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克雷伯氏杆菌发酵生产1,3-丙二醇的代谢通量优化分析

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化工学报 2006年第6期57卷 1403-1409页

作者：张青瑞修志龙曾安平大连理工大学环境与生命学院辽宁大连116024 德国国家生物技术中心德国布伦瑞克d38106

以克雷伯氏杆菌为研究对象,系统研究了1,3-丙二醇厌氧和微氧代谢途径.采用代谢通量分析法建立了代谢通量平衡模型,通过线性规划对1,3-丙二醇厌氧和微氧发酵进行了优化分析,得到其最优代谢通量分布和最大理论得率,并分析了比生长速率、... 详细信息

以克雷伯氏杆菌为研究对象,系统研究了1,3-丙二醇厌氧和微氧代谢途径.采用代谢通量分析法建立了代谢通量平衡模型,通过线性规划对1,3-丙二醇厌氧和微氧发酵进行了优化分析,得到其最优代谢通量分布和最大理论得率,并分析了比生长速率、底物浓度以及乙醇生成速率、氧气消耗速率、呼吸商对1,3-丙二醇得率的影响.

关键词： 1,3-丙二醇代谢通量分析线性规划克雷伯氏杆菌

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克雷伯氏杆菌噬菌体的生物学特性及其抗性菌株的选育

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克雷伯氏杆菌噬菌体的生物学特性及其抗性菌株的选育

作者：南南大连理工大学

学位级别：硕士

克雷伯氏杆菌是微生物法发酵生产1,3-丙二醇的重要生产菌种,生产过程中若发生噬菌体感染,将影响细胞生长和代谢,给生产造成巨大的经济损失。目前微生物发酵工业生产中感染噬菌体的报道主要集中在乳制品工业以及少数的大宗化学品产业,1,3... 详细信息

克雷伯氏杆菌是微生物法发酵生产1,3-丙二醇的重要生产菌种,生产过程中若发生噬菌体感染,将影响细胞生长和代谢,给生产造成巨大的经济损失。目前微生物发酵工业生产中感染噬菌体的报道主要集中在乳制品工业以及少数的大宗化学品产业,1,3-丙二醇发酵生产过程中噬菌体的信息比较有限,国内尚处空白。鉴于上述情况,本论文分离出造成发酵异常的克雷伯氏杆菌的噬菌体,考察其生物学特性及其对发酵代谢的影响,对防治噬菌体污染进行了初步的探索,并筛选了抗噬菌体的菌株。首先,对克雷伯氏杆菌的噬菌体进行了鉴定、分离和分类。以丝裂霉素C诱导法鉴定产生异常发酵的生产菌株溶源性噬菌体,采用敏感指示菌法及Adams双层平板法从引起发酵异常的克雷伯氏杆菌中分离纯化出一株溶源性噬菌体。通过氯仿敏感性实验测定显示,该噬菌体对氯仿不敏感,从而表明该噬菌体无包膜,其衣壳内不含脂类物质。用磷钨酸负染法透射电镜观察,从形态学上进行分类,属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科。手工法提取噬菌体核酸,限制性内切酶EcoR I和HindⅢ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳分析,表明该噬菌体的核酸为dsDNA。根据酶切图谱估算的噬菌体基因组大小约为42kb。其次,测定了噬菌体的生物学特性,其最佳感染复数为1;一步生长曲线显示,噬菌体的潜伏期与裂解期均为50min,裂解量为343个。还考察了温度、pH、紫外线等理化因素对噬菌体活性的影响。该噬菌体对温度比较敏感,其最适温度为37℃,经70℃处理30min即完全失活。其存活的pH范围较宽,对酸碱均有一定的抗性,在pH7-8范围内效价最高,较耐碱性,在偏酸性条件下(pH克雷伯氏杆菌生长和发酵代谢的影响。结果显示,与正常克雷伯氏杆菌相比,感染噬菌体的宿主细胞生长停滞期约8h,最高菌体浓度下降了33%。比较两种情况下的主要代谢产物生成情况,其主产物1,3-丙二醇产量下降38%,代谢流偏向了乳酸等有机酸途径。为探索针对噬菌体污染的防治措施,考察了Ca2+、三种不同浓度的表面活性剂以及不同浓度的氨苄青霉素对降低噬菌体影响菌体生长的作用,结果显示所考察的三种方法条件对噬菌体均无有效的抑制作用。最后,筛选抗性菌株。通过高浓度噬菌体侵染条件下的自发突变经初筛、复筛得到一株抗性菌株。发酵验证显示,该菌株菌体生长未出现停滞现象,表现出了一定的抗性。但代谢流仍然偏向乳酸等有机酸途径,导致1,3-丙二醇产量偏低。进一步采用等离子体与Li+进行复合诱变的方法对抗性菌株进行改造,使得其产量增加了13.1%,证明进一步筛选到优良抗噬菌体高产菌株是具有可行性的。

关键词：克雷伯氏杆菌噬菌体生物学特性 1,3－丙二醇发酵抗性菌株

基于抗氧化酶和磷酸戊糖的克雷伯氏杆菌重金属抗性机理

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安全与环境学报 2017年第2期17卷 635-640页

作者：王小瑜朴永哲安家彦赵玉清崔玉波黄玮大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034 大连民族大学生命科学学院辽宁大连116600 大连民族大学环境与资源学院辽宁大连116600

为了探索克雷伯氏杆菌的重金属抗性机理,提取Ag+、Pb2+和Cr3+胁迫后克雷伯氏杆菌的胞内蛋白,利用双向电泳技术和质谱技术分离、解析、鉴定特异性蛋白质斑点。结果表明,不同重金属离子胁迫后克雷伯氏杆菌的蛋白质斑点在数量和表达量上有... 详细信息

为了探索克雷伯氏杆菌的重金属抗性机理,提取Ag+、Pb2+和Cr3+胁迫后克雷伯氏杆菌的胞内蛋白,利用双向电泳技术和质谱技术分离、解析、鉴定特异性蛋白质斑点。结果表明,不同重金属离子胁迫后克雷伯氏杆菌的蛋白质斑点在数量和表达量上有较大的差异,但存在3个表达新增和10个表达关闭的共同蛋白斑点,质谱鉴定结果表明特异表达蛋白质与抗氧化系统、能量代谢调节机制有关。研究表明,克雷伯氏杆菌受到重金属胁迫后启动过氧化氢酶的表达,同时通过关闭胞内原有碳分解代谢途径、开启磷酸戊糖途径等相应的应急系统获取能量,降低重金属离子对细胞的毒害作用。

关键词：环境工程学克雷伯氏杆菌重金属蛋白质组过氧化氢酶磷酸戊糖途径

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基因组尺度克雷伯氏杆菌产1，3-丙二醇的代谢路径优化分析

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基因组尺度克雷伯氏杆菌产1，3-丙二醇的代谢路径优化分析

作者：杨晓萌青岛科技大学

学位级别：硕士

代谢工程技术可在满足人类的特定需求下对微生物的代谢途径进行操控,并能够阐明代谢路径与代谢网络之间整体与局部的关系,进而达到优化细胞性能的目的。该技术已经广泛应用于微生物发酵产业,为微生物产业工业化做出巨大贡献。目前利用... 详细信息

代谢工程技术可在满足人类的特定需求下对微生物的代谢途径进行操控,并能够阐明代谢路径与代谢网络之间整体与局部的关系,进而达到优化细胞性能的目的。该技术已经广泛应用于微生物发酵产业,为微生物产业工业化做出巨大贡献。目前利用生物化法产1,3-丙二醇的产率不是很高,为达到提高其产率的目的,本文对基因组尺度克雷伯氏杆菌代谢网络代谢甘油的灵活性、1,3-丙二醇最优路径及替代路径冗余性进行了研究。首先,利用通量平衡几何分析方法以1,3-丙二醇通量最大为目标进行分析,得到其最优路径及最大理论得率0.874,此时比生长速率值为零。进一步研究了不同比生长速率对1,3-丙二醇合成速率及其最优路径的影响,通过不同比生长速率下1,3-丙二醇最优路径的通量分布进行对比,找到最优路径开始变化的临界点,并研究了还原当量、甘油以及谷氨酸节点通量值随比生长速率的变化规律。研究发现1,3-丙二醇最优代谢路径随比生长速率的增加共有35个反应加入,9个反应消失。胞内钠离子的运输及还原当量NADH对生物量的合成有重要影响,随着细胞生成速率的增加,还原当量NADPH、NADH所需值也增加,同时,用于维持胞内钠离子浓度的平衡和谷氨酸的合成的NADH消耗量也增加,导致用于合成1,3-丙二醇的还原当量值减少。其次,通过通量可变性分析对1,3-丙二醇代谢路径的冗余性进行分析。分别研究了1,3-丙二醇的比生成速率、细胞比生长速率以及反应GLYK、GLYCDx通量值对代谢路径冗余性的影响。要获得较高的代谢路径冗余性,1,3-丙二醇路径中所有参与反应的通量值均不在其最大值处,调控至较低值既可以获得高冗余性也可得到高产量。当1,3-丙二醇比生成速率为其最大理论值的64%左右时,可得到最大产量,合理控制比生长速率以及关键反应通量值就可以在得到最大产量的同时路径冗余性较高。菌体的代谢灵活性随外界环境的变化,同样对目标产物的生产有重要作用。最后,利用通量可变性分析对克雷伯氏杆菌随外界环境变化的代谢灵活性进行研究,找到生长速率、内部反应和交换反应这三个方面的变化对菌体代谢灵活性的影响程度,以便找到提高菌体代谢灵活性的途径。研究发现,生长速率的变化对菌体代谢灵活性的影响最大,内部反应和交换反应的变化对代谢灵活性的影响非常小,控制生长速率的上下限研究菌体代谢灵活性如何随生长速率变化,得到代谢灵活性提高的两个必要条件：在菌体可耐甘油的浓度范围内,提供尽可能大的甘油吸收速率供菌体生长;调控菌体在次优模式下生长。

关键词： COBRA Toolbox 克雷伯氏杆菌通量平衡几何分析通量可变性分析

产1，3-丙二醇克雷伯氏杆菌的基因工程改造

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产1，3-丙二醇克雷伯氏杆菌的基因工程改造

作者：王勇江南大学

学位级别：硕士

1,3-丙二醇（1,3-PD）是国际上公认的六大石化新产品之一,其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1,3-PD的生产方法有化学合成法和生物转化法。生物转化法生产1,3-PD具有显著的优点,成为当前的研究热点。为便于研究,首... 详细信息

1,3-丙二醇（1,3-PD）是国际上公认的六大石化新产品之一,其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1,3-PD的生产方法有化学合成法和生物转化法。生物转化法生产1,3-PD具有显著的优点,成为当前的研究热点。为便于研究,首先确立了在克雷伯氏杆菌和大肠杆菌两个体系中,甘油脱水酶（GDHt）、1,3-丙二醇氧化还原酶（PDOR）及其同工酶（YQHD）的酶活测量方法。确定了在缓冲溶液中加入2 mmol/L的二硫苏糖醇DTT可以明显提高甘油脱水酶,1,3-丙二醇氧化还原酶及其同工酶的测量准确度。实验结果表明在功率300 w时,克雷伯氏杆菌和重组大肠杆菌JM109 （pHsh-dhaB-yqhD）能较好保持关键酶酶活的破碎条件均为:总超声破碎时间5 min,每隔4 s破碎1 s;酶活较适宜的测量条件为:GDHt酶活测定所用磷酸盐缓冲液的较适宜浓度为0.045 mol/L,来自克雷伯氏杆菌和大肠杆菌JM109 （pHsh-dhaB-yqhD）的GDHt最适宜pH分别为7.2和7;PDOR和YQHD测定所用碳酸盐缓冲液的较适浓度为0.1 mol/L,来自克雷伯氏杆菌的PDOR和大肠杆菌JM109 （pHsh-dhaB-yqhD）的YQHD较适宜pH分别为7.2、9;GDHt和PDOR,YQHD酶活测定的适宜温度分别为37℃、45℃、45℃。由于克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）1,3-PD合成途径中,加强甘油脱水酶基因表达,会导致因NADH供应不足使3-羟基丙醛累积,并对菌体生长及1,3-PD合成造成负面影响。为改善Klebsiella pneumoniae 1,3-PD合成途径,利用PCR技术从大肠杆菌（Escherichia coli）中扩增出以NADPH为辅酶的1,3-PD氧化还原酶同工酶基因yqhD,从克雷伯氏杆菌中扩增出GDHt基因dhaB,构建了产1,3-PD关键酶基因的串联载体pEtac-dhaB-tac-yqhD,并将其转入到野生Klebsiella pneumoniae中。全细胞蛋白电泳分析显示Klebsiella pneumoniae （pEtac-dhaB-tac-yqhD）中GDHt和PDOR（YQHD）的蛋白表达量分别比野生Klebsiella pneumoniae高25.2%和17.4%,酶活则分别由0.59 U·mg-1和19 U·mg-1提高到1.02 U·mg-1和32 U·mg-1,蛋白含量和酶活的大幅提升,证明dhaB和yqhD在Klebsiella pneumoniae中得到了表达。通过抗生素浓度梯度实验,确定了Klebsiella pneumoniae （pEtac-dhaB-tac-yqhD）进行种子培养和发酵时培养基所含硫酸卡那霉素的最低浓度为30 mg/L,获得Klebsiella pneumoniae和Klebsiella pneumoniae （pEtac-dhaB-tac-yqhD）在种子培养基和发酵培养基中的生长曲线。摇瓶发酵结果显示,Klebsiella pneumoniae （pEtac-dhaB-tac-yqhD）比野生Klebsiella pneumoniae的乙醇含量略有提高,提高幅度为9.5%,乙酸含量下降了26.5%,而丁二醇含量更是下降了34.0%,主产物1,3-PD提高了25%。乙酸,乙醇和1,3-PD均在反应进行7 h左右开始大量生成,而丁二醇则要在第20 h左右才开始大量生成。进一步在5 L发酵罐上进行发酵试验,结果表明发酵培养较适宜的搅拌转速和通气量采用两段控制,第一阶段转速控制为200 r/min,通空气条件为2.0 vvm,7h后转速和通气量分别降为100 r/min和1.0 vvm。控制pH恒为7.0对重组Klebsiella pneumoniae（pEtac-dhaB-tac-yqhD）的发酵有利。

关键词： 1,3-丙二醇克雷伯氏杆菌甘油脱水酶 1,3-丙二醇氧化还原酶 1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶发酵特性

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大气压等离子体对克雷伯氏杆菌的生物学效应

大气压等离子体对克雷伯氏杆菌的生物学效应

作者：朱晓丽大连理工大学

学位级别：硕士

等离子体的产生存在时间极短,粒子与样品发生作用后随即消失,因此具有作用效率高、安全无污染等特点。由于自身的独特性,在微生物育种以及杀菌领域有着广泛的应用,研究热点主要集中在杀菌机理上,而不同强度等离子体对微生物作用特点缺... 详细信息

等离子体的产生存在时间极短,粒子与样品发生作用后随即消失,因此具有作用效率高、安全无污染等特点。由于自身的独特性,在微生物育种以及杀菌领域有着广泛的应用,研究热点主要集中在杀菌机理上,而不同强度等离子体对微生物作用特点缺乏个全面分析。同时,等离子体作用会对细胞膜的通透性及表面的离子通道产生一定的影响,因此不同类型的金属离子对等离子体生物学作用的改变需要进一步的明确。1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)作为化工原料具有巨大的市场潜力,由于其两个羟基分别位于1号及3号碳上,空间结构上的对称性使其在聚合物的合成上有着独特的优势。用来发酵生产1,3-丙二醇的精甘油价格高,增加了生产成本,因此有必要用粗甘油取代精制甘油从而提高经济效益,但适应于粗甘油又高产1,3-丙二醇的菌株较少。针对以上问题,本论文主要做了如下研究：首先,利用响应面法分析了不同放电条件下介质阻挡放电等离子体对休眠时间大于3个月的克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)产1,3-丙二醇能力的影响,确定了较低电场强度(即操作电压24～26kV,电流1.7～1.8mA)和较长处理时间(120～160s)以及较强电场强度(操作电压30～32kV,电流1.8～1.9mA)和较短处理时间(20～60s)这样的组合对K. pneumoniae的1,3-丙二醇产量有促进作用。进一步研究了不同装液量即液面厚度对该作用的影响,结果表明装液量对等离子体作用影响不大。根据以上结论对等离子体作用条件进行了细化,确定了最终的优化条件：电压24kV、电流1.8mA、处理时间140s,经过该条件处理的种子在50g/L甘油的摇瓶发酵,产量比原始菌株提离了21.7%。同时,考察了经优化条件的等离子体处理后,K. pneumoniae胞内谷胱甘肤含量及总抗氧化活性的变化,实验结果表明胞内谷胱甘肽含量和总抗氧化能力都有所增强。其次,将等离子体与金属离子结合共同处理K. pneumoniae菌液,在所选的4种离子中,除Ba2+外,Mg2+、Li+、K+与等离子体的复合都对细胞的1,3-丙二醇产量有正面效应。将等离子体与Mg2+复合处理的菌液进行批式流加发酵,1,3-丙二醇浓度在23h时达到71.5g/L,比对照提高18.8%,同时转化率也有略微提高。再次,为提高K. pneumoniae以粗甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇的水平,使用大气压介质阻挡放电等离子体与LiCl进行复合诱变,结合FeCl3和产物及粗甘油耐受的筛选方法,筛选出一株能耐受粗甘油且产量较高的突变菌株KpM30。经批式流加发酵,1,3-丙二醇的产量、摩尔转化率分别达到70.2g/L和0.576,与原始菌株相比分别提高24.9%和17.7%。与此同时,乙醇、琥珀酸及乳酸等副产物产量普遍下降,其中乳酸降幅最大为47.0%。经代谢分析,KpM30在发酵前期ATP及NADH的生成量为原始菌株的1.6和1.3倍,而在发酵终点处1,3-丙二醇支路的碳流量增加了22.6%。同时,实验结果表明诱变菌以精甘油为底物发酵,产量也有所提高。

关键词：克雷伯氏杆菌大气压等离子体生物效应响应面法金属离子与等离子体复合作用复合诱变

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克雷伯氏杆菌代谢灵活性分析

化学与生物工程 2015年第8期32卷 43-47页

作者：杨晓萌张青瑞张凯彭家瑶青岛科技大学化工学院山东青岛266042

微生物对外界环境的变化具有灵活的适应性,通过代谢网络的通量可变性分析可以对代谢灵活性进行量化,得到影响菌体代谢灵活性的因素。使用代谢流分析软件COBRA Toolbox,对克雷伯氏杆菌基因组尺度代谢网络进行通量平衡分析与通量可变性分... 详细信息

微生物对外界环境的变化具有灵活的适应性,通过代谢网络的通量可变性分析可以对代谢灵活性进行量化,得到影响菌体代谢灵活性的因素。使用代谢流分析软件COBRA Toolbox,对克雷伯氏杆菌基因组尺度代谢网络进行通量平衡分析与通量可变性分析,分别得到内部反应的可变性、交换反应的可变性和生长速率的可变性等3个因素对菌体代谢灵活性的影响程度,其中生长速率的可变性是影响代谢灵活性的主要因素,调控菌体至次优模式下生长可使其具有更大的代谢灵活性。通过进一步研究生长速率对通量可变性的影响,找到提高代谢灵活性的两个必要条件,从而增强菌体应对外界环境改变的能力。

关键词：克雷伯氏杆菌代谢灵活性通量平衡分析通量可变性分析 COBRA Toolbox

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克雷伯氏杆菌血清分型

国外医学(微生物学分册) 1987年第4期 171-174+177页

作者：胡雪皎邓琨孔宪涛第二军医大学长征医院呼吸科

克雷伯氏杆菌血清分型是公认的十分有用的流行病学调查手段,不仅有助于了解某些型别是否与所见感染有关,以便追踪感染或交叉感染的来源,指导临床及时采取措施清除病原,而且在预防医学上具有重要意义。由于克雷伯氏杆菌多感染重病老年人... 详细信息

克雷伯氏杆菌血清分型是公认的十分有用的流行病学调查手段,不仅有助于了解某些型别是否与所见感染有关,以便追踪感染或交叉感染的来源,指导临床及时采取措施清除病原,而且在预防医学上具有重要意义。由于克雷伯氏杆菌多感染重病老年人及幼儿,死亡率甚高,许多国家致力于发展克雷伯氏杆菌疫苗,并已收到了初步临床效果。鉴于克雷伯氏杆菌型别众多,应把哪些常见感染型包括在疫苗中,则须藉助于血清型调查。目前国内尚未开展克雷伯氏杆菌分型工作,但有资料表明,克雷伯氏杆菌感染也是国内医院感染中最多见的感染之一。由此可见,建立并开展这方面的工作十分必要。下

关键词：克雷伯氏杆菌型别抗原分型方法抗血清荚膜多糖交叉反应抗原-抗体反应血清分型

不同重金属离子胁迫下克雷伯氏杆菌胞内蛋白质组的差异分析

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不同重金属离子胁迫下克雷伯氏杆菌胞内蛋白质组的差异分析

作者：黄玮大连工业大学

学位级别：硕士

为阐释克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)的重金属离子抗性机制,本实验采用蛋白质组学的方法,利用双向凝胶电泳技术对不同重金属离子(Ag+、Cu2+、Pb2+和Cr3+)胁迫下K. pneumoniae细胞的总蛋白质进行了分析。实验结果表明：从2-DE图... 详细信息

为阐释克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)的重金属离子抗性机制,本实验采用蛋白质组学的方法,利用双向凝胶电泳技术对不同重金属离子(Ag+、Cu2+、Pb2+和Cr3+)胁迫下K. pneumoniae细胞的总蛋白质进行了分析。实验结果表明：从2-DE图谱上检出的蛋白斑点空白对照组有656个,而Ag+、Cu2+、Pb2+、Cr3+和Pb2+(长时间)实验组分别为458个、550个、609个、558个和604个;其中分别有32个、24个、17个、23个和37个特异性表达的蛋白斑点。蛋白质斑点表达量上调Ag+、Cu2+、Pb2+、Cr3+和Pb2+(长时间)实验组分别为18个、8个、9个、12个和6个,蛋白质斑点表达量下调Ag+、Cu2+、Pb2+、Cr3+和Pb2+(长时间)实验组分别为31个、13个、13个、16个和14个。这些差异表明重金属离子的存在的确影响了胞内某些特定基因的表达,而且不同重金属离子的影响效果是不相同的,相同重金属由于作用方式的不同也会导致影响效果的不同,从而为进一步阐明K.pneumoniae对重金属离子的抗性作用机制奠定了坚实的基础,为开发对重金属离子具有更高耐受性的基因工程菌提供了理论依据。

关键词：克雷伯氏杆菌 Ag+ Cu2+ Pb2+ Cr3+ 双向电泳蛋白质组学 LC-MS