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基于光热表面的细胞内分子传递体系的构建

基于光热表面的细胞内分子传递体系的构建

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作者：吴静娴苏州大学

学位级别：硕士

向细胞内传递核酸、蛋白质等外源性分子在基础生物研究、工业生产以及临床诊断和治疗中具有十分重要的应用。根据外源性分子穿过细胞膜方式的不同,外源性分子传递方法主要可分为载体法和破膜法两大类。载体法利用载体包裹外源性分子,促... 详细信息

向细胞内传递核酸、蛋白质等外源性分子在基础生物研究、工业生产以及临床诊断和治疗中具有十分重要的应用。根据外源性分子穿过细胞膜方式的不同,外源性分子传递方法主要可分为载体法和破膜法两大类。载体法利用载体包裹外源性分子,促进外源性分子被细胞内吞,但通常存在传递效率低、细胞毒性大、通用性差等缺点。相比之下,破膜法通过增强细胞膜通透性的方式将外源性分子传递到细胞内部,在细胞系通用性以及可传递分子种类的普适性方面具有明显优势。例如基于具有光热效应的金纳米粒子沉积层(GNPL)的细胞内分子传递体系,利用光热穿孔机理可高效地向Hela细胞中传递多种不同尺寸的外源性分子(传递效率>95%)。但是该体系对难转染细胞的传递效率较低(光热表面的细胞内分子传递体系的功能。首先提高其对难转染细胞的分子传递效率,而后在此基础上进一步提高光热表面的细胞收获率,最终构建一种普适性强、传递效率高、细胞毒性小且细胞收获率高的细胞内分子传递体系。具体研究内容主要从以下两个方面展开:(1)结合GNPL与低分子量聚乙烯亚胺(LPEI),构建了一种对难转染细胞具有高的分子传递效率的细胞内分子传递体系。利用LPEI作为载体包裹pDNA并压缩其体积,形成pDNA/LPEI复合粒子;利用GNPL作为光热表面,在近红外光照射下升高表面温度从而增强细胞膜的通透性,促进溶液中的复合粒子进入细胞。同时,LPEI可以有效保护进入到细胞内的pDNA不易被核酸酶降解。具体地,首先利用葡萄糖原位还原氯金酸的方法制备了一系列不同粗糙度的GNPL,考察了 GNPL粗糙度对于表面光热性质的影响;而后利用动态光散射仪和凝胶阻滞实验测试了 LPEI与pDNA以不同N/P比(以LPEI中的氮元素与pDNA中的磷元素来计算两者复合的摩尔比,简称N/P比)形成的pDNA/LPEI复合粒子的粒径、所带电荷量以及LPEI固定pDNA的能力;最后考察了将GNPL与LPEI结合后对难转染细胞的pDNA传递效果。实验结果表明:将优化后的GNPL和pDNA/LPEI复合粒子相结合所得到的GNPL/LPEI细胞内分子传递体系对难转染的小鼠胚胎成纤维细胞(mEFs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的转染效率分别达到88.5%和94.0%,远高于单独利用GNPL作为光热表面的分子传递效率。(2)结合光热材料聚多巴胺(PDA)和温度敏感性聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm),构建了一种通用性强、传递效率高、细胞活性损伤小、细胞收获率高的细胞内分子传递体系。利用PDA作为光热表面,在近红外光照射下升高表面温度从而增强细胞膜的通透性,促进溶液中的外源性分子进入细胞;利用PNIPAAm作为细胞释放层,降低环境温度改变材料表面浸润性,从而收获光热表面携带外源性分子的细胞。首先,利用多巴胺氧化聚合和自由基聚合反应获得了修饰有PDA沉积层和PNIPAAm聚合物层的光热表面(Au-PDA-PNIP),并利用椭圆偏振仪、扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、X射线光电子能谱(XPS)、热成像仪和水接触角仪对Au-PDA-PNIP的沉积层厚度、表面形貌、元素组成、光热效应和温度响应性亲疏水性变化进行了表征。而后选择右旋糖酐、牛血清白蛋白(BSA)和编码有绿色荧光蛋白的质粒DNA(pGFP)作为模型分子,选择Hela细胞、mEFs、HUVECs和小鼠树突状细胞(mDCs)作为模型细胞,进行体外细胞内分子传递实验,并通过降低环境温度收获传递了外源性分子的细胞并重新培养。最后,我们向HUVECs内传递了编码有绿色荧光蛋白和锌指蛋白类转录因子的功能性质粒DNA(pEGFP-ZNF580),并分别利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和划痕愈合实验表征ZNF580基因在HUVECs中的表达情况以及该基因表达对于内皮细胞迁移速率的影响。实验结果表明,该体系可以高效地向多种细胞系内传递多种不同尺寸的外源性分子,并可以无损地收获基材表面携带外源性分子的细胞。另外,该体系能够将功能性pEGFP-ZNF580高效传递进入HUVECs从而加快内皮细胞的迁移速度,进一步证明了其在实际应用中的潜在价值。综上所述,本课题以光热材料为基础,通过结合其他功能性材料,构建了两类基于光热表面的细胞内分子传递体系。在保持光热表面通用性强和细胞活性损伤小等优点的基础上,首先结合光热基材GNPL和基因转染载体LPEI,提高了基于GNPL的细胞内分子传递体系对难转染细胞的转染效率;进一步地,结合了光热基材PDA和温敏性聚合物PNIPAAm,提高了光热表面的细胞收获率,扩

关键词：细胞内分子传递破膜法细胞收获光热基材温敏性聚合物

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