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基于活体钙成像观察脊髓损伤后大脑皮层钙信号变化的实验研究

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基于活体钙成像观察脊髓损伤后大脑皮层钙信号变化的实验研究

作者：袁士阳天津医科大学

学位级别：硕士

【目的】脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是严重的中枢神经系统创伤性疾病,会导致完整的脑-脊髓感觉运动传导通路受损。由于神经系统高度的可塑性,脊髓损伤后会出现病理性神经痛、痛觉过敏、异常感觉和患肢痛等大脑高级中枢相关的神... 详细信息

【目的】脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是严重的中枢神经系统创伤性疾病,会导致完整的脑-脊髓感觉运动传导通路受损。由于神经系统高度的可塑性,脊髓损伤后会出现病理性神经痛、痛觉过敏、异常感觉和患肢痛等大脑高级中枢相关的神经并发症,但脊髓损伤后大脑重塑的机制尚未完全明确。钙离子是神经系统重要的信号分子,其活动可以间接反应神经元的活性。本研究采用基因编码的钙离子指示剂和活体钙成像技术,观察脊髓损伤后初级感觉和运动皮层神经元钙信号动力学以及皮层可塑性的改变,在细胞水平明确脊髓损伤后大脑皮层重塑机制,为脊髓损伤后病理性神经重塑提供预防策略。【方法】1.开颅和GCaMP6f病毒注射:出生8-10周的C57BL/6J雌性小鼠在立体定位下开颅窗,AAV2/1-syn-GCaMP6f-WPRE-SV40病毒注射,注射部位分为初级感觉皮层或初级运动皮层,后等待3-4周待病毒充分表达。2.实验分组和动物模型制备:右侧初级感觉皮层表达GCaMP6f的小鼠随机分为三组:sham、脊髓左侧半切(对侧损伤)和右侧半切(同侧损伤),sham小鼠实施椎板切除,损伤小鼠实施左侧或右侧脊髓半切损伤。右侧初级运动皮层表达GCaMP6f的小鼠实施左侧半切损伤(对侧损伤)。3.初级感觉皮层双光子活体钙成像:采用双光子显微镜活体观察脊髓损伤前30分,损伤后3天、7天、14天及28天小鼠初级感觉皮层神经元钙信号的变化。4.自由活动状态下初级运动皮层光纤活体钙信号记录:采用光纤活体记录自由活动小鼠脊髓损伤前30分,脊髓损伤后3天、7天、14天及28天小鼠初级运动皮层神经元钙信号的变化。5.数据分析:采用基于MATLAB编写的Mosaic校正软件和Fluoro SNNAP分析软件对双光子记录的数据进行校正和分析,分析脊髓损伤前和脊髓损伤后各个时间点每个神经元钙信号的频率、上升时间和衰减时间,同时分析群体神经元同步系数和功能连接;采用基于MATLAB编写的Op Signal分析软件对光纤记录的钙信号进行读取和分析,分析脊髓损伤前和脊髓损伤后各个时间点每个神经元钙信号的频率和幅值。【结果】1.脊髓损伤后同侧大脑初级感觉皮层神经元钙信号频率在损伤后3天无差异;损伤后7天频率增加,差异有统计学意义;损伤后14天和28天无差异;上升时间和衰减时间在损伤后3天、7天、14天和28天频率差异均无统计学差异。Sham和损伤对侧脊髓损伤初级感觉皮层神经元钙信号频率差异变均无统计学意义。2.脊髓损伤后同侧大脑初级感觉皮层神经元同步系数在脊髓损伤后3天差异无统计学意义;损伤后7天增加,差异有统计学意义;损伤后14天和28天差异无统计学意义;功能连接系数在损伤后3天无差异;损伤后7天、14天和28天均增加,差异有统计学差异。Sham组和损伤对侧脊髓损伤组初级感觉皮层神经元同步系数和功能连接系数均差异无统计学意义。3.自由活动状态下,脊髓损伤后损伤对侧大脑初级运动皮层钙信号频率和幅值在损伤后3天、7天、14天和28天差异均无统计学意义。【结论】1.初级感觉皮层神经元钙信号频率和同步性在脊髓损伤后第7天升高,频率和同步性参与早期异常感觉形成和早期皮层重塑。2.初级感觉皮层神经元钙信号功能连接在脊髓损伤后7天、14天和28天升高,在28天最明显,神经元功能连接参与长期慢性皮层重塑。3.初级运动皮层神经元钙信号频率和幅值在脊髓损伤后未观察到变化,神经元钙信号的兴奋性和同步性未参与运动皮层重塑。

关键词：脊髓损伤钙信号双光子显微镜光纤光度法初级感觉皮层初级运动皮层

攀爬纤维投射模式及基于光纤的钙信号记录研究

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攀爬纤维投射模式及基于光纤的钙信号记录研究

作者：唐杰昌重庆大学

学位级别：硕士

下橄榄-小脑神经环路(Inferior olivo-cerebellar neural circuit)对于将运动和非运动信息从下橄榄(Inferior olive,IO)传递到小脑皮层非常重要。目前已经建立了几种研究下橄榄-小脑神经环路的方法,如电生理记录和双光子钙成像技术,但... 详细信息

下橄榄-小脑神经环路(Inferior olivo-cerebellar neural circuit)对于将运动和非运动信息从下橄榄(Inferior olive,IO)传递到小脑皮层非常重要。目前已经建立了几种研究下橄榄-小脑神经环路的方法,如电生理记录和双光子钙成像技术,但主要是通过记录小脑皮层浦肯野细胞的复杂放电(complex spike,CS)活动来研究该环路功能。并且,这些技术方法并非针对在体实验观察专门设计,因此将其应用到活体或者自由运动的实验动物上具有很高的技术挑战性。在本研究中,结合病毒示踪、基因编码钙离子指示剂标记、立体定位注射、光纤光度法等实验方法和特定行为学范式,我们成功建立了一个稳定的联合方法来记录小鼠自由运动时攀爬纤维(Climbing fiber,CF)的钙离子活动信号。首先,我们使用病毒示踪方法探索了下橄榄-小脑神经环路的纤维联系,然后结合基因编码钙离子指示剂和光纤记录技术,进一步探究了小鼠在麻醉和清醒状态下,其CF钙信号特征与特定行为的相关性。研究结果如下:1.下橄榄核的输入输出(1)下橄榄核主要接收中脑联结区多个核团如达克谢维奇核(The nucleus of Darkschewitsch,Dk),红核(Red nucleus,R),卡哈尔间质核(The interstitialis nucleus of Cajal,In C),丘脑室旁核(Parafascicular thalamic nucleus,Pa F)等的纤维投射;(2)下橄榄核输出攀爬纤维穿过脑干中线,然后沿着对侧的三叉神经脊髓束(The spinal trigeminal tract,sp5)和小脑下脚(The inferior cerebellar peduncle,icp)进入小脑,主要投射到小脑皮层,纤维末端终止于分子层(Molecular layer,Mol)。2.小脑皮层的攀爬纤维的投射模式下橄榄尾侧神经元被顺行示踪病毒标记后,在对侧小脑皮层发现了高密度的被标记的攀爬纤维。结果表明下橄榄内侧副核(medial accessory olive,MAO)投射到小脑皮层的攀爬纤维中,在蚓部小叶IV/V最为密集,超过三分之一的攀爬纤维总密度集中在该小叶内(35.56%±4.80%)。3.不同麻醉深度对小脑小叶Ⅳ/Ⅴ的CF钙信号的影响(1)不同麻醉深度对小脑小叶Ⅳ/Ⅴ的CF钙信号发放率的影响随着异氟烷浓度的逐渐增加(0.6%、1.0%、1.2%、1.4%、1.8%,异氟烷/空气),小脑蚓部小叶Ⅳ/Ⅴ的CF钙信号发放率相应降低,从0.37±0.05 Hz(麻醉深度0.6%)降低到0.006±0.005 Hz(麻醉深度1.8%)。相同麻醉深度(0.6%)下,实验组(GCa MP7)和对照组(GFP)的荧光变化频率有显著统计学差异。(2)不同麻醉深度对小脑小叶Ⅳ/Ⅴ的CF钙信号幅度的影响CF钙信号幅度比较稳定,受麻醉深度的影响较小。随着麻醉深度的提高,钙信号幅值(?F/F)无显著变化。相同麻醉深度下,实验组和对照组的荧光变化幅值有显著统计学差异。4.自由运动状态下小脑小叶Ⅳ/Ⅴ的CF钙信号记录(1)随机运动对光纤记录小叶Ⅳ/Ⅴ的CF钙信号的影响当小鼠处于清醒自由运动状态时,在实验组观察到较大的行为相关钙荧光变化幅值(ΔF/F,4.71%±1.05%),但在对照组中监测到的荧光变化幅值极低(ΔF/F,0.18%±0.11%)。说明我们记录到的钙荧光强度变化是CF钙活动引起的钙信号,而不是运动噪音。(2)光纤记录方法能长时间稳定记录行为依赖性的CF钙信号持续五天的钙信号记录结果显示,随着时间的推移,行为相关的钙信号在连续多天内都被监测到,且钙信号振幅没有显著统计学差异。(3)小脑蚓部小叶IV/V的CF钙信号与肢体平衡性运动行为同步小鼠在旷场中表现出多种行为模式,如“踮脚直立(Tiptoe standing)”、“非踮脚站立(Rearing)”、“理毛(Grooming)”、“转身(Turning)”和“走动(Locomotion)”等行为。其中,“踮脚直立”和“非踮脚站立”的CF钙信号幅值变化显著高于其他行为,与其他行为的幅值变化相比具有统计学差异。但二者没有显著统计学差异。(4)运动协调相关行为起始超前于CF钙信号起始我们进一步分析了后肢站立行为与钙信号的关联性。发现这两种后肢站立行为的起始都超前于钙信号起始。进一步分析表明,非踮脚站立行为的超前时间中位数是200 ms,踮脚直立行为超前时间中位数是180 ms,且都近似于高斯分布。说明后肢站立行为发生在钙信号产生之前,因此推测小脑蚓部小叶Ⅳ/Ⅴ的CF编码的是来自下橄榄核的负反馈信息。

关键词：下橄榄-小脑神经环路攀爬纤维光纤光度法小脑蚓部IV/V小叶自由运动

睡眠剥夺通过降低背侧海马锥体神经元兴奋性加重异氟烷暴露小鼠的认知功能损害

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睡眠剥夺通过降低背侧海马锥体神经元兴奋性加重异氟烷暴露小鼠的...

作者：张凯天津医科大学

学位级别：硕士

目的围术期神经认知功能障碍(perioperative neurocognitive disorders,PND)是指术前和术后发生的认知功能的破坏或者变化。临床上择期手术患者面临的睡眠障碍现象越来越多见,但睡眠障碍对PND的影响及机制尚不清楚。近年来,不少研究已... 详细信息

目的围术期神经认知功能障碍(perioperative neurocognitive disorders,PND)是指术前和术后发生的认知功能的破坏或者变化。临床上择期手术患者面临的睡眠障碍现象越来越多见,但睡眠障碍对PND的影响及机制尚不清楚。近年来,不少研究已经证实单独睡眠剥夺或不同吸入麻醉药均可导致不同程度的认知功能损害,且都与海马组织的功能和结构损伤存在密切关系。本研究采用光纤光度法、高尔基染色以及脑片全细胞膜片钳技术,旨在观察24小时睡眠剥夺对异氟烷暴露小鼠的背侧海马锥体神经元的钙信号,树突棘密度和微小型兴奋性突触后电流(Mini excitatory postsynaptic current,m EPSC)的影响。明确睡眠剥夺对异氟烷麻醉认知功能障碍的影响及机制,为临床患者的术前准备提供理论指导。方法1.实验动物及分组:将8-10周龄的C57BL/6雄性小鼠随机分为4组:对照组,异氟烷组,睡眠剥夺组和睡眠剥夺+异氟烷组。对照组不做处理,异氟烷组小鼠吸入1.5%浓度的异氟烷4小时,睡眠剥夺组小鼠在改良多平台水环境下剥夺24小时睡眠,睡眠剥夺+异氟烷组小鼠先剥夺24小时睡眠,随后吸入4小时1.5%浓度的异氟烷。2.认知行为学测试:采用Y迷宫和八臂迷宫分别测试小鼠的短期空间记忆和长期巩固性记忆。3.光纤光度法记录小鼠自由活动时背侧海马神经元的钙信号:小鼠在开颅后通过立体定位精确地将AAV2/1-hsyn-GCa MP6f-WPRE-SV40病毒注射到背侧海马CA1区,等待3周以确保病毒成功表达。然后采用多通道光纤记录仪记录各组小鼠在自由活动状态下背侧海马神经元处理前后的钙信号变化。4.树突棘密度的变化:采用FD快速高尔基染色法观察背侧海马锥体神经元顶端和基底二级树突的树突棘数量。5.微小型兴奋性突触后电流变化:使用全细胞膜片钳技术在脑片水平记录m EPSC的幅值和频率。6.数据分析:钙信号数据采用MATLAB编写的Op Signal程序读取和分析,Clampfit10.6统计钙信号波的幅值和频率。m EPSC数据用Mini Analysis Program软件进行分析(Synaptosoff,Inc.,Decatur,GA)。结果1.与对照组比较,异氟烷组和睡眠剥夺组小鼠在Y迷宫新异臂中探索时间缩短且二者之间无明显差异,睡眠剥夺+异氟烷组小鼠新异臂中探索时间较异氟烷组和睡眠剥夺组更短。对照组、异氟烷组和睡眠剥夺组小鼠在八臂迷宫中寻找食物的时间和错误次数无明显差异,睡眠剥夺+异氟烷组小鼠寻找食物时间以及错误次数显著增加。2.对照组、异氟烷组和睡眠剥夺组小鼠背侧海马CA1区神经元钙信号幅值和频率在处理2小时后无明显差异,而睡眠剥夺+异氟烷组小鼠钙信号幅值在处理后2小时下降但在24小时后恢复。与对照组相比,其他三组小鼠背侧海马CA1区神经元钙信号幅值在Y迷宫实验中受到影响,而在八臂迷宫实验中未出现统计学差异。3.与对照组比较,异氟烷组小鼠背侧海马CA1区锥体神经元的二级顶端和基底树突的树突棘密度均显著减少,睡眠剥夺组树突棘密度均明显增加,睡眠剥夺+异氟烷组树突棘密度则无明显差异。4.与对照组比较,异氟烷组和睡眠剥夺组小鼠背侧海马锥体神经元m EPSC频率明显降低而二者之间无明显差异,睡眠剥夺+异氟烷组小鼠m EPSC频率相较于异氟烷组和睡眠剥夺组更低。四组小鼠之间m EPSC幅值无统计学差异。结论1.成年小鼠在异氟烷麻醉前经历24小时的睡眠剥夺不仅会加重短时记忆障碍还能导致长时且巩固记忆的损害。2.无论是4小时1.5%异氟烷吸入还是24小时睡眠剥夺都不足以影响小鼠在自由活动时背侧海马CA1神经元兴奋性,然而当两者同时作用于一个个体时,背侧海马神经元兴奋性会出现可逆的下降。背侧海马神经元的兴奋活动与短期空间记忆行为学表现相关,而与长期巩固性记忆行为学损害变化不一致。3.24小时的睡眠剥夺会增加异氟烷麻醉引起的背侧海马CA1神经元树突棘数量的减少,然而增加的可能是不成熟的、功能不全的树突棘。4.睡眠剥夺主要通过影响突触前囊泡递质释放来降低异氟烷处理后背侧海马神经元的兴奋性。

关键词：异氟烷麻醉睡眠剥夺认知功能背侧海马CA1神经元光纤光度法微小型兴奋性突触后电流

VLPAG神经元在排尿活动中作用的初步研究

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VLPAG神经元在排尿活动中作用的初步研究

作者：饶宇中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

排尿的生理功能是排出代谢废物和维持体液平衡。中脑导水管周围灰质区(periaqueductal gray,PAG)和脑桥排尿中枢(pontine micturition center,PMC)能够支配膀胱逼尿肌,并且已证实这两个脑区之间存在解剖和功能上的连接。目前关于膀胱神... 详细信息

排尿的生理功能是排出代谢废物和维持体液平衡。中脑导水管周围灰质区(periaqueductal gray,PAG)和脑桥排尿中枢(pontine micturition center,PMC)能够支配膀胱逼尿肌,并且已证实这两个脑区之间存在解剖和功能上的连接。目前关于膀胱神经调控的观点是:PAG神经元在接收到大脑高级脑区做出的排尿决定后,通过直接投射并激活PMC来启动排尿反射。这些特异性投射至PMC的PAG神经元可能是排尿决定下传至PMC的“中继站”。根据功能学和解剖学分类,PAG被分为侧柱(lateral periaqueductal gray,LPAG)、腹外侧柱(ventrolateral periaqueductal gray,VLPAG)、背内侧柱(dorsomedial periaqueductal gray,DMPAG)和背外侧柱(dorsolateral periaqueductal gray,DLPAG),其中腹外侧柱(VLPAG)在控制排尿中发挥了主要作用。一般观点认为,VLPAG通过投射至PMC来控制排尿和膀胱收缩,然而,特异性投射至PMC的VLPAG神经元的确切位置以及这群神经元在排尿发生时或排尿周期中的活动模式尚未被阐明。与条件依赖性排尿(主动排尿)相关的VLPAG神经元的上游输入仍然不清楚。针对上述这些问题,在本课题中,我们主要通过嗜神经病毒逆行标记的神经环路示踪技术、光纤光度法记录Ca信号以及同步膀胱测压的实验,对VLPAG神经元在排尿活动中的作用进行了初步研究。本课题主要开展的实验如下:(1)为了明确支配膀胱逼尿肌的VLPAG神经元的解剖学分布情况,我们开展了伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)介导的逆行跨多级标记神经环路示踪的实验。(2)为了明确特异性投射至PMC的VLPAG神经元的分布情况,我们在CRH-Cre转基因小鼠中通过细胞特异性的狂犬病毒(rabies virus,RV)系统,开展了RV介导的逆行跨单级突触示踪的实验。(3)为了探究特异性投射至PMC的VLPAG神经元在小鼠排尿过程中的活动特征,我们在小鼠脑内植入光纤,并利用光纤光度法同步记录这群VLPAG神经元的活动和自由运动小鼠的排尿事件。(4)为了进一步研究小鼠膀胱收缩是否与特异性投射至PMC的VLPAG神经元的活动高度相关,我们进行了光纤光度法记录这群VLPAG神经元的Ca信号并同步膀胱测压的实验。(5)为了解析特异性投射至PMC的VLPAG神经元在全脑范围内的上游输入,我们开展了狂犬病毒(RV)介导的逆行跨单级突触示踪实验,并对被RV标记的主要脑区进行了细胞计数。本课题主要的发现如下:1.明确了支配小鼠膀胱逼尿肌的VLPAG神经元的分布情况。将表达绿色荧光蛋白的伪狂犬病毒531(PRV531)注射至成年小鼠的膀胱逼尿肌,逆行感染大脑内参与控制膀胱的VLPAG神经元。根据与小鼠脑图谱(《The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates》,2012版)比对,我们发现:PRV531逆行标记的神经元在VLPAG脑区内广泛分布(Bregma-4.12～-5.20 mm)。进一步的分析显示,这些参与支配膀胱逼尿肌的VLPAG神经元主要集中在Bregma-4.48～--4.96 mm的范围内。总而言之,这些结果表明支配膀胱逼尿肌的VLPAG神经元广泛分布于整个VLPAG中并且集中在内侧和尾侧区域。2.明确了特异性投射至PMC的VLPAG神经元的分布情况。通过对CRH-Cre转基因小鼠进行细胞特异性RV的逆行示踪实验。我们发现:RV标记的特异性投射至PMC的VLPAG神经元广泛分布于整个同侧VLPAG(Bregma-4.12～-5.20 mm)中。对同侧VLPAG中被RV标记的神经元数目做定量统计显示:大部分投射至PMC的VLPAG神经元集中在VLPAG的内侧和尾侧区域(Bregma-4.48～-4.96 mm)。平均细胞数为15±1(Bregma:-4.72 mm)～-121±7(Bregma:-4.72 mm)。总之,这部分实验对特异性投射至PMC的VLPAG神经元进行了精准定位。基于我们发现的这群VLPAG神经元核心位置的坐标(Bregma-4.48～-4.96 mm),我们将进行下一步的光纤记录实验。3.特异性投射至PMC的VLPAG神经元集群的Ca信号与排尿事件高度相关。我们发现:在每一次排尿开始前,实验组(特异性投射至PMC的VLPAG神经元表达GCa MP6f)中GCa MP6f的荧光强度即出现显著增加,然而对照组(特异性投射至PMC的VLPAG神经元表达EGFP)中EGFP的荧光强度在排尿发生前后始终没有变化。这表明实验组小鼠所记录到GCamp6f的信号变化与排尿事件

关键词：光纤光度法脑桥排尿中枢中脑导水管周围灰质腹外侧区排尿膀胱测压

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乙酰胆碱酯酶的磁效应研究

赣南医学院学报 2004年第3期24卷 241-242页

作者：林建原黄志勤朱元保赣南医学院化学教研室江西赣州341000 湖南大学湖南长沙410082

目的 :建立光纤光度法测定乙酰胆碱酯酶 (AchE)活性的方法。方法 :以酶的催化活性为检测指标 ,研究磁场对酶活力的影响。结果 :影响程度与磁场强度、磁化时间及温度有关。结论

关键词：乙酰胆碱酯酶(Ache) 磁效应光纤光度法