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载藤黄酸-地西他滨光聚合水凝胶协同抗三阴性乳腺癌复发及术后伤口管理的研究

载藤黄酸-地西他滨光聚合水凝胶协同抗三阴性乳腺癌复发及术后伤...

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作者：糜丹丹成都中医药大学

学位级别：硕士

目的:本课题以中药藤黄中的抗肿瘤活性成分藤黄酸（GA）和DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨（DEC）作为焦亡诱导药物,以聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEG-DMA）和甲基丙烯酰化丝胶蛋白（SER-MA）为载体,受中医理论指导下扶正祛邪治疗原则的启发... 详细信息

目的:本课题以中药藤黄中的抗肿瘤活性成分藤黄酸（GA）和DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨（DEC）作为焦亡诱导药物,以聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEG-DMA）和甲基丙烯酰化丝胶蛋白（SER-MA）为载体,受中医理论指导下扶正祛邪治疗原则的启发,结合现代科学技术,采用光聚合法制备一种可以用于填充三阴性乳腺癌切除腔和防止肿瘤复发的水凝胶。并对水凝胶特性、体外抗肿瘤活性、体内外生物相容性,体内促伤口愈合能力及体内抗肿瘤药效进行评价。研究载藤黄酸-地西他滨水凝胶通过细胞焦亡途径对肿瘤复发和转移的抑制作用,为TNBC治疗中,抑制肿瘤复发和转移的药物和药物递送系统的选用和开发提供思路并奠定研究基础。方法:（1）载药水凝胶的制备和表征。采取乳化溶剂挥发法制备藤黄酸PLGA纳米粒（GA NPs）,并对纳米粒进行基本表征。确立PEG-DMA和SER-MA混合的适宜比例,对PEG-DMA、SER-MA、PEG-DMA/SER-MA水凝胶的微观结构、光聚合前后结构变化、弹性模量、溶胀性能、硬度、孔隙率和体外药物释放等基本性质进行表征。选取亲水性荧光染料罗丹明B和疏水性荧光染料Di D分别模拟DEC和GA的体内药物释放规律。（2）药物联合的作用机制研究。选取香豆素-6（C6）荧光探针模拟GA,考察C6和C6 NPs在细胞中的摄取情况;采用MTT法考察DEC和GA对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖活力的影响;通过q PCR实验确定DEC对4T1细胞中Gsdme基因表达的影响;测定DEC和GA药物作用后体外细胞的LDH释放率、细胞焦亡率、细胞形态、细胞迁移能力以及细胞内焦亡相关蛋白（GSDME-FL、GSDME-N、caspase-3和cleaved-caspase-3）的表达水平。（3）水凝胶生物相容性评价。通过MTT法考察水凝胶浸提液对小鼠成纤维L929细胞增殖活力的影响;考察水凝胶浸提液的溶血活性;将水凝胶植入小鼠体内评估其体内生物相容性和体内降解;通过小鼠创面愈合模型评价水凝胶促伤口愈合的能力。（4）载药PEG-DMA/SER-MA水凝胶的体内药效学评价和作用机制研究。通过在小鼠第四对乳腺脂肪垫注射4T1-luc细胞构建小鼠三阴性乳腺癌原位模型;将肿瘤手术切除后,原位光固化载GA NPs/DEC水凝胶填充手术空腔;通过活体动物成像系统监测肿瘤的复发和转移,记录小鼠的体重和肿瘤体积;通过免疫组化、免疫荧光和流式细胞术等实验评价GA NPs/DEC水凝胶的抗肿瘤活性以及对肺转移的抑制作用。结果:（1）得到质地均匀,呈球形的GA NPs,粒径为216.8±5.5 nm,PDI为0.197±0.032,zeta电位为-22.31±0.46 m V,包封率为57.2±1.3%,载药量为5.2±0.2%;在4℃、室温和37℃的储存条件下,12天内纳米粒的粒径和PDI均表现出良好稳定性。通过处方优化得到的PEG-DMA/SER-MA水凝胶中两种材料的含量分别为:10%PEG-DMA（v/v）和5%SER-MA（w/v）;通过扫描电镜可以观察到PEG-DMA/SER-MA水凝胶具有更多孔的结构;激光共聚焦显示杂化水凝胶较单一水凝胶孔隙结构更完整,SER-MA水凝胶破碎点最多;FT-IR显示光交联不影响PEG-DMA和SER-MA的主要化学结构;弹性模量结果显示,PEG-DMA/SERMA水凝胶较2种单一水凝胶的模量更小,刚度更小;杂化水凝胶垂直和平行方向的压缩模量相差1.12倍;PEG-DMA、SER-MA和PEG-DMA/SER-MA水凝胶均不会明显溶胀;杂化水凝胶的硬度最小,孔隙率最高;体内外药物释放结果一致,DEC和罗丹明B可以在短时间内大量释放（分别为1 h和24 h）,GA和Di D可以在体内分别持续释放超过8天和28天。（2）细胞摄取结果表明,C6 NPs的细胞摄取量明显多余游离C6,将药物包载于纳米粒中能够更有效促进细胞摄取,从而诱导细胞死亡;MTT结果表明GA对4T1细胞的增殖抑制呈剂量依赖性,IC为0.12μmol/L,DEC的IC为147μmol/L,低浓度DEC不具有抗肿瘤活性;q PCR实验表明,DEC在短时间内（12 h）能够有效提高4T1细胞中Gsdme基因的表达;流式结果显示DEC处理后的细胞提高细胞焦亡发生的可能性,与GA共同作用引起更多癌细胞的死亡;GA和DEC共同处理增加细胞中LDH的释放量;同时能够观察到细胞焦亡的典型形态,而单独药物作用的细胞不呈现明显焦亡形态;划痕实验表明,DEC和GA共同作用于4T1细胞能够有效抑制细胞迁移;WB实验中,检测到GA和DEC共同处理后的细胞中GSDME-N和cleaved-caspase-3的表达水平增加。（3）将24 h水凝胶浸提液与L929细胞共同孵育,PEG-DMA/SER-MA水凝胶不会明显

关键词：藤黄酸地西他滨光聚合水凝胶三阴性乳腺癌术后复发伤口愈合细胞焦亡

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可生物降解双组份聚氨酯粘合剂和光聚合水凝胶的制备及性能研究

可生物降解双组份聚氨酯粘合剂和光聚合水凝胶的制备及性能研究

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作者：张浩山东师范大学

学位级别：硕士

医用聚氨酯材料具有良好的无生物毒性、可生物降解性、血液相容性,生物相容性,并且机械性能优异,应用范围广泛。针对传统聚氨酯粘合剂与水凝胶进行改进,研制了医用双组份聚氨酯粘合剂与医用水凝胶。通过以不同臂数的聚醚（环氧乙烷环氧... 详细信息

医用聚氨酯材料具有良好的无生物毒性、可生物降解性、血液相容性,生物相容性,并且机械性能优异,应用范围广泛。针对传统聚氨酯粘合剂与水凝胶进行改进,研制了医用双组份聚氨酯粘合剂与医用水凝胶。通过以不同臂数的聚醚（环氧乙烷环氧丙烷嵌段共聚物,PPEO）为主要原料,并用L-丙交酯（L-LA）或ε-己内酯（ε-CL）在辛酸亚锡催化下进行本体开环聚合,得到不同聚酯改性的羟基预聚物,然后用六亚甲基二异氰酸酯（HDI）分别对其进行封端,制备了端异氰酸基（-NCO）的预聚物（B组份）,与天冬氨酸酯化合物（ASP,A组份）混合反应,得到一种双组份聚氨酯粘合剂。通过NMR、FT-IR、HR-TOF-MS、TGA、DSC等对羟基预聚物、端异氰酸基预聚物、天冬氨酸酯化合物及聚氨酯粘合剂的结构和性能进行表征和研究。通过二正丁胺法确定在异氰酸酯预聚物制备时最佳合成工艺为异氰酸根与羟基之比为3,反应时间为3.5～4 h,此时得到的预聚物黏度与流动性最为适宜;通过对A、B组份不同比例的研究,确定异氰酸根指数为1.2时,得到的粘合剂具有较快的表干时间（min）和固化时间（min）,同时也具有较好的机械性能（断裂强度:2.8 MPa;断裂伸长率:60%）和粘结强度（74 N·cm-2）;DSC研究表明存在两个玻璃转化温度,证明结构中存在微相分离现象;TGA曲线出现三个热分解阶段,第一阶段为脲基与氨基甲酸酯基的分解,第二阶段是酯基的分解,第三阶段为其软段醚基的分解;通过对聚氨酯粘合剂薄膜进行接触角与体外降解分析,发现聚氨酯粘合剂中酯基所占比例的越多,降解速率越快,因此可以通过调控酯基含量来控制降解速率,从而制备生物体不同部位所需的粘合剂。通过以不同臂数的聚乙二醇（n-arm-PEG,n=2、3、4）、ε-CL为原料在辛酸亚锡催化下进行本体开环聚合制备了聚酯改性聚乙二醇（n-arm-PEG-PCL）,然后与丙烯酰氯反应获得丙烯酸酯封端聚酯改性聚乙二醇预聚物（n-arm-PEG-PCL-AC）。通过FT-IR、1H NMR等对产物及中间体预聚物的结构进行了表征。对预聚物水溶液在紫外光下光敏性能的研究表明,成凝胶时间随着聚合物水溶液浓度的升高、聚合物臂数的增加而降低;体外降解研究表明聚酯改性后凝胶的降解速率比改性前大幅度提高,并且降解速率随着聚合物臂数的增加而降低;药物（头孢布烯）缓释研究表明水凝胶的缓释速率与降解速率一致,缓释时间可达15-30天,表明水凝胶对药物有优良的缓释效果。本文还通过在预聚物水溶液中加入丙烯酸制备了p H敏感的水凝胶,该水凝胶的溶胀率、药物缓释速率随p H值增加而明显增加,可通过生物体不同部位p H值的不同实现体内给药。

关键词：可生物降解聚氨酯粘合剂光聚合水凝胶药物缓释

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抗耐药菌感染创面修复的K31-PGLa水凝胶的构建及其功能评价

抗耐药菌感染创面修复的K31-PGLa水凝胶的构建及其功能评价

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作者：刘文杰重庆大学

学位级别：硕士

皮肤创面愈合过程中因暴露于空气,往往会面临细菌感染的风险。但随着抗生素的滥用,细菌逐步演变出耐药性,由耐药菌感染导致的皮肤创面损伤难以得到有效治愈,已经成为临床上关注的问题。抗生素是治疗细菌感染的主要手段,但新型抗生素的... 详细信息

皮肤创面愈合过程中因暴露于空气,往往会面临细菌感染的风险。但随着抗生素的滥用,细菌逐步演变出耐药性,由耐药菌感染导致的皮肤创面损伤难以得到有效治愈,已经成为临床上关注的问题。抗生素是治疗细菌感染的主要手段,但新型抗生素的开发存在周期长、成本高等特点,并且一旦应用于临床中依旧面临产生耐药性的问题。因此,基于细菌的耐药机制,提出有效抑制耐药性的方法以提高传统抗生素的抑菌效果,并联合生物材料促进创面修复的作用,做出一种新材料能同时解决愈合与抗耐药菌的两大问题,为临床治疗提供一种新思路。本论文借助抗菌肽PGLa可通过抑制外排泵合成的相关基因(acr A、acr B、tol C)的表达抑制外排泵合成,提高细菌对抗生素的敏感性的特点;以及角蛋白K31促进细胞增殖和迁移加速创面修复的功能,设计和表达了K31-PGLa融合蛋白,并通过接枝PEGDA形成光聚合水凝胶。采用实验室进化获得耐药细菌,考察了K31-PGLa融合蛋白对不同耐药菌的抑制效果;进而通过构建小鼠耐药菌感染皮肤全层缺损模型评价了K31-PGLa水凝胶的体内抑菌和皮肤修复效果。本文主要研究内容和结果:(1)设计了K31-PGLa融合蛋白基因序列,并构建表达质粒,以大肠杆菌中进行原核表达。融合蛋白纯化后进行SDS-PAGE、FT-IR、CD、UV-vis等理化表征。SDS-PAGE结果显示蛋白条带单一,分子量与理论值一致(50.87 k Da);FT-IR图谱显示K31-PGLa融合蛋白特征吸收峰与K31相似,多为肽键特征峰;CD图谱结果证明K31-PGLa融合蛋白与K31的二级结构主要为α螺旋,且K31-PGLa的α螺旋占比高于K31;而UV-Vis图谱表明K31-PGLa的最大吸收峰在260 nm附近,与人发角蛋白的最大吸收峰相似。综上所述,实验结果证明K31-PGLa融合蛋白的表达成功,其结构与性质与K31相似。(2)以大肠杆菌***和金黄色葡萄球菌***为实验对象考察了K31-PGLa融合蛋白的抑菌效果。结果显示K31-PGLa具有一定的抑菌效果,当其浓度为256μg/m L时,对***和***的抑菌率分别为38.33%和36.79%,但弱于阳性药物氨苄西林和环丙沙星。进而实验室进化获得耐药菌,实验发现联合使用K31-PGLa和抗生素的抑菌效果显著优于单一药物或蛋白;以耐AMP的***为例,200μg/m L AMP的抑菌率约为58.06%,其与K31-PGLa联合使用时抑菌率约为89.53%;此外,实现发现K31-PGLa处理的耐药菌其外排泵合成相关的基因(acr A、acr B、tol C)表达下调,说明K31-PGLa的抗菌机制主要通过抑制外排泵合成减少药物的泵出。(3)通过K31-PGLa的巯基与PEGDA的碳碳双键反应合成K31-PGLa/PEGD光聚合水凝胶。建立耐药菌感染的小鼠全层皮肤损伤模型考察K31-PGLa水凝胶的修复效果。BALB/c小鼠的白细胞总数和中性粒细胞含量约为6～9×10/L,高出正常小鼠4～5倍,说明存在严重的细菌感染。K31-PGLa水凝胶组在14天时创面愈合率达到79.86%,显著高于空白组(55.98%);并且组织切片H&E染色发现K31-PGLa水凝胶组具有更薄的表皮层和更多的皮肤附属物。此外,K31-PGLa水凝胶组与空白组相比,其血液中白细胞和中性粒细胞水平在第3天显著升高,而在7天后显著降低,证明K31-PGLa治疗早期具有刺激免疫系统协同抗菌的作用。而通过SD大鼠皮下植入K31-PGLa考察其生物相容性。实验发现植入21天后可完全降解,且皮肤表面没有出现红肿等炎症现象。ELISA检测未发现IL-1β,IL-6,TNF-α显著上升,说明K31-PGLa具有良好的生物相容性。综上所示,本课题以临床治疗耐药菌感染的皮肤组织损伤这一重大需求为出发点,设计了K31-PGLa融合蛋白以联合常用抗生素实现了抗菌-修复协同治疗的新策略。本论文的实施可为耐药菌感染创面的临床治疗提供更多选择,角蛋白K31-PGla融合蛋白的设计构建可为角蛋白新型抗菌材料的设计和开发提供指导。

关键词：角蛋白K31 抗菌肽PGLa 耐药菌光聚合水凝胶组织修复

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光聚合可注射仿生软骨的构建和性能研究

光聚合可注射仿生软骨的构建和性能研究

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作者：杨硕硕武汉纺织大学

学位级别：硕士

软骨组织结构特殊,缺乏再生能力,损伤后会留下永久性的病变。运动导致的软骨损伤十分常见,人口老龄化也加剧了软骨损伤的发生。随着组织工程技术发展,产生了多种软骨损伤修复方法,已成为国内外的研究热点。光聚合水凝胶的三维网络体系... 详细信息

软骨组织结构特殊,缺乏再生能力,损伤后会留下永久性的病变。运动导致的软骨损伤十分常见,人口老龄化也加剧了软骨损伤的发生。随着组织工程技术发展,产生了多种软骨损伤修复方法,已成为国内外的研究热点。光聚合水凝胶的三维网络体系保持了大量水分,与人体组织非常相似。其前体溶液具有可注射性,经紫外光照射后,可引发原位聚合。迄今为止,光聚合水凝胶被广泛应用于软骨修复领域,具有生物相容性良好和微创等优点。研究者们制备出很多水凝胶,却依然存在强度和生物相容性的问题。然而,通过合成高分子和天然高分子复合,或天然高分子间的复合可以有效提高光聚合水凝胶支架的机械强度,同时保持较高的生物相容性。针对上述光聚合水凝胶用于软骨修复存在的问题,本文从提高其强度和生物相容性入手,设计合成了具有光化学活性的甲基丙烯酰基聚乙烯醇(MPVA),马来酰化壳聚糖(MCS)以及甲基丙烯酰化丝素蛋白(MSF)微纳米粒子;通过1HNMR、IR、XRD、DSC等测试手段,分别对上述3种单体的结构、结晶性和热行为等进行表征。并利用紫外光聚合技术制备出MPVA水凝胶、MCS/MPVA复合水凝胶以及MCS/MSF复合水凝胶。采用Photo流变、扫描电镜(SEM)、压缩、溶胀、细胞毒(MTT)等测试,分别研究了上述3种不同体系水凝胶的聚合动力学性能、微观形貌、力学性能、溶胀性能和生物相容性。结果表明MPVA有3种取代度,其水溶液能在20s以内开始凝胶化。其中取代度为0.01的MPVA1水凝胶力学性能优异,高于人体软骨强度(0.5MPa)。在形变量达到80%以上时仍然不被损坏,压缩强度大于0.7MPa。外力撤除后,依然能回复原貌,显示出高强度与弹性。MCS/MPVA复合水凝胶的力学性能和生物相容性良好。MCS1/MPVA1=25/75复合水凝胶的压缩强度为0.41MPa,是人体软骨强度的82%。MTT实验结果表明该复合水凝胶对L-929老鼠成纤维细胞无毒性。MCS/MSF复合水凝胶中,MSF微纳米粒子是次级交联点,与MCS分子链交联共聚。其中(6wt%)MCS+(0.01wt%)MSF复合水凝胶的压缩强度为0.15MPa,达到人体软骨强度的30%;MTT实验结果表明添加生长因子TGF-β1后,该水凝胶对小鼠关节软骨细胞毒性很低。上述3种水凝胶支架具有可注射和仿生两种特性,生物相容性良好且强度高。与软骨损伤部位嵌合紧密、微创且易塑形,有助于损伤部位修复。

关键词：软骨修复光聚合水凝胶可注射仿生支架

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透明质酸组织粘合剂的制备与性能研究

透明质酸组织粘合剂的制备与性能研究

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作者：周鼎武汉纺织大学

学位级别：硕士

组织粘合剂是一类可以直接应用于人体的生物医用材料,通过使用组织粘合剂可以更加快速的闭合伤口,而且在后期的治疗中也能对创伤起到加快修复的作用,同时,在应对一些急性内脏损伤时,组织粘合剂可以更加及时的阻止血液流失,得益于此,组... 详细信息

组织粘合剂是一类可以直接应用于人体的生物医用材料,通过使用组织粘合剂可以更加快速的闭合伤口,而且在后期的治疗中也能对创伤起到加快修复的作用,同时,在应对一些急性内脏损伤时,组织粘合剂可以更加及时的阻止血液流失,得益于此,组织粘合剂被认为是是最有前景的研究领域之一。然而,现有的组织粘合剂普遍存在湿态粘附性能差,与组织不能完全贴合以及密封性能不够等问题,限制了组织粘合剂的进一步应用。因此,开发出具有良好粘附性能和生物相容性的组织粘合剂具有重要意义。针对组织粘合剂存在的湿态粘附性能差,生物相容性不够,粘附强度不高等问题,本文提出以人体内广泛存在的细胞外基质成分透明质酸为基础,通过多巴胺化、马来酰化等结构修饰,制备出多巴胺接枝的醛基透明质酸、马来酰化透明质酸以及多巴胺接枝的马来酰化透明质酸,结合紫外光聚合技术,构建了一系列的透明质酸组织粘合剂。通过流变仪、扫描电子显微镜、万能材料试验机等仪器对透明质酸粘合剂体系的凝胶动力学、微观形貌、搭载剪切强度、爆破压力等性能进行了系统性研究。本文取得的进展如下:(1)多巴胺接枝醛基化透明质酸组织粘合剂:合成了两种多巴胺基团取代度分别为45%和25%的多巴胺接枝醛基化透明质酸(DAHA),在与弱碱性高碘酸钠溶液混合下,能在40s内快速形成凝胶,大量的多巴胺基团提供了优异的湿态粘附强度(90 kPa),高黏附能(384.6±26.0 J·m),较高的爆破压力(65 kPa)。并且,在生物学性能方面,该水凝胶能很好地促进L929细胞的生长和贴附,对其不显示细胞毒性。(2)马来酰化透明质酸组织粘合剂:利用透明质酸骨架上丰富的羟基位点进行化学修饰,成功在透明质酸骨架上接枝碳碳双键,合成了两种碳碳双键取代度分别为2.15和1.1的马来酰化透明质酸(MHA)。在紫外光(波长:320-400 nm,光强:30 mW/cm)照射下光交联形成凝胶,同时还展现出卓越的粘附强度(21.4±2.2 kPa),高黏附能(150.2±8.3 J·m),较短的成型时间(280 s)。在生物学性能方面,MHA水凝胶能很好地促进人体脐静脉内皮细胞的生长和贴附,对其不显示毒性。(3)多巴胺接枝马来酰化透明质酸组织粘合剂:在成功合成MHA后,选取取代度为2.15的MHA进一步进行化学修饰接枝多巴胺基团,经过两步反应,成功合成了同时具有碳碳双键和多巴胺基团的多巴胺接枝马来酰化透明质酸(MHA-DP)。在紫外光(波长:320-400nm,光强:30mW/cm)光照和氧化环境下,都能原位形成凝胶,且在湿态环境下能保持持续的粘附能力。其还具有高粘附强度(36.2±3.1 kPa),高黏附能(367.3±15.2 J·m),较短的成型时间(290 s)以及合适的爆破压力(31.13 kPa)。综上:以DAHA,MHA,MHA-DP为基料的三个水凝胶体系均显示出良好的组织粘附性能和生物相容性,在湿态环境下也能够保持持续粘附能力,多组分的配比可以满足不同组织对粘附能力的需求,在生物医用粘合剂领域具有广阔应用潜力。三种粘合剂体系各有不同的优势,其中在粘附强度和水下粘附强度方面:DAHA>MHA-DP>MHA;在粘附能方面:DAHA>MHA-DP>MHA;在爆破压力方面:DAHA>MHA-DP>MHA;在凝胶弹性方面:MHA-DP>MHA>DAHA。在不同的部位以及环境下使用时,本文所开发的三种粘合剂可以搭配使用,以满足不同需求。

关键词：透明质酸多巴胺生物相容性光聚合水凝胶组织粘合剂

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