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金黄色葡萄球菌类肠毒素W的超抗原活性位点预测与克隆表达

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中华流行病学杂志 2023年第4期44卷 629-635页

作者：杨玉花库鑫宫雅楠孟凡亮卜东波郭亚慧魏销玥龙丽瑾范佳铭张茂俊张建中闫笑梅中国疾病预防控制中心传染病预防控制所感染性疾病诊治协同创新中心/传染病预防控制国家重点实验室北京102206 中国科学院计算技术研究所智能信息处理重点实验室北京100190 中国科学院大学北京100049 中科大数据研究院郑州450046 内蒙古科技大学包头医学院包头014040 中国医科大学沈阳110122

目的预测金黄色葡萄球菌类肠毒素W(SElW)与T细胞受体(TCR)的对接和超抗原活性位点,并对SElW进行克隆表达和纯化。方法利用AlphaFold对SElW蛋白单体进行三维结构预测,借助SAVES在线服务器使用ERRAT、拉氏图和Verify_3D等软件对蛋白模型... 详细信息

目的预测金黄色葡萄球菌类肠毒素W(SElW)与T细胞受体(TCR)的对接和超抗原活性位点,并对SElW进行克隆表达和纯化。方法利用AlphaFold对SElW蛋白单体进行三维结构预测,借助SAVES在线服务器使用ERRAT、拉氏图和Verify_3D等软件对蛋白模型进行评估。用ZDOCK服务器模拟SElW与TCR的对接构象,并对SElW与其他肠毒素的氨基酸序列进行比对。设计引物扩增selw基因,将该片段重组于pMD18-T载体中并进行测序;经限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切后将目的片段重组于表达质粒pET-28a(+)中,重组质粒鉴定后用IPTG诱导表达;用亲和层析法对表达于上清中的SElW蛋白进行纯化,用BCA法对蛋白进行定量。结果三维结构预测结果显示,SElW蛋白由氨基末端和羧基末端两个结构域组成,其中氨基末端结构域由3个α-螺旋和6个β-片层组成,羧基末端结构域由2个α-螺旋和7个反向平行的β-片层组成。SElW蛋白模型的整体质量因素得分为98.08,其中93.24%的氨基酸Verify_3D得分≥0.2,且无氨基酸位于不允许区。模拟对接预测选择评分最高的对接构象(评分值为1521.328)作为分析对象,采用PyMOL软件分析SElW与TCR之间形成的19个氢键。结合序列比对和既往研究结果,本研究预测发现了SElW蛋白的5个重要超抗原活性位点,分别是Y18、N19、W55、C88和C98。通过克隆表达和蛋白纯化,获得了高纯度的可溶性重组蛋白SElW。结论研究预测了SElW蛋白中5个可能的超抗原活性位点,成功构建并表达了SElW蛋白,为进一步探索SElW免疫识别机制奠定了基础。

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素分子对接超抗原活性位点克隆表达

杆菌状链霉菌甲壳素酶基因的克隆表达及重组酶酶学性质研究

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中国海洋大学学报（自然科学版） 2022年第7期52卷 62-71页

作者：邢爱佳马磊薛长湖孙建安毛相朝中国海洋大学食品科学与工程学院山东青岛266003 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋药物与生物制品功能实验室山东青岛266237

为了发掘产物单一的甲壳素酶,本文从杆菌状链霉菌(Streptomyces bacillaris)中克隆表达了甲壳素酶SbChiAJ143,并对其酶学性质进行了表征。研究表明,该酶的基因全长为1734 bp,分子量为59.2 kDa,属于糖苷水解酶18家族。以胶质甲壳素为底物... 详细信息

为了发掘产物单一的甲壳素酶,本文从杆菌状链霉菌(Streptomyces bacillaris)中克隆表达了甲壳素酶SbChiAJ143,并对其酶学性质进行了表征。研究表明,该酶的基因全长为1734 bp,分子量为59.2 kDa,属于糖苷水解酶18家族。以胶质甲壳素为底物,其最适温度为55℃,最适pH为6.0(50 mmol/L磷酸盐缓冲液)。Ca^(2+)和Ba^(2+)对其酶活有轻微的促进作用,Cu^(2+)、Fe^(3+)和SDS可明显抑制其酶活。在最适条件下,其纯化后的比酶活为5.29 U/mg。动力学分析结果显示,该酶的Km为3.54 mg/mL,Vmax为17.14μmol/(min·mg)。高效液相色谱分析显示,其酶解胶质甲壳素2 h只产甲壳二糖(GlcNAc)_(2),酶解24 h有少量N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc存在。研究结果显示,在可控条件下,甲壳素酶SbChiAJ143能够高效酶解生产甲壳二糖,该酶可应用于高纯度甲壳二糖的工业化生产。

关键词：甲壳素酶甲壳寡糖甲壳二糖克隆表达酶学性质

氨基酸转氨/脱羧双功能酶克隆表达、功能鉴定及其机理研究

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食品与发酵工业 2023年第19期49卷 7-14,I0001页

作者：丁小洁刘嘉荔杨静文胡雪芹张洪斌合肥工业大学食品与生物工程学院安徽合肥230009

大肠杆菌来源的L-天冬氨酸转氨酶(L-AspAT)是一种具有严格立体选择性、高效一步合成特性的生物催化剂,研究该酶对于手性胺化合物的生物合成至关重要。该研究将野生大肠杆菌来源的L-天冬氨酸转氨酶基因克隆表达至大肠杆菌工程菌BL21(DE3... 详细信息

大肠杆菌来源的L-天冬氨酸转氨酶(L-AspAT)是一种具有严格立体选择性、高效一步合成特性的生物催化剂,研究该酶对于手性胺化合物的生物合成至关重要。该研究将野生大肠杆菌来源的L-天冬氨酸转氨酶基因克隆表达至大肠杆菌工程菌BL21(DE3)中高效表达、分离纯化出该酶,并对该酶催化的反应进行功能鉴定。结果表明该酶是一种具有催化氨基酸转氨和二羧酸底物非氧化脱羧2种催化能力的双功能酶,该研究对其催化的2种反应酶学性质分别进行了研究,同时对酶催化机理进行了探讨。检测反应液中底物和产物的浓度随时间的变化,发现反应体系中先进行转氨反应,待反应液中脱羧底物浓度足够多时才开始进行脱羧反应,脱羧反应同时又促进转氨反应,2种反应相互影响,互相促进。同时将L-AspAT分别与转氨和脱羧的底物小分子对接,结果显示,L-天冬氨酸转氨酶对于谷氨酸和酮戊二酸而言,对接获得的结合位点是不同的,该双功能酶存在2个催化活性中心用来催化不同的反应。实验发现转氨反应的最适温度为35℃,脱羧反应的最适温度为37℃。2种反应的最适pH均为8,5 mmol/L的Cu^(2+)和Mg^(2+)能够促进转氨反应,5 mmol/L的Ni^(2+)能够促进脱羧反应。

关键词： L-天冬氨酸转氨酶克隆表达双功能酶酶学性质机理研究

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维氏气单胞菌来源几丁质酶的克隆表达及应用

食品与生物技术学报 2022年第4期41卷 55-63页

作者：鲁梦唯陈晟吴敬江南大学生物工程学院江苏无锡214122 食品科学与技术国家重点实验室江南大学江苏无锡214122

丰年虾是一种小型甲壳类动物,孵化后的幼虫是水产动物的优质饵料,残留的卵壳则作为废弃物处理。然而丰年虾卵壳含有丰富的蛋白质和几丁质,具有极大的应用潜力。为了从丰年虾卵壳中制备几丁寡糖,选择了水解产物分布宽泛和含有几丁质结合... 详细信息

丰年虾是一种小型甲壳类动物,孵化后的幼虫是水产动物的优质饵料,残留的卵壳则作为废弃物处理。然而丰年虾卵壳含有丰富的蛋白质和几丁质,具有极大的应用潜力。为了从丰年虾卵壳中制备几丁寡糖,选择了水解产物分布宽泛和含有几丁质结合域的维氏气单胞菌来源的几丁质酶ChiB565,将其在毕赤酵母Pichia pastoris中进行重组表达,对其酶学性质和高密度发酵条件进行研究后,建立了以中性蛋白酶和重组几丁质酶ChiB565为主协同处理丰年虾卵壳以制备几丁寡糖的绿色工艺。结果显示,重组菌发酵的最高酶活为13.2 U/mL,是摇瓶发酵酶活的3.88倍;当先以中性蛋白酶(30 mg/g(以底物质量计),4 h)处理丰年虾卵壳以脱除蛋白质,再用重组几丁质酶ChiB565(40 U/g(以底物质量计),5 h)来水解几丁质时,水解产物主要为几丁二糖到几丁四糖,伴随少量几丁五糖和几丁六糖,且水解产物对DPPH自由基和ABTS自由基清除率分别为59.94%和53.15%。上述研究表明以丰年虾卵壳为底物采用生物酶法制备几丁寡糖相较于传统化学法回收率更高,时间更短。该研究为几丁寡糖的工业化制备奠定了重要基础。

关键词：几丁质酶克隆表达丰年虾卵壳几丁寡糖

弧菌DS32褐藻胶裂解酶基因vralg1的异源表达和酶学性质研究

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应用海洋学学报 2024年第2期43卷 255-265页

作者：李慧敏邵宗泽路瑶杨江科周梅先武汉轻工大学生命科学与技术学院湖北武汉430023 自然资源部第三海洋研究所、自然资源部海洋生物遗传资源重点实验室福建厦门361005

对从福建省东山湾沉积物样品中筛选到的菌株Vibrio sp. DS32的褐藻胶裂解酶基因vralg1进行克隆和异源表达,并对其酶学性质进行评估。以DS32基因组为模板,克隆褐藻胶裂解酶基因vralg1,构建了pET-vralg1重组表达载体,并在大肠杆菌中实现... 详细信息

对从福建省东山湾沉积物样品中筛选到的菌株Vibrio sp. DS32的褐藻胶裂解酶基因vralg1进行克隆和异源表达,并对其酶学性质进行评估。以DS32基因组为模板,克隆褐藻胶裂解酶基因vralg1,构建了pET-vralg1重组表达载体,并在大肠杆菌中实现了异源表达,对重组酶VRALG1的酶学性质、底物特异性和完全降解产物等进行了测定。结果表明:重组酶VRALG1最适温度为35℃,在5~50℃范围内相对酶活力达到80%以上,最适pH为6.5~7.5,在pH为6.0~9.0范围内保温1 h后相对酶活力在90%以上;重组酶VRALG1最大反应速率为5.919 mmol/(L·min),米氏常数为3.712 mmol/L,最适条件下比活力为5.874 U/mg;K^(+)、Cs^(+)、Na^(+)、咪唑和乙醇对酶活性影响较小,5 mmol/L或50 mg/mL浓度下相对酶活力保持90%以上,EDTA对酶的抑制作用明显,1 mmol/L浓度下可使酶完全失活;重组酶VRALG1对海藻酸钠和聚古罗糖醛酸具有较高的降解活性,TLC分析显示产物主要为单糖、二糖和三糖混合物,结合底物特异性分析,推测重组酶VRALG1是具有明显聚古罗糖醛酸偏好性的内切型双功能褐藻胶裂解酶。本研究成功克隆了弧菌DS32中褐藻胶裂解酶基因并实现了其在大肠杆菌中的异源表达,所得重组酶VRALG1具有优良的海藻酸钠降解活性和明显的聚古罗糖醛酸偏好性,可以用于制备低聚合度的褐藻寡糖。

关键词：海洋生物学褐藻胶裂解酶褐藻寡糖克隆表达酶学性质聚古罗糖醛酸偏好性

贝莱斯芽孢杆菌角蛋白酶的克隆表达、纯化及酶学性质

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食品与生物技术学报 2023年第6期42卷 57-66页

作者：殷方荣翟李欣田乔鹏管政兵蔡宇杰廖祥儒江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学教育部工业生物技术重点实验室江苏无锡214122

为了获得更好的羽毛粉降解酶,作者从贝莱斯芽孢杆菌基因组中筛选到一个角蛋白酶基因(baker1),对其克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,最后对重组角蛋白酶(BaKer1)进行分离纯化、表征及应用研究。结果表明,BaKer1的最适反应pH为9.5,... 详细信息

为了获得更好的羽毛粉降解酶,作者从贝莱斯芽孢杆菌基因组中筛选到一个角蛋白酶基因(baker1),对其克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,最后对重组角蛋白酶(BaKer1)进行分离纯化、表征及应用研究。结果表明,BaKer1的最适反应pH为9.5,最适反应温度为55℃,在中温和碱性条件下具有较好的稳定性。1 mmol/L Ca^(2+)对BaKer1有显著促进作用,5 mmol/L Mn^(2+)对BaKer1有轻微抑制作用,其他金属离子对BaKer1影响不大。PMSF对BaKer1的活性具有显著抑制作用,表明BaKer1是典型的丝氨酸蛋白酶。分别以羽毛粉、偶氮酪蛋白、酪蛋白为底物测定了BaKer1的动力学参数,Km值分别为5.06、1.09、1.39 mmol/L,k_(cat)/K_(m)值分别为1058.24、2536.54、3733.79 s·mmol/L。BaKer1处理羽毛粉,能达到酸水解效果的33.51%,说明它在羽毛粉降解过程中具有潜在的应用价值。

关键词：角蛋白酶克隆表达酶学性质羽毛粉贝莱斯芽孢杆菌

幽门螺杆菌katA基因功能及其在耐受氧化损伤中的作用分析

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生物技术通报 2024年第5期40卷 310-320页

作者：王鑫鑫管玉祝李晓苇洪伟吴道艳康颖倩刘永畅陈峥宏崔古贞贵州医科大学基础医学院微生物学教研室贵阳550000 贵州省病原生物学特色重点实验室贵阳550000 贵州省分子生物学重点实验室贵阳550000

【目的】过氧化氢酶(KatA)是幽门螺杆菌编码的重要毒力因子,在抵抗宿主免疫杀伤和疫苗研发等方面具有重要功能。为了鉴定幽门螺杆菌KatA的酶学特性,并分析其在幽门螺杆菌氧化耐受中的功能。【方法】首先,从幽门螺杆菌临床耐药菌株Hp_G27... 详细信息

【目的】过氧化氢酶(KatA)是幽门螺杆菌编码的重要毒力因子,在抵抗宿主免疫杀伤和疫苗研发等方面具有重要功能。为了鉴定幽门螺杆菌KatA的酶学特性,并分析其在幽门螺杆菌氧化耐受中的功能。【方法】首先,从幽门螺杆菌临床耐药菌株Hp_G272基因组中分离katA基因,并在大肠杆菌中克隆表达、分离纯化KatA^(G272)蛋白;然后,利用CAT检测试剂盒体外分析KatA^(G272)的过氧化氢酶活性;其次,利用同源重组技术构建katA基因工程菌株,包括敲除菌株和回补菌株;最后,通过比较野生菌株与工程菌株生长表型差异、分解过氧化氢能力差异及耐受过氧化氢能力差异,阐述katA基因的功能及其在幽门螺杆菌耐受氧化损伤中的作用。【结果】在大肠杆菌中成功克隆表达并分离纯化KatA^(G272),体外酶学分析表明,KatA^(G272)是一类嗜酸性过氧化氢酶,基因敲除分析表明,敲除该基因幽门螺杆菌丧失分解和耐受过氧化氢的能力,而回补该基因幽门螺杆菌回复分解和耐受过氧化氢的能力。【结论】katA基因是幽门螺杆菌分解和耐受过氧化氢的唯一功能基因,在幽门螺杆菌氧化耐受中具有重要功能。

关键词：幽门螺杆菌过氧化氢酶 katA 耐受性克隆表达基因敲除

橙黄小单孢菌(Micromonospora aurantiaca)几丁质酶基因的克隆、表达、鉴定及应用

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南方水产科学 2023年第5期19卷 143-153页

作者：王逗游锦若申铉日李永成夏光华何燕富张雪莹海南大学食品科学与工程学院海南海口570228 南海水产资源高效利用工程研究中心海南海口570228

从海洋微生物橙黄小单孢菌(Micromonosprra aurantiaca)的基因组DNA中克隆到一条新型的碳水化合物18家族几丁质酶基因Machi3,并成功在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达。该酶的最适反应温度和pH分别为55℃和7.0,在低于55℃和pH 6.0~9.... 详细信息

从海洋微生物橙黄小单孢菌(Micromonosprra aurantiaca)的基因组DNA中克隆到一条新型的碳水化合物18家族几丁质酶基因Machi3,并成功在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达。该酶的最适反应温度和pH分别为55℃和7.0,在低于55℃和pH 6.0~9.0范围内稳定性较好。镁离子(Mg^(2+))、钙离子(Ca^(2+))、吐温40(Tween 40)和吐温80(Tween 80)对MaChi3的酶活力有轻微的促进作用。该重组酶对α-几丁质、胶体几丁质、虾壳粉、不同脱乙酰度(50%~95%)的壳聚糖、淀粉及纤维素均具有水解活性,其中以胶体几丁质为底物时酶活力最高(2.24 U·mg^(−1))。由扫描电镜结果可知,几丁质经盐酸(HCl)预处理后得到的胶体几丁质纤维结构变得松散,更有利于MaChi3的水解作用。以胶体几丁质为底物时动力学参数K_(m)和V_(max)值分别为5.93 mg·mL^(−1)和8.58μmol·(min·mg)^(−1)。此外,胶体几丁质经MaChi3酶解后生成的主产物为N,N-二乙酰基壳二糖,产率(几丁质)为285.54 mg·g^(−1)。该酶展现出良好的酶学特性,为其在几丁质资源中的开发和应用奠定了基础。

关键词：橙黄小单孢菌几丁质酶克隆表达酶学性质 N,N-二乙酰基壳二糖

耐热微泡菌（Microbulbifer thermotolerans）几丁质酶的基因克隆表达及酶学性质分析

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广西科学 2024年

作者：欧阳玉滢林梅王巧贞卢波吕心悦黄俊周蓉梁士颉覃秋容王青艳黄庶识廖思明广西大学化学化工学院南宁学院食品与质量工程学院广西科学院生物科学与技术研究所非粮生物质能技术全国重点实验室国家非粮生物质能源工程技术研究中心

本研究克隆表达耐热微泡菌Microbulbifer thermotolerans YLW106菌株的几丁质酶基因并探究重组酶的酶学性质。从耐热微泡菌Microbulbifer thermotolerans YLW106菌株中克隆几丁质酶基因Chi2375，构建重组质粒pET30a-Chi2375，在大肠杆... 详细信息

本研究克隆表达耐热微泡菌Microbulbifer thermotolerans YLW106菌株的几丁质酶基因并探究重组酶的酶学性质。从耐热微泡菌Microbulbifer thermotolerans YLW106菌株中克隆几丁质酶基因Chi2375，构建重组质粒pET30a-Chi2375，在大肠杆菌经诱导表达、纯化后，进行酶学性质研究。实验结果表明，以胶体几丁质为底物，重组酶Chi2375的最适反应温度Topt为55.0 ℃、最适pH值为8.0、Vmax和Km分别为7.49±0.25 U·mg-1、33.75± 1.24 mg·mL-1。同时Chi2375与胶体几丁质反应的产物为纯度93%以上的几丁二糖，在医药和食品上具有潜在的应用前景。

关键词：耐热微泡菌几丁质酶克隆表达纯化酶学性质