半乳糖凝集素-1(LGALS1)、核糖体蛋白L10a(RPL10a)和微管蛋白37E-16(RP1-37E16)。本研究采用细胞共定位技术与免疫共沉淀技术对CT813与CREB3分子间是否存在相互作用做进一步鉴定。首先,根据Genbank中CT813与CREB3的核酸序列设计引物,分别扩增目的片段CT813与CREB3,构建重组表达载体pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813与pcDNA3.1+/Flag-CREB3,采用双酶切、菌落PCR、基因测序对上述重组载体进行验证。其次,运用亚细胞共定位技术验证CT813与外源性的CREB3间是否存在相互作用。将重组表达载体pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813与pcDNA3.1+/Flag-CREB3共转染HeLa细胞(实验组),同时将pcDNA3.1+/Myc-His A空质粒与pcDNA3.1+/Flag-CREB3(对照组)共转染HeLa细胞,经过24h,固定(丙酮)、封闭(山羊血清)、一抗孵育(小鼠抗Myc单克隆抗体,兔抗CREB3单克隆抗体)、洗涤、二抗孵育(羊抗小鼠IgG-Cy3抗体,羊抗兔IgG-FITC抗体)、避光洗涤、染核(DAPI)、避光洗涤、封片(抗荧光淬灭剂封片),在激光共聚焦显微镜下观察,结果表明实验组中CT813显有红色荧光,CREB3显有绿色荧光且二者间发生重叠,重叠部分为黄色荧光;对照组中,CREB3显现绿色荧光,其与标签Myc没有发生重叠,实验组与对照组的结果CT813与外源性CREB3存在相互作用。再次,运用免疫共沉淀技术验证CT813与外源性的CREB3间是否存在相互作用。将重组表达载体pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813与pcDNA3.1+/Flag-CREB3(实验组)共转染HeLa细胞,将pcDNA3.1+/Myc-His A空质粒与pcDNA3.1+/Flag-CREB3,共转染He La细胞,将pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813转染HeLa细胞(对照组),经过48 h后将细胞裂解(冰上裂解30 min),离心,吸附(上清用Anti-c-Myc agarose吸附)、洗涤、制备样品、Western blot检测(电泳、转膜、封闭、孵育抗体、洗涤、孵育二抗、洗涤、ECL发光);未转染HeLa细胞裂解后做β-actin的Western blot检测(β-actin对照组)。结果显示:实验组中在33 kD与46 kD处分别具有条带,大小与CT813、CREB3的分子量相符;对照组中,空质粒与pcDNA3.1+/Flag-CREB3共转染组无条带,pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813转染组在33 kD处出现条带;β-actin组在43 kD即处有条带。由上说明CT813与外源性CREB3发生相互作用。最后,运用亚细胞共定位技术验证CT813与内源性的CREB3间是否存在相互作用。CREB3是亮氨酸拉链c AMP反应结合蛋白家族内的一种转录因子,位于内质网,故选取内质网钙联结蛋白(calnexin)作为参照。将HeLa细胞进行固定(丙酮)、封闭(山羊血清)、一抗孵育(小鼠抗calnexin单克隆抗体,兔抗CREB3单克隆抗体)、洗涤、二抗孵育(羊抗小鼠IgG-Cy3抗体,

关键词： CT813蛋白 CREB3蛋白包涵体膜蛋白细胞共定位技术免疫共沉淀技术

桑枝总生物碱促进肠Nesfatin-1苏木化修饰减少肝糖生成

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桑枝总生物碱促进肠Nesfatin-1苏木化修饰减少肝糖生成

作者：王艳萍重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分桑枝总生物碱减少肝糖生成与肠Nesfatin-1相关目的:探讨桑枝总生物碱(Sangzhi Alkaloid,SZ-A)对高脂及普食大鼠肝糖代谢的影响,并了解其与Neafatin-1关系。方法:将8周龄野生型(Sprague-Dawley,SD)健康雄性大鼠,分别进行普食(No... 详细信息

第一部分桑枝总生物碱减少肝糖生成与肠Nesfatin-1相关目的:探讨桑枝总生物碱(Sangzhi Alkaloid,SZ-A)对高脂及普食大鼠肝糖代谢的影响,并了解其与Neafatin-1关系。方法:将8周龄野生型(Sprague-Dawley,SD)健康雄性大鼠,分别进行普食(Normal chow diet,NCD)和高脂(High fat diet,HFD)喂养12周后分别予以生理盐水和桑枝总生物碱(200mg/kg)灌胃4周,即分为NCD Saline、NCD SZ-A、HFD Saline、HFD SZ-A四组。于每周测定体重、空腹与随机血糖变化,在第2周测定GTT,ITT测定在第3周进行,第4周测定摄食、肛温的变化。后处死大鼠,留取肝组织行HE染色、油红O染色和糖原过碘酸-雪夫(PAS)染色,观察肝脏形态,肝细胞脂肪变性以及肝糖原情况;采用Western Blot技术检测肝糖异生及胰岛素信号通路相关因子PEPCK、G6Pase、p-AKT、t-AKT、p-GSK3β、t-GSK3β、p-InsR、t-InsR 蛋白水平的变化。用 ELISA 法检测外周血Nesfatin-1表达水平;留取大鼠胃,小肠,结肠,肌肉,肝,下丘脑,胰腺组织,行Western Blot检测各部位NUCB2/Nesfatin-1的改变。结果:SD大鼠灌胃4周后,NCD SZ-A组与NCD Saline组相比,体重、摄食、空腹血糖、随机血糖,GTT、ITT,糖异生相关因子(PEPCK、G6Pase)及胰岛素信号通路相关因子(p-AKT、t-AKT、p-GSK3β、t-GSK3β、p-InsR、t-InsR),HE染色,油红染色以及糖原染色,血清中Nesfatin-1表达均无明显差异。HFD SZ-A组与HFD Saline组比较,随机血糖于第1周开始下降,第2周下降明显;空腹血糖于第3周开始下降;在第3周时,HFD SZ-A组较HFD Saline组体重增加缓慢;第4周时,HFD SZ-A组较HFD Saline组肛温增加,摄食无明显改变;胰岛素信号通路(p-AKT、t-AKT、p-GSK3β、t-GSK3β、p-InsR、t-InsR)增强,糖异生减弱(PEPCK、G6Pase);HE染色和油红染色减少,肝糖原减少;血清中Nesfatin-1升高。高脂组各部位组织行Western Blot后,HFD SZ-A组与HFD Saline组比较,显示仅小肠的NUCB2/Nesfatin-1表达增加,其余各部位无明显差异。结论:SZ-A通过促进小肠Nesfatin-1表达改善大鼠高脂诱导的胰岛素抵抗。第二部分十二指肠输注桑枝总生物碱通过激活肠迷走神经降低肝糖生成第一节桑枝总生物碱通过激活十二指肠Nesfatin-1降低肝糖生成目的:探讨SZ-A促进十二指肠NUCB2/Nesfatin-1表达对肝脏糖代谢的影响方法:雄性 SD和NUCB2/Nesfatin-1 基因敲除(NUCB2/Nesfatin-1 KO)大鼠高脂喂养12周,构建大鼠十二指肠灌注及颈动静脉插管系统,分为SD Saline、SD SZ-A、KO Saline、KO SZ-A四组。采用基础膜岛素钳夹技术,利用3-3H葡萄糖为示踪剂来评价各组大鼠糖代谢的变化。后处死大鼠,留取肠、肝组织,通过Western Blot、免疫组化(Immunohistochemistry staining,IHC)及免疫荧光(Immunofluorescence,IF)研究SZ-A对肝脏糖代谢的影响是否通过促进十二指肠NUCB2/Nesfatin-1表达的方式。结果:通过胰岛素钳夹实验观察到,SD输注SZ-A组GIR明显高于其他组,而HGP则明显低于其他组,HGP抑制率也明显高于其他组,各组大鼠GU无明显差异。和SD Saline组相比,SD大鼠灌注SZ-A后,肝脏Western Blot表现出胰岛素通路相关蛋白磷酸化增强,如:p-IR,p-AKT,p-GSK3β表达增高,并且,糖异生相关因子PEPCK及G-6-Pase蛋白减少。而在KO鼠的两组中,上述变化较SD鼠的两组明显减弱,变化无统计学意义。SD灌注SZ-A后,免疫组化(IHC)及免疫荧光(IF)结果显示十二指肠NUCB2/Nesfatin-1表达增加,KO鼠中灌注SZ-A则无此变化。结论:通过以上体内实验结果表明,SZ-A是通过促进十二指肠NUCB2/Nesfatin-1表达来对肝脏葡萄糖代谢进行调控的。第二节桑枝总生物碱通过肠迷走神经调节肝脏葡萄糖代谢目的:探讨十二指肠内输注SZ-A调节肝脏葡萄糖代谢的神经通路机制。方法:SD大鼠高脂喂养,时间为12周,构建大鼠颈动静脉插管及十二指肠灌注模型,根据灌注液的不同分为Saline、SZ

关键词：桑枝总生物碱 Nesfatin-1 胰岛素抵抗肝糖代谢 SZ-A 胰岛素钳夹 NUCB2/Nesfatin-1 肝糖代谢 SZ-A 胰岛素钳夹丁卡因肝糖代谢 Nesfatin-1 免疫共沉淀技术苏木化

三氯乙烯致L-02肝细胞毒性后SET与其它蛋白质相互作用研究

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三氯乙烯致L-02肝细胞毒性后SET与其它蛋白质相互作用研究

作者：杨亮华南理工大学

学位级别：硕士

三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是工业上广泛应用的一种有机溶剂,也是一种环境污染物。TCE主要通过呼吸道吸入和皮肤吸收进入人体产生职业性危害,吸收后主要蓄积于肝脏、脑、心脏等器官。体内外和动物实验证明TCE及其代谢产物可引起... 详细信息

三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是工业上广泛应用的一种有机溶剂,也是一种环境污染物。TCE主要通过呼吸道吸入和皮肤吸收进入人体产生职业性危害,吸收后主要蓄积于肝脏、脑、心脏等器官。体内外和动物实验证明TCE及其代谢产物可引起癌变、畸变及免疫毒性作用等。国际癌症研究署(IARC)在1995年对TCE致癌性分类做了修改,将其对人类非致癌改为―对人类可能致癌‖。SET(patient SE translocation,SET)蛋白是本课题组所确定的一个TCE致肝细胞毒性差异蛋白,它是一个重要的细胞因子,在基因表达、细胞凋亡及肿瘤发生方面的功能目前正越来越受到关注。本课题组前期通过TAP(串联亲和纯化)及质谱技术筛选出62个与SET相互作用的侯选蛋白,利用PICASSO软件进行分析,得出45个与SET具有GO共注释的蛋白质。本研究在此基础上,利用免疫共沉淀技术验证SET相互作用蛋白eEF1A1、eEF1A2,以及分析TCE作用对SET相互作用蛋白亚细胞定位和表达的影响,以探讨SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性中的作用。 1、SET与eEF1A1、eEF1A2相互作用的验证:培养L-02肝细胞,用2mmol/L TCE刺激人L-02肝细胞24h后,抽提染毒组总蛋白及正常组总蛋白,用SET抗体分别沉淀SET相互作用蛋白,然后用western blotting检测洗脱下来的蛋白复合物。结果表明SET与eEF1A1、eEF1A2在人肝细胞内确实存在相互作用,且TCE刺激肝细胞24h后,结合到SET上的eEF1A1蛋白量减少,eEF1A2蛋白量增多。提示着,三氯乙烯染毒L-02肝细胞后,SET蛋白表达量升高,有可能使得TSPY与eEF1A2相互作用能力增强,从而使其蛋白质合成功能增强,为肿瘤生成提供必需条件。 2、TCE作用下eEF1A1、eEF1A2蛋白肝细胞内分布变化:用2mmol/L TCE刺激人L-02肝细胞24h后,应用免疫荧光技术分别检测eEF1A1、eEF1A2蛋白在细胞内的表达和分布变化。结果表明:eEF1A1蛋白定位于细胞核、细胞质中,eEF1A2蛋白主要定位于细胞质中;与DMSO对照组相比,eEF1A2蛋白在肝细胞内的亚细胞定位发生了改变,细胞质中的部分eEF1A1蛋白转向了细胞核内。提示着,SET复合物中可能还包含eEF1A2,eEF1A2与SET结合在一起,与SET复合物一同定位于细胞质中。TCE刺激肝细胞后,包含NM231在内的SET复合物转移至核内,细胞释放的粒酶A裂解SET释放DNA酶NM231,激活的NM231裂解染色体DNA,导致细胞凋亡。 3、TCE对SET及相互作用蛋白表达的影响:分别以不同剂量的TCE刺激人L-02肝细胞24h后,抽提蛋白,进行western blotting检测。结果显示,随着染毒剂量的增加,eEF1A1、eEF1A2、CAPZB、SET的表达与溶剂对照组比较呈先下降后增高的趋势,DDB1呈先增高后下降的趋势。提示,低剂量的TCE刺激肝细胞时,会增加修复性蛋白DDB1的表达,以及抑制与肿瘤发生相关的蛋白eEF1A1、eEF1A2、CAPZB、SET的表达,产生兴奋效应,有利于细胞生长;高剂量的TCE刺激肝细胞后,机体有限的补偿不能抵消损害时,则降低DDB1的表达,增加eEF1A1、eEF1A2、CAPZB、SET的表达,对机体造成损伤。据我们所知,本研究是首次利用蛋白质组学技术来分析SET在三氯乙烯肝细胞毒性中的蛋白质相互作用及其影响。在文中所做的详细的蛋白质组学分析,将有助于进一步阐明SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性中的作用及其机制。

关键词：免疫共沉淀技术 SET eEF1A1 eEF1A2 相互作用

HeLa细胞中与沙眼衣原体CT224互作分子的初步鉴定

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HeLa细胞中与沙眼衣原体CT224互作分子的初步鉴定

作者：陈立芳河北北方学院

学位级别：硕士

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种严格在活细胞内寄生、具有独特发育周期的病原微生物,在感染宿主细胞后所形成的包涵体内进行复制。包涵体膜蛋白(Inclusion membrane proteins,Incs)是一类主要由衣原体基因编码的特异性蛋白... 详细信息

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种严格在活细胞内寄生、具有独特发育周期的病原微生物,在感染宿主细胞后所形成的包涵体内进行复制。包涵体膜蛋白(Inclusion membrane proteins,Incs)是一类主要由衣原体基因编码的特异性蛋白,作为包涵体的重要组成部分,它们可以通过调控宿主细胞的多种生物学过程进而维系衣原体的生长发育。CT224是已经实验证实的Incs,且通过亲和纯化质谱技术结合生物信息学分析预测出了3个与其相互作用可能性较高的分子:卵黄羧肽酶样蛋白(vitellogenic carboxypeptidase-like protein,CPVL)、肿瘤坏死因子受体相关因子7(TNF receptor-associated factor 7,TRAF7)、外周型苯二氮受体相关蛋白1(peripheral-type benzodiazepine receptorassociated protein 1,BZRAP1)。但是,这些分子是否真的与CT224相互作用仍需经过实验证实。因此,本研究拟在制备抗CT224多克隆抗体的基础上利用GST pull-down技术及免疫共沉淀技术对He La细胞中可能与CT224相互作用的上述分子做进一步确认,以期为深入探讨CT224的生物学功能奠定基础。首先,制备CT224的多克隆抗体。利用基因克隆技术构建原核表达载体p GEX-6P-2-Ct224,并诱导表达为GST-CT224融合蛋白,经亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠,末次免疫一周后采血,分离血清。将构建的pc DNA3.1/myc-His(-)A-Ct224转染He La细胞并培养至36h,经固定、透膜、封闭后,分别用1:300的鼠抗GST-CT224血清(实验组)和1:800的鼠抗Myc抗体(对照1组)孵育,二抗均为Cy3标记的羊抗鼠Ig G抗体,经DAPI染核后在激光共聚焦显微镜下观察。同时设立未转染的He La细胞为对照2组,一抗、二抗同实验组。结果显示,实验组和对照1组中有红色荧光信号出现,对照2组无荧光信号。将pc DNA3.1/myc-His(-)A-Ct224转染48h后的He La细胞裂解、离心、收集上清,分为两组。实验组一抗为1:2 000的鼠抗GST-CT224血清,对照组一抗为1:3 000的鼠抗Myc抗体,两组二抗均为HRP标记的羊抗鼠Ig G抗体。Western Blot结果显示,两组均只出现一条带,且位置相同。以上实验结果表明成功制备了CT224的多克隆抗体。其次,采用GST pull-down技术验证CT224的互作分子。将GST-CT224融合蛋白(实验组)和GST蛋白(对照1组)经GST beads纯化后分别作为诱饵蛋白,与He La细胞裂解液上清共孵育,离心洗涤后的沉淀物进行Western Blot分析。同时将He La细胞裂解液上清和未孵育的GST-CT224作为对照(分别为对照2组和对照3组)。经电泳、转膜、封闭后,各组依次用CT224、CPVL、TRAF7和BZRAP1四种蛋白的抗体作为一抗进行孵育,然后加入对应的HRP标记的羊抗鼠Ig G抗体或HRP标记的羊抗兔Ig G抗体,ECL显影。结果显示,实验组出现CT224、TRAF7和BZRAP1对应的条带,对照1组无条带出现,对照2组出现CPVL、TRAF7和BZRAP1对应的条带,对照3组只出现CT224对应的条带。以上结果表明CT224在体外可与TRAF7和BZRAP1相互作用,而不与CPVL相互作用。最后,利用免疫共沉淀技术验证CT224的互作分子。收集pc DNA3.1/myc-His(-)A-Ct224转染后的He La细胞裂解液上清,加入Myc beads,吸附、离心,所得沉淀物设为实验组。pc DNA3.1/myc-His(-)A转染的He La细胞(处理同实验组)设立为对照1组,未转染的He La细胞裂解液上清设立为对照2组。经电泳、转膜、封闭后,各组依次用CT224、CPVL、TRAF7和BZRAP1四种蛋白的抗体作为一抗进行孵育,然后加入对应的二抗(HRP标记的羊抗鼠Ig G抗体或HRP标记的羊抗兔Ig G抗体),ECL显影。结果显示,实验组出现CT224、TRAF7和BZRAP1对应的条带,对照1组无条带出现,对照2组出现CPVL、TRAF7和BZRAP1对应的条带。以上结果表明CT224在He La细胞内可与TRAF7和BZRAP1相互作用,而不与CPVL相互作用。综合上述实验结果,本研究进一步证明了CT224与TRAF7和BZRAP1存在相互作用,而与CPVL无相互作用。提示CT224可能参与干扰宿主细胞促凋亡途径及抑制宿主免疫应答等功能,这将为进一步探究CT224的生物

关键词： CT224 TRAF7 BZRAP1 免疫共沉淀技术 GST pull-down技术互作分子

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HIV-1两对重要蛋白质相互作用的研究

HIV-1两对重要蛋白质相互作用的研究

作者：张霏华中农业大学

学位级别：硕士

艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)已经成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。HIV(Human Immunodeficiency Virus)是引起艾滋病的病原。研究HIV蛋白间的相互作用及其与宿主细胞蛋白间的相互作用对于理解HIV的感染机制... 详细信息

艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)已经成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。HIV(Human Immunodeficiency Virus)是引起艾滋病的病原。研究HIV蛋白间的相互作用及其与宿主细胞蛋白间的相互作用对于理解HIV的感染机制、生命周期等意义重大。本实验室在前期利用酵母双杂交技术系统地研究了HIV-1蛋白-蛋白相互作用,发现了10对蛋白间存在相互作用,其中有4对蛋白相互作用在以往的文献中未见报道。在此基础上,本论文对其中两对新发现的蛋白相互作用(Vpu-gp120;gp41-Integrase)进行了更深入的研究。本研究首先利用免疫共沉淀的方法检测到HIV-1Vpu蛋白和包膜糖蛋白gp120在生理条件下的相互作用,进一步证实了前期酵母双杂交的实验结果。随后对Vpu蛋白进行了一系列的截短和缺失,并利用酵母双杂交实验找到其与gp120蛋白相互作用的位点为Vpu蛋白72-81位氨基酸序列。同时,本研究也对包膜糖蛋白gp41进行了一系列的截短,通过酵母双杂交实验找到了其与整合酶Integrase相互作用的位点,即gp41蛋白的84-100位氨基酸序列。本研究发现了Vpu与gp120在生理条件下存在相互作用,并找到了Vpu与gp120及gp41与Integrase相互作用的位点,为探求这些相互作用的生物学意义提供了思路和方向,也为深入理解HIV-1的侵染机制等提供了重要的数据资料。

关键词： Vpu-gp120 gp41-Integrase 相互作用位点酵母双杂交免疫共沉淀技术